1.本发明涉及食品工程领域，具体为一种提高水溶性富硒蛋白稳定性的方法及其产品与应用。


背景技术：

2.蛋白质和多糖是食品乳化体系中最重要的两类生物大分子，是影响食品结构和质构的主要因素。蛋白质因能在液液或气液界面上形成吸附层来降低界面张力而多在胶体体系中充当乳化剂，多糖则由于其良好的增稠和持水特性而常用做稳定剂。共价键结合的蛋白质与多糖形成接枝物，既保留了蛋白质的表面活性又具有多糖的亲水性能，与蛋白质多糖弱相互作用形成的混合物对比，对环境条件具有较高的适应性。
3.水溶性植物硒蛋白具有硒含量比例高、水溶性好、易于吸收等优点，但同时也存在稳定性差、易变质的缺点，因此，如何改善水溶性植物硒蛋白的稳定性是亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种提高水溶性富硒蛋白稳定性的方法及其产品与应用，其首先采用独特的提取工艺获取水溶性富硒蛋白，进一步对所述水溶性富硒蛋白进行采用超声处理以及脉冲电场辅助湿热处理，以获得稳定性优良的水溶性富硒蛋白-葡聚糖接枝产物。
5.为实现上述不会出现堵塞的目的，本发明提供如下技术方案：
6.提供了一种提高水溶性富硒蛋白稳定性的方法，其包括如下步骤：
7.s1、制备水溶性富硒蛋白以及质量分数为5-10％的水溶性富硒蛋白溶液；
8.s2、在所述水溶性富硒蛋白溶液中加入葡聚糖，且所述水溶性富硒蛋白与葡聚糖的质量比为1:1，以得到反应液，并调节反应液ph为7-9；
9.以及s3、依次所述反应液进行超声处理以及脉冲电场处理，以得到水溶性富硒蛋白-葡聚糖接枝产物。
10.优选的，步骤s1中，制备水溶性富硒蛋白的步骤包括：
11.s11、对富硒原料进行干燥、粉碎，过80目筛，得富硒原料粉；
12.s12、在搅拌器中按照料液比1：(15-20)(g/ml)加入所述富硒原料粉以及蒸馏水，于15-25℃、搅拌速度100-110r/min条件下提取2-3h；提取完毕后减压过滤，得到第一富硒蛋白提取液以及第一滤渣；
13.s13、在第一滤渣中加入其重量2-3倍的tris-hcl缓冲液进行匀浆，得到匀浆液；再在所述匀浆液中加入其体积15倍的所述tris-hcl缓冲液，于15-25℃条件下浸提24h；浸提后于5000-8000r/min条件下离心15-20min，得到第二富硒蛋白提取液以及第一沉淀物；
14.s14、在所述第一沉淀物中加入其重量2-3倍的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，并于300-500w、15-20℃条件下超声提取10-15min；超声提取完成后减压过滤，得到第三富硒蛋白提取液以及第二滤渣；
15.s15、合并所述第一富硒蛋白提取液、第二富硒蛋白提取液以及第三富硒蛋白提取液，以得到富硒蛋白提取液粗提液，并对所述富硒蛋白提取液粗提液进行浓缩，以获得富硒蛋白浓缩液；
16.s16、在所述富硒蛋白浓缩液中加入硫酸铵至其饱和度为95％，于4℃条件下静置10-12h，再于3000-5000r/min条件下离心10-15min，收集第二沉淀物；
17.s17、在所述第二沉淀物中加水，待其完全溶解后加入透析袋中，在蒸馏水中透析18-24h；透析袋的截留分子量为3000-5000da；
18.以及s18、将透析后的溶液进行冷冻干燥，以得到所述水溶性富硒蛋白。
19.优选的，所述搅拌器为磁力搅拌器。
20.优选的，步骤s15中，所述浓缩包括：将所述富硒蛋白提取液粗提液置于旋转蒸发仪中，并于50-55℃、0.12-0.15mpa条件下减压浓缩至原体积的12-15％。
21.优选的，步骤s3中，所述超声处理包括：将所述反应液置于超声水浴中，于水浴温度55-65℃、超声功率200w条件下进行超声处理，超声处理时间为20-30min。
22.优选的，步骤s3中，所述脉冲电场处理包括：采用频率1000hz、30kv的脉冲电场对所述反应液进行处理，且脉冲处理时间为1000-1500μs。
23.还提供一种通过上述方法制备得到的产品。
24.还提供一种上述产品在制备饮料中的应用，所述饮料通过上述产品与浓缩果汁/浓缩蔬菜汁调配而成。
25.还提供一种上述产品在制备口服液中的应用，所述口服液通过上述产品与浓缩酵素汁、低聚异麦芽糖、菊粉、抗性糊精、罗汉果糖苷调配而成。
26.优选的，按重量份计，权利要求7所述产品：浓缩酵素汁：低聚异麦芽糖：菊粉：抗性糊精：罗汉果糖苷＝1：(8-10)：(0.2-0.5)：(0.2-0.3)：(0.1-0.2)：(0.01-0.02)。
27.本发明主要采用多种富硒原料，首先采用独特的提取工艺对多种富硒原料进行处理，以获得产率高、纯度好的水溶性富硒蛋白富硒蛋白，进一步对所述水溶性富硒蛋白进行采用超声处理以及脉冲电场辅助湿热处理，以获得稳定性优良的水溶性富硒蛋白-葡聚糖接枝产物。
附图说明
28.图1为对比例1与本发明的接枝率；
29.图2为三种条件下糖基化样品的游离氨基酸含量；
30.图3为本发明糖基化修饰后的富硒蛋白在不同ph下的稳定性；
31.图4为本发明糖基化修饰后的富硒蛋白在不同温度下的稳定性。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.实施例1：
34.本实施例提供了一种提高水溶性富硒蛋白稳定性的方法，其包括如下步骤：
35.s1、制备水溶性富硒蛋白以及质量分数为5-10％的水溶性富硒蛋白溶液；
36.s2、在所述水溶性富硒蛋白溶液中加入葡聚糖，且所述水溶性富硒蛋白与葡聚糖的质量比为1:1，以得到反应液，并通过盐酸或氢氧化钠溶液调节反应液ph为7-9；
37.以及s3、依次所述反应液进行超声处理以及脉冲电场处理，以得到水溶性富硒蛋白-葡聚糖接枝产物；具体的，所述超声处理包括：将所述反应液置于超声水浴中，于水浴温度55-65℃(优选为60℃)、超声功率200w条件下进行超声处理，超声处理时间为20-30min(优选为25min)；所述脉冲电场处理包括：采用频率1000hz、30kv的脉冲电场对所述反应液进行处理，且脉冲处理时间为1000-1500μs(优选为1200μs)；
38.具体的，步骤s1中，制备水溶性富硒蛋白的步骤包括：
39.s11、对富硒原料进行干燥、粉碎，过80目筛，得富硒原料粉；本实施例中，所述富硒原料包括富硒平菇、富硒香菇、富硒大豆、富硒堇叶碎米荠，且按重量比计，富硒平菇：富硒香菇：富硒大豆：富硒堇叶碎米荠＝1:1:2：3，由此，可通过多种富硒植物原料提供丰富的富硒蛋白，同时上述各种富硒原料可以通过不同种类、不同含量的营养元素，如氨基酸、矿物质和维生素等，使得产品整体营养丰富、搭配合理；
40.s12、在搅拌器(优选为磁力搅拌器)中按照料液比1：(15-20)(为重量体积比m/v，具体为g/ml)(优选为1:18)加入所述富硒原料粉以及蒸馏水，于15-25℃(优选20℃)、搅拌速度100-110r/min条件下提取2-3h；提取完毕后减压过滤，得到第一富硒蛋白提取液以及第一滤渣；
41.s13、在第一滤渣中加入其重量2-3倍的tris-hcl缓冲液进行匀浆，得到匀浆液；再在所述匀浆液中加入其体积15倍的所述tris-hcl缓冲液，于15-25℃(优选20℃)条件下浸提24h；浸提后于5000-8000r/min条件下离心15-20min，得到第二富硒蛋白提取液以及第一沉淀物；其中，所述tris-hcl缓冲液含0.1-0.2mol/l nacl、ph＝7-8，且浓度为0.01-0.02mol/l；
42.s14、在所述第一沉淀物中加入其重量2-3倍的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，并于300-500w(优选为400w)、15-20℃条件下超声提取10-15min(优选为12min)；超声提取完成后减压过滤，得到第三富硒蛋白提取液以及第二滤渣；
43.s15、合并所述第一富硒蛋白提取液、第二富硒蛋白提取液以及第三富硒蛋白提取液，以得到富硒蛋白粗提液，并对所述富硒蛋白粗提液进行浓缩，以获得富硒蛋白浓缩液；其中，所述浓缩包括：将所述富硒蛋白粗提液置于旋转蒸发仪中，并于50-55℃(优选52℃)、0.12-0.15mpa条件下减压浓缩至原体积的12-15％(优选13％)；
44.s16、在所述富硒蛋白浓缩液中加入硫酸铵至其饱和度为95％，于4℃条件下静置10-12h，再于3000-5000r/min条件下离心10-15min，收集第二沉淀物；
45.s17、在所述第二沉淀物中加水，待其完全溶解后加入透析袋中，在蒸馏水中透析18-24h；透析袋的截留分子量为3000-5000da(优选为3500da)；
46.以及s18、将透析后的溶液进行冷冻干燥，以得到所述水溶性富硒蛋白。
47.实施例2：
48.本实施例提供了一种通过实施例1所述方法制备得到的产品.
49.实施例3：
50.本实施例提供了一种实施例2所述产品在制备饮料中的应用，所述饮料通过实施例2所述产品与浓缩果汁/浓缩蔬菜汁调配、灭菌、灌装等工艺制作而成。
51.实施例4：
52.本实施例提供了一种实施例2所述产品在制备口服液中的应用，所述口服液通过实施例2所述产品与浓缩酵素汁、低聚异麦芽糖、菊粉、抗性糊精、罗汉果糖苷调配、灭菌、灌装等工艺制作而成；且按重量份计，实施例2所述产品：浓缩酵素汁：低聚异麦芽糖：菊粉：抗性糊精：罗汉果糖苷＝1：(8-10)：(0.2-0.5)：(0.2-0.3)：(0.1-0.2)：(0.01-0.02)(优选为1:9:0.4:0.25:0.15:0.015)。
53.采用申请号为201410645462.9、“一种纯天然植物硒蛋白的制作方法”的专利申请中的方法制备获得对应的植物硒蛋白，以作为对比例1，将其与通过本发明中方法制备获得的水溶性富硒蛋白(以下均为“水溶性富硒蛋白”)进行检测，以获得富硒蛋白的纯度、产率和外观，其结果如表1所示。
54.表1富硒蛋白产率、纯度及外观
[0055] 产率(％)纯度(％)外观对比例158.47
±
1.3372.14
±
1.22淡黄色颗粒物、且杂质明显本发明84.49
±
1.1292.22
±
1.50白色粉状物、无明显杂质
[0056]
由此可以看出，本发明在制备水溶性富硒蛋白的过程中，采用水提+双重缓冲液+超声处理的方式制备浓缩液，然后对浓缩液进行盐析和透析，使得原料中的水溶性富硒蛋白可充分析出，且同时去除大部分的杂质，以此大幅提高水溶性富硒蛋白的产率、纯度及外观品质。
[0057]
以下对本发明中的制备方法以及水溶性富硒蛋白进行各项评价试验：
[0058]
1.糖基化修饰效果
[0059]
以常规湿热反应对水溶性富硒蛋白与葡聚糖进行糖基化修饰，其产物作为对比例2，以本发明实施例1中步骤s3中通过超声+脉冲电场处理对水溶性富硒蛋白与葡聚糖进行糖基化修饰，其产物以下为实施例1。
[0060]
通过接枝度和游离氨基酸含量来评价糖基化修饰的反应效果。
[0061]
1)接枝度
[0062]
采用tnbs法测定：取对比例2及实施例1产物样品液1ml，加入1m l 0.1％sds溶液配制成0.2％(w/v)的蛋白溶液，混合均匀。取0.4ml样品液，依次加入2ml的磷酸盐溶液(ph 8.2)和1ml 0.1％(w/v)tnbs试剂，混合均匀。50℃水浴锅中避光反应30min后加入2ml hcl(0.1mol/l)终止反应。室温下放置30min，以蒸馏水代替样品按上述相同过程处理作为空白调零，在340nm下测量吸光值，并计算反应60min时糖基化修饰所得接枝产物的接枝率，其结果如图1所示。
[0063]
从图1中可以看出，本发明实施例1在超声+脉冲电场辅助湿热法的条件下，反应60min时蛋白-葡聚糖接枝产物的接枝率达到21.8％，而对比例2仅为5.8％，其原因在于，本发明中采用超声+脉冲电场处理可使蛋白反应基团暴露，易于进行糖基化反应，利于糖接枝，由此可显著提高糖基化修饰的接枝率。
[0064]
2)游离氨基酸含量
[0065]
采用邻苯二醛法测定。分别测定超声处理、脉冲电场处理、超声协同脉冲电场处理
三种条件下糖基化样品的游离氨基酸含量，以未经糖基化接枝的富硒蛋白为对比例3。首先，将40mg领苯二醛溶于1ml甲醇中，然后依次加入25ml的10mm四硼酸钠、2.5ml20％十二烷基硫酸钠和100μl的β-巯基乙醇，最后，将溶液稀释至体积为50ml，形成邻苯二醛试剂。将4ml邻苯二醛试剂与200μl样品溶液(5mg/ml)混合，在37℃下水浴2min。测定在340nm处样品的吸光度值。采用一定浓度梯度的赖氨酸溶液绘制标准曲线，氨基酸含量测定结果如图2所示。
[0066]
美拉德反应的早期阶段，蛋白质中的赖氨酸和精氨酸在侧链上表现出游离氨基的形式，所以这两种氨基酸主要受到外界作用，即还原糖的羰基与它们发生糖基化反应使游离氨基含量发生变化。如图2所示，与未处理的富硒蛋白相比，经处理后的蛋白-葡糖糖接枝产物游离氨基酸含量显著降低，尤其是在超声协同脉冲电场处理后，游离氨基含量达到最低。超声由于具有机械传质、加热和空化等效应，能够使结构变得灵活松散，而脉冲电场的施加使得细胞壁破碎率提高，成分溶出率增加。在超声和脉冲电场的共同作用下，为接枝度反应提供了更多的游离氨基酸，从而促进糖基化反应。
[0067]
2.乳化稳定性的测定
[0068]
乳化稳定性的测定采用浊度法，将本发明的水溶性富硒蛋白(即图3中的富硒蛋白)及水溶性富硒蛋白-葡聚糖接枝产物(即图3中的糖基化修饰后的富硒蛋白)分别配制成1mg/ml的溶液，在试管中加入15ml的蛋白溶液和5ml大豆油，乳液经20000r/min高速分散仪处理1min，分别在0min和10min时迅速从试管底部取样50μl，用1mg/ml sds溶液稀释100倍，用紫外分光光度计于500nm处测定样品的吸光值，得乳化性指标(eai，2/g)和乳化性稳定性指标(esi，min)，其结果如图3所示。
[0069][0070][0071]
其中，df为稀释因子，df＝101；ρ为蛋白浓度，g/ml；φ为光程，φ＝0.01m；θ为油相所占的分数，θ＝0.25；a0为0min时样品的吸光值；a10为10min时样品的吸光值。
[0072]
从图3中可以看出，在不同ph条件下，水溶性富硒蛋白经过糖基化修饰后，其乳化稳定性均有明显改善，说明糖基化修饰可显著增强水溶性富硒蛋白在不同ph环境下的稳定性。
[0073]
3.热稳定性的测定
[0074]
将本发明的水溶性富硒蛋白(即图4中的富硒蛋白)及水溶性富硒蛋白-葡聚糖接枝产物(即图4中的糖基化修饰后的富硒蛋白)分别溶解于0.1mol/l磷酸缓冲液(ph 7.5)中制备成4mg/ml的样品溶液，然后在不同温度下(60～100℃)将样品溶液加热1h，冷却至室温后采用lowry法测定蛋白质含量，利用牛血清蛋白(bsa)做标准曲线，测定500nm处样品的吸光值。根据样品中蛋白质含量和溶液中蛋白质含量计算热稳定性，其结果如图4所示。
[0075]
从图4中可以看出，大于60℃时，糖基化修饰后的富硒蛋白的热稳定性明显好于富硒蛋白提取物，且几乎无变化，尤其是在100℃条件下，其热稳定性仍然接近80％，说明糖基化修饰可显著增强水溶性富硒蛋白在不同温度环境下的稳定性。
[0076]
4.富硒相关功效评价实验
[0077]
选用spf级icr小鼠40只(雌雄各半，体重18-22g)，基础饲料适应性喂养1周后,按体重均分5组，即空白组、本发明水溶性富硒蛋白-葡聚糖接枝产物高、中、低剂量组以及阳性对照组(即对比例1的植物硒蛋白)，每组10只，分笼饲养。高、中、低剂量组每天分别灌胃给予100μg/kg、75μg/kg、50μg/kg，空白组给予同等体积的蒸馏水，阳性对照组每天灌胃给予80μg/kg，各组均喂食基础饲料，自由饮水，每天记录摄食量,每周称量体重。喂食4周后，移至代谢笼进行3d代谢实验，收集粪便。
[0078]
饲料和样品经均匀混合过20目筛；粪便经马福炉500℃灰化24h，均消解，用原子荧光光谱法测定硒含量，并根据下列公式计算硒吸收率，其结果如表3所示。
[0079][0080]
表3小鼠对硒的吸收效果
[0081][0082]
由上表3可知，给予本发明高、中、低剂量的水溶性富硒蛋白-葡聚糖接枝产物后，小鼠粪便中的硒含量与空白组相比略有提升，表明小鼠吸收利用了大部分硒，只有少量硒未被吸收，其中低剂量组的效果最明显。说明本发明水溶性富硒蛋白-葡聚糖接枝产物可显著提高小鼠对硒的吸收率，发挥微量硒元素的保健功效，且高剂量组的效果最明显，其原因在于水溶性富硒蛋白-葡聚糖接枝产物可保证硒蛋白在不同环境下的稳定性，使其不易分解、失效。
[0083]
综上所述，本发明主要采用多种富硒原料，首先采用独特的提取工艺对多种富硒原料进行处理，以获得产率高、纯度好的水溶性富硒蛋白富硒蛋白，进一步对所述水溶性富硒蛋白进行采用超声处理以及脉冲电场辅助湿热处理，以获得稳定性优良的水溶性富硒蛋白-葡聚糖接枝产物。
[0084]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在
包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0085]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。