1.本发明涉及植物细胞工程技术领域，特别涉及一种普通油茶成熟胚通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的方法。


背景技术：

2.油茶是山茶属植物中种子含油率较高树种的统称，也是我国特有的木本油料树种，油茶与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料作物。茶油的不饱和脂肪酸含量高达90％，与橄榄油相似，但茶油的维生素e含量比橄榄油高一倍，并含有山茶甙等特定生理活性物质，具有极高的营养价值。同时，油茶林是良好的生态林，油茶也是农林业产业结构调整、精准扶贫的重要经济作物，发展油茶产业具有很高的经济效益、社会效益和生态效益。此外，我国食用油消费量巨大，目前自给率不足40％，严重影响了我国的粮油安全。发展油茶产业，开发山地空间，不仅不会出现与粮食争地的问题，还能提高国土资源使用效率，使国家粮油安全得到保障。
3.随着生产发展和社会需求的不断提高，生产上对油茶品种的产量、品质、抗性等提出越来越高的要求，这些问题的解决仅依靠传统育种手段已无法满足。截止目前，油茶组织培养方面取得了一定进展，但尚未建立以体细胞胚胎发生为基础的遗传转化技术体系，与油茶以体细胞胚胎发生方式获得植株再生效率低有关。
4.因此，有必要开发一种植株再生效率高的采用普通油茶成熟胚通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种普通油茶成熟胚通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的方法，从普通油茶北缘主要种植区域湖北麻城成熟油茶林中选取优良单株上茶果为材料，进行成熟胚的离体培养，建立了以体细胞胚胎发生方式的再生体系，达到胚性愈伤组织及胚状体分化率达25％以上，再生植株率达到40％以上，6个月内获得完整再生植株。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明提供了一种普通油茶成熟胚通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的方法，所述方法包括：
8.取10月中旬普通油茶成熟胚消毒作为外植体；
9.将所述外植体进行预培养，后继代于分化培养基上进行分化培养，获得胚性愈伤组织；其中，所述分化培养基添加了0.05～0.15mg/l 2,4-d+0.05～0.15mg/l kt；
10.将所述胚性愈伤组织转至胚状体发育及植株再生培养基上进行再生培养，获得具有明显子叶的胚状体；
11.将所述具有明显子叶的胚状体转至生根培养基进行生根培养，形成生根的完整植
株。
12.将所述生根的完整植株炼苗和驯化后移栽至栽培基质中培养。
13.进一步地，所述预培养所采用的培养基为不含激素的msb培养基。
14.进一步地，所述预培养时间为25～35d。
15.进一步地，所述分化培养基为添加了0.1mg/l 2,4-d+0.1mg/l kt的msb培养基。
16.进一步地，所述分化培养的时间为50～70d，中间继代1～2次。
17.进一步地，所述胚状体发育和植株再生的培养基为不含激素的msb培养基。
18.进一步地，所述再生培养的时间为50～70d，中间继代1～2次。
19.进一步地，所述生根培养基为不含激素的1/2msb培养基。
20.进一步地，所述生根培养的时间为25～35d。
21.进一步地，所述分化培养、所述再生培养和所述生根培养的条件均包括：28
±
1℃、2000-3000lux的恒温光照培养箱培养，光照时间为14～16h/d。
22.进一步地，所述取10月中旬普通油茶成熟胚消毒作为外植体，包括：
23.取10月中旬普通油茶成熟胚在3天内徒手剥去油茶果实果皮和种皮后，放在75％的酒精中表面消毒30s，再用0.1％的hgcl2种消毒10min，无菌水冲洗4-5次，获得无菌外植体。
24.进一步地，所述msb培养基具体组成如下：硝酸钾1.9g/l、硫酸铵1.65g/l、磷酸二氢钾0.17g/l、七水硫酸镁0.37g/l、二水氯化钙0.44g/l、四水硫酸锰22.3mg/l、硼酸6.2mg/l、七水硫酸锌8.6mg/l、碘化钾0.83mg/l、二水钼酸钠0.25mg/l、五水硫酸铜0.025mg/l、六水氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸钠37.3mg/l、七水硫酸亚铁27.8mg/l、甘氨酸2mg/l、烟酸1mg/l、盐酸硫胺素10mg/l、盐酸吡哆醇1mg/l、肌醇100mg/l。
25.所述预培养的培养基、所述分化培养基、所述胚状体发育及植株再生培养基、所述生根培养基的ph范围均为5.8～6.2，优选地，ph为6.0。
26.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
27.1、从普通油茶北缘主要种植区域湖北麻城成熟油茶林中选取优良单株上茶果为材料，进行成熟胚的离体培养，建立了以体细胞胚胎发生方式的再生体系，达到胚性愈伤组织及胚状体分化率达25％以上，再生植株率达到40％以上，6个月内获得完整再生植株。
28.2、本发明的组织培养对象为成熟胚，较幼胚取材方便，能够较好的满足组织培养需求。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
30.图1为油茶愈伤组织分化及胚状体发生结果图片；
31.图2为油茶胚状体发育及植株再生结果图片；其中图2a为胚状体发育及植株再生结果图片；2b为再生植株的生根培养结果图片；
32.图3为油茶再生植株的生根及驯化移栽；其中图3a为正常的再生植株结果图片；图
3b为移栽后的正常植株的结果图片。
具体实施方式
33.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
34.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
35.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
36.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
37.由于成熟胚，分化能力弱，再生植株率低，现有技术中通常不会采用成熟胚而是采用幼胚去获得再生植株；
38.但由于幼胚受发育时期限制且容易受消毒的影响，而成熟胚，较幼胚取材方便，能够较好的满足组织培养需求，因此迫切需要开发一种普通油茶成熟胚通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的方法；
39.根据本发明一种典型的实施方式，提供一种普通油茶成熟胚通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的方法，所述方法包括：
40.取10月中旬普通油茶成熟胚消毒作为外植体；
41.将所述外植体进行预培养，后继代于分化培养基上进行分化培养，获得胚性愈伤组织；其中，所述分化培养基添加了0.05～0.15mg/l 2,4-d+0.05～0.15mg/l kt；
42.将所述胚性愈伤组织转至胚状体发育及植株再生培养基上进行再生培养，获得具有明显子叶的胚状体；
43.将所述具有明显子叶的胚状体转至生根培养基进行生根培养，形成生根的完整植株。
44.将所述生根的完整植株炼苗和驯化后移栽至栽培基质中培养。
45.本发明以成熟胚作为外植体，依次通过分化培养、再生培养和生根培养，所述分化培养基添加了0.05～0.15mg/l 2,4-d+0.05～0.15mg/l kt；建立了以体细胞胚胎发生方式的再生体系，达到胚性愈伤组织及胚状体分化率达25％以上，再生植株率达到40％以上，6个月内获得完整再生植株。
46.上述技术方案中，2,4-d的浓度若小于0.05mg/l或大于0.15mg/l均不利于愈伤组织的形成。kt的浓度若小于0.05mg/l或大于0.15mg/l均不利于胚状体的分化。
47.下面将结合实施例、对比例及实验数据对本技术的一种普通油茶成熟胚通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的方法进行详细说明。
48.实施例1
49.本实施例提供的一种普通油茶成熟胚通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的方法，包括：
50.步骤s1、于10月中旬在湖北省麻城市顺河镇梅花山村成熟油茶林中选择优良单株
茶果，放置4℃冰箱保存，3天内完成消毒接种。在超净工作台无菌条件下，徒手剥去油茶果实果皮和种皮后，放在75％的酒精中表面消毒30秒，再用0.1％的hgcl2种消毒10分钟，无菌水冲洗4次。
51.步骤s2、在无菌条件下接种于预培养培养基上，每瓶接种2-3个成熟胚，将接种了成熟胚的三角瓶放入28℃的恒温培养箱中进行预培养，光照16小时/天，光照强度为2000lux。所述预培养时间为25～35d。所述预培养所采用的培养基为不含激素的msb培养基；
52.后将没有污染的成熟胚继代至分化培养基(msb培养基附0.1mg/l 2,4-d+0.1mg/l kt，ph调至5.8)进行分化调控。继代1次后，将出现胚性愈伤组织和胚状体的外植体，如图1所示；所述分化培养基为添加了0.1mg/l 2,4-d+0.1mg/l kt的msb培养基。
53.msb基本培养基组成为：硝酸钾1.9g/l、硫酸铵1.65g/l、磷酸二氢钾0.17g/l、七水硫酸镁0.37g/l、二水氯化钙0.44g/l、四水硫酸锰22.3mg/l、硼酸6.2mg/l、七水硫酸锌8.6mg/l、碘化钾0.83mg/l、二水钼酸钠0.25mg/l、五水硫酸铜0.025mg/l、六水氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸钠37.3mg/l、七水硫酸亚铁27.8mg/l、甘氨酸2mg/l、烟酸1mg/l、盐酸硫胺素10mg/l、盐酸吡哆醇1mg/l、肌醇100mg/l。附加3％(w/v)蔗糖，0.9％(w/v)琼脂。采用高压蒸汽灭菌、灭菌压力为1.2kg/cm2，温度为121℃，灭菌时间为15min。
54.步骤s3、将出现胚性愈伤组织和胚状体的外植体转入胚状体发育及植株再生培养基(不含激素的msb培养基，ph调至5.8)中继续培养。
55.步骤s4、获得明显子叶的胚状体(如图2所示)后，转至生根培养基(1/2msb，ph调至5.8)培养。6个月内可以获得完整再生植株，如图3所示；
56.步骤s5、经驯化后并转移至营养钵内继续生长。以上处理8瓶，每瓶接种3个胚，重复3次，继代周期为30d继代一次。
57.实施例2
58.本实施例提供的一种普通油茶成熟胚通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的方法，包括：
59.步骤s1、于10月中旬在湖北省麻城市顺河镇梅花山村成熟油茶林中选择优良单株茶果，放置4℃冰箱保存，3天内完成消毒接种。在超净工作台无菌条件下，徒手剥去油茶果实果皮和种皮后，放在75％的酒精中表面消毒30秒，再用0.1％的hgcl2种消毒10分钟，无菌水冲洗4次。
60.步骤s2、在无菌条件下接种于预培养培养基上，每瓶接种2-3个成熟胚，将接种了成熟胚的三角瓶放入28℃的恒温培养箱中进行预培养，光照16小时/天，光照强度为2000lux。所述预培养时间为25～35d。所述预培养所采用的培养基为不含激素的msb培养基；
61.后将没有污染的成熟胚继代至分化培养基(msb培养基附0.1mg/l 2,4-d+0.1mg/l kt，ph调至5.8)进行分化调控。继代1次后，将出现胚性愈伤组织和胚状体的外植体；所述分化培养基为添加了0.05mg/l 2,4-d+0.05mg/l kt的msb培养基。
62.msb基本培养基组成为：硝酸钾1.9g/l、硫酸铵1.65g/l、磷酸二氢钾0.17g/l、七水硫酸镁0.37g/l、二水氯化钙0.44g/l、四水硫酸锰22.3mg/l、硼酸6.2mg/l、七水硫酸锌8.6mg/l、碘化钾0.83mg/l、二水钼酸钠0.25mg/l、五水硫酸铜0.025mg/l、六水氯化钴
0.025mg/l、乙二胺四乙酸钠37.3mg/l、七水硫酸亚铁27.8mg/l、甘氨酸2mg/l、烟酸1mg/l、盐酸硫胺素10mg/l、盐酸吡哆醇1mg/l、肌醇100mg/l。附加3％(w/v)蔗糖，0.9％(w/v)琼脂。采用高压蒸汽灭菌、灭菌压力为1.2kg/cm2，温度为121℃，灭菌时间为15min。
63.步骤s3、将出现胚性愈伤组织和胚状体的外植体转入胚状体发育及植株再生培养基(不含激素的msb培养基，ph调至5.8)中继续培养。
64.步骤s4、获得明显子叶的胚状体后，转至生根培养基(1/2msb，ph调至5.8)培养。6个月内可以获得完整再生植株，
65.步骤s5、经驯化后并转移至营养钵内继续生长。以上处理8瓶，每瓶接种3个胚，重复3次，继代周期为30d继代一次。
66.实施例3
67.本实施例提供的一种普通油茶成熟胚通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的方法，包括：
68.步骤s1、于10月中旬在湖北省麻城市顺河镇梅花山村成熟油茶林中选择优良单株茶果，放置4℃冰箱保存，3天内完成消毒接种。在超净工作台无菌条件下，徒手剥去油茶果实果皮和种皮后，放在75％的酒精中表面消毒30秒，再用0.1％的hgcl2种消毒10分钟，无菌水冲洗4次。
69.步骤s2、在无菌条件下接种于预培养培养基上，每瓶接种2-3个成熟胚，将接种了成熟胚的三角瓶放入28℃的恒温培养箱中进行预培养，光照16小时/天，光照强度为2000lux。所述预培养时间为25～35d。所述预培养所采用的培养基为不含激素的msb培养基；
70.后将没有污染的成熟胚继代至分化培养基(msb培养基附0.1mg/l 2,4-d+0.1mg/l kt，ph调至5.8)进行分化调控。继代1次后，将出现胚性愈伤组织和胚状体的外植体；所述分化培养基为添加了0.15mg/l 2,4-d+0.15mg/l kt的msb培养基。
71.msb基本培养基组成为：硝酸钾1.9g/l、硫酸铵1.65g/l、磷酸二氢钾0.17g/l、七水硫酸镁0.37g/l、二水氯化钙0.44g/l、四水硫酸锰22.3mg/l、硼酸6.2mg/l、七水硫酸锌8.6mg/l、碘化钾0.83mg/l、二水钼酸钠0.25mg/l、五水硫酸铜0.025mg/l、六水氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸钠37.3mg/l、七水硫酸亚铁27.8mg/l、甘氨酸2mg/l、烟酸1mg/l、盐酸硫胺素10mg/l、盐酸吡哆醇1mg/l、肌醇100mg/l。附加3％(w/v)蔗糖，0.9％(w/v)琼脂。采用高压蒸汽灭菌、灭菌压力为1.2kg/cm2，温度为121℃，灭菌时间为15min。
72.步骤s3、将出现胚性愈伤组织和胚状体的外植体转入胚状体发育及植株再生培养基(不含激素的msb培养基，ph调至5.8)中继续培养。
73.步骤s4、获得明显子叶的胚状体后，转至生根培养基(1/2msb，ph调至5.8)培养。6个月内可以获得完整再生植株，
74.步骤s5、经驯化后并转移至营养钵内继续生长。以上处理8瓶，每瓶接种3个胚，重复3次，继代周期为30d继代一次。
75.对比例1
76.该对比例中，所述分化培养基为只添加了0.1mg/l的2,4-d的msb培养基，其余步骤均同实施例1。
77.对比例2
78.该对比例中，所述分化培养基为只添加了0.1mg/l kt的msb培养基，其余步骤均同实施例1。
79.对比例3
80.该对比例中，所述分化培养基2,4-d的浓度改为2mg/l，kt的浓度改为1mg/l，其余步骤均同实施例1。
81.实验例1
82.统计实施例1-3、以及对比例1-2中普通油茶成熟胚通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的结果如表1所示。其中，分化培养60天后统计胚性愈伤组织和胚状体分化率，分化调控培养60天后统计出胚率。
83.胚性愈伤组织及胚状体分化率(％)＝形成胚性愈伤组织和胚状体的成熟胚数/接种成熟胚数
×
100％；
84.再生植株率(％)＝再生植株数/接种成熟胚数
×
100％。
85.表1
[0086][0087]
由表1的数据可知，
[0088]
对比例1中，分化培养基为只添加了0.1mg/l的2,4-d的msb培养基，胚性愈伤组织及胚状体分化率较高，但未获得再生植株；
[0089]
对比例2中，分化培养基为只添加了0.1mg/l kt的msb培养基，胚性愈伤组织及胚状体分化率较低，且未获得再生植株；
[0090]
对比例3中2,4-d和kt的浓度均较高，胚性愈伤组织及胚状体分化率较高，但未获得再生植株；
[0091]
实施例1-实施例3中，普通油茶成熟胚的组织培养，0.1mg/l 2,4-d+0.1mg/l kt处理的胚性愈伤组织和胚状体分化率分别为25.22％-28.33％；再生植株率为41.26％-48.67％。
[0092]
以上结果表明本发明中的分化培养基中2,4-d和kt缺少任何一种，或者浓度不在本发明实施例的范围内，均不能达到较好的效果。
[0093]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0094]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优
选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0095]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。