一种六氟双酚af污染的秀丽线虫模型的构建方法及其检测方法
技术领域
1.本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种六氟双酚af污染的秀丽线虫模型的构建方法及其检测方法。


背景技术：

2.六氟双酚af(bisphenol af，bpaf)简称为双酚af，不是自然界中天然存在的物质，而是人类用于生产与加工合成的一种新型的含氟双酚类物质，进而逐步释放到环境中。bpaf是在工业上的应用相当广泛。bpaf作为主要的含氟中间体被用于聚碳酸酯塑料和环氧树脂的生产，也作为抗氧化剂用于制造聚氯乙烯塑料，用于制造高温复合材料、电子器件、可透气性渗透膜等酯类，也可应用于塑料光纤和导波管的制造、食品包装材料、医疗用具等领域。一旦产品老化或直接释放bpaf，bpaf就会通过环境进行传播。由于大量生产和广泛的应用，生态环境中双酚af的含量越来越高。在生产和使用双酚af的时候，有大量双酚af通过各种途径释放到大气、土壤、水域中，通过食物网的传播和富集，导致生物体内的双酚af含量增加。
3.双酚af作为双酚a的代替物出现在人们生活当中，由于双酚a目前已经被限制使用在食品包装材料和一些日常用品当中，由此导致双酚af的使用量在逐年增加。双酚af的化学性质稳定，蓄积性较强，人们已经在土壤、水体、积淀物中检测出bpaf，甚至在生物体内也检测到了bpaf的存在。有研究表明，双酚af对kng细胞产生的毒性不亚于双酚a，并且认为双酚a和双酚af在调节颗粒细胞生物学功能和卵巢卵泡发育过程中发挥不同的作用。因此，双酚af对环境和生物的影响急需引起重视。有医学研究发现，癌症、动脉粥样硬化、神经行为障碍、心脑血管疾病等都与双酚af有关。也有研究证明，双酚af在环境基质和食品容器中被检测出来，甚至在生物体内也检测到了双酚af的存在，双酚af对环境和生物的影响急需引起重视，尤其是低浓度的双酚af的暴露。
4.秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans，c.elegans)在科学研究中有许多优点，主要体现在生命周期短、基因组完整、发育定型、繁殖简单、体型小，成本低廉。作为最被普遍使用的模式生物，在生命科学及医学的发展中起着至关重要的作用。秀丽线虫的解剖结构简单，但它可以表现出大量的生物行为，包括运动、觅食、喂食、排便、产卵、幼虫形成、触觉、嗅觉、味觉和温度，以及一些复杂的行为，如雄性交配、社会行为、学习和记忆。这些优势让秀丽线虫逐渐发展成为环境毒理学、生物医学等各领域中的重要模式生物。秀丽隐杆线虫是第一个基因组完全测序的多细胞生物，目前该模型已被广泛用于评估遗传、发育和神经系统等方面。
5.目前，关于双酚af的研究，主要是通过体内试验和体外试验来进行的，对体内试验来说，受试对象主要集中于小鼠、大鼠和部分鱼类等，对受试生物进行染毒，研究双酚af对受试生物神经行为、运动行为、各种器官和生殖等的毒性效应，研究表明，双酚af在肝脏、肾脏和脂肪组织中的含量最高。对于体外试验，受试对象主要是离体细胞，包括人体红细胞、
人乳腺癌细胞等。jie gu等人研究表明双酚af对斑马鱼和人体心肌细胞能够诱导的产生心脏毒性；bpaf引起睾丸形态的改变，并且也会抑制睾丸的分化和后续发育，并有一定程度的雌性化作用，man cai等人认为bpaf对包括人类在内的脊椎动物的男性生殖系统存在潜在的风险；di wu等人的通过对小鼠进行研究，bpaf能够显著损害了血睾丸屏障的完整性和降低精子数量和质量，并严重损害小鼠精子dna，且呈剂量依赖性，这些也说明了双酚af对男性生育能力存在有害作用。
6.目前检测双酚af的方法已有报道，例如公开号为cn110646360a的专利一种双酚a、双酚s、双酚af浓度的测定方法，该方法仅仅是用来检测样品中的双酚af的浓度，且检测范围为1.8～8.4mg/l；公开号为cn110646408a的专利公开了一种基于增敏鲁米诺电化学发光信号检测双酚af的方法，用于检测水环境当中的双酚af的含量，但检测步骤繁琐，成本较高；公开号为cn110240553a的专利公开了一种碳同位素标记双酚af的制备方法，但未提及双酚af的检测方法。关于双酚a和双酚s的急性毒性、生殖毒性、神经毒性以及生态毒性等研究比较多，也有公开号为cn110967327a的专利一种定量检测双酚a的方法，用石墨烯-罗丹明对双酚a进行吸附，该方法用到了大量有机试剂，对吸附材料的制备过程也比较繁琐；公开号为cn110658280a的专利公开了基于磁性金属有机骨架复合材料检测双酚类化合物的方法，吸附材料制备耗时长，同时要通过高效液相色谱-紫外检测进性分析，成本较高。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种六氟双酚af污染的秀丽线虫模型的构建方法及其检测方法，通过建立低浓度条件下的秀丽线虫模型，用于解决在食品包装材料中双酚af的低浓度暴露的检测的技术难题，且具有成本低，操作简单，周期短的特点。
8.本发明提供了一种双酚af污染的秀丽线虫模型的构建方法，包括以下步骤：
9.1)将含梯度浓度的双酚af和体积浓度0.1％的乙醇的m9缓冲溶液分别与大肠杆菌菌液等体积混合，得到梯度混合液，分别取50μl所述梯度混合液涂布在ngm固体培养基上，得到系列梯度的双酚af污染培养基；
10.所述m9缓冲溶液中双酚af的浓度梯度为0、0.001μm、0.01μm、0.1μm、1μm、10μm或100μm；
11.2)将l1期的秀丽线虫幼虫重悬后涂布在每个梯度的双酚af污染培养基上培养至l4期，得到双酚af污染的秀丽线虫模型。
12.优选的，所述大肠杆菌菌液的活菌数为3～5
×
108cfu/ml。
13.优选的，所述l1期的秀丽线虫幼虫的获得方法，包括以下步骤：
14.a.将秀丽线虫接种至含大肠杆菌的ngm培养基上培养至产卵期，裂解后收集秀丽线虫虫卵；
15.b.将所述秀丽线虫虫卵在18～22℃条件下ngm固体培养基上过夜孵育，获得处于l1期的秀丽线虫幼虫。
16.优选的，所述含大肠杆菌的ngm培养基为每个直径9cm的培养皿上涂布200μl的大肠杆菌菌液；所述大肠杆菌菌液的活菌数为3～5
×
108cfu/ml。
17.本发明提供了所述构建方法构建得到的双酚af污染的秀丽线虫模型的检测方法，包括以下步骤：
18.将双酚af污染的秀丽线虫模型转移至含大肠杆菌的ngm培养基上培养，此时记为f0代，长至成年时期转移新的含大肠杆菌的ngm培养基上，以后每2天更换一次新的含大肠杆菌的ngm培养基，直至产卵结束；
19.培养期间，检测秀丽线虫的运动能力的指标、生长发育的指标、生殖系统的指标和抗氧化能力。
20.优选的，所述运动能力的指标包括头部摆动频率、身体弯曲频率和/或爬行速率。
21.优选的，所述生长发育的指标包括寿命、体长、体表面积和/或生长速率。
22.优选的，所述生殖系统的指标包括产卵量、子代数目和/或世代时间。
23.优选的，所述抗氧化能力包括ros水平、sod水平和/或细胞凋亡情况。
24.本发明提供的双酚af污染的秀丽线虫模型的构建方法，本发明设置系列梯度的双酚af污染培养基，其中双酚af的梯度浓度设置是依据秀丽线虫lc
50
的浓度及生活中的双酚af可能暴露的浓度而确定，为人们的食用安全提供理论依据和技术基础；同时采用秀丽线虫制备双酚af污染的动物模型，不仅原料获取广泛、生活周期短，有利于研究不同世代受双酚af的影响情况，能准确、全面的了解双酚af对动物的运动能力、生长发育情况、抗氧化能力及生殖系统方面的影响。因此，本发明提供的构建具有简单方便高效、对仪器的要求少和应用价值高的特点。
25.本发明提供的所述构建方法构建得到的双酚af污染的秀丽线虫模型的检测方法，通过测定秀丽线虫的基本指标，还测定针对线虫运动的指标(爬行速率)，针对线虫生长方面的指标(生长速率)以及抗氧化能力方面(sod指标)的测定，结果能准确全面的反应低浓度的双酚af污染对秀丽线虫的影响，从而客观映射出生活中低浓度的双酚af对动物乃至人类的生长发育、运动、生殖系统及抗氧化能力方面的影响。
附图说明
26.图1为不同低浓度下双酚af溶液对线虫头部摆动的影响；其中所有数据均表示为平均值
±
标准误差；*p《0.05，**p《0.01；
27.图2为不同低浓度下双酚af溶液对线虫身体弯曲的影响；其中所有数据均表示为平均值
±
标准误差；*p《0.05，**p《0.01；
28.图3为不同低浓度下双酚af溶液对线虫体长的影响；其中所有数据均表示为平均值
±
标准误差；*p《0.05，**p《0.01；
29.图4为不同低浓度下双酚af溶液对线虫子代数目的影响；其中所有数据均表示为平均值
±
标准误差；*p《0.05，**p《0.01；
30.图5为不同低浓度下双酚af溶液对线虫ros水平的检测；其中所有数据均表示为平均值
±
标准误差；*p《0.05，**p《0.01；
31.图6为不同低浓度下双酚af溶液对线虫sod值的检测，其中所有数据均表示为平均值
±
标准误差；*p《0.05，**p《0.01。
具体实施方式
32.本发明提供了一种双酚af污染的秀丽线虫模型的构建方法，包括以下步骤：
33.1)将含梯度浓度的双酚af和体积浓度0.1％的乙醇的m9缓冲溶液分别与大肠杆菌
菌液等体积混合，得到梯度混合液，分别取50μl所述梯度混合液涂布在ngm固体培养基上，得到系列梯度的双酚af污染培养基；
34.所述m9缓冲溶液中双酚af的浓度梯度为0、0.001μm、0.01μm、0.1μm、1μm、10μm或100μm；
35.2)将l1期的秀丽线虫幼虫重悬后涂布在每个梯度的双酚af污染培养基上培养至l4期，得到双酚af污染的秀丽线虫模型。
36.本发明优选先测定双酚af对秀丽线虫的lc
50
，根据lc
50
配制系列梯度的双酚af污染培养基，具体方法如下：
37.将处于l1期的秀丽线虫幼虫接种至含大肠杆菌的ngm培养基中培养48小时后得到l4期秀丽隐杆线虫；
38.挑取l4期线虫20只转移到含第一双酚af溶液的96孔板中，在20℃培养箱中暴毒24h后显微镜下计数。
39.在本发明中，所述l1期的秀丽线虫幼虫的获得方法，优选包括以下步骤：
40.a.将秀丽线虫接种至含大肠杆菌的ngm培养基上培养至产卵期，裂解后收集秀丽线虫虫卵；
41.b.将所述秀丽线虫虫卵在18～22℃条件下ngm固体培养基上过夜孵育，获得处于l1期的秀丽线虫幼虫。
42.在本发明中，所述含大肠杆菌的ngm培养基优选为每个直径9cm的培养皿上涂布200μl的大肠杆菌菌液；所述大肠杆菌菌液的活菌数优选为3～5
×
108cfu/ml，更优选为4
×
108cfu/ml。
43.在本发明中，所述裂解用溶液是将m9缓冲液、naclo与1m naoh按照体积质量体积比为2：1：2混合得到。所述m9缓冲液的制备方法优选如下：每1l水中包含以下含量的组分：3g kh2po4，6g na2hpo4，5g nacl，1ml 1m mgso4，将上述组分全部溶解后在121℃灭菌30min。所述收集方法，优选用裂解用溶液冲洗产卵期的秀丽线虫后，收集液体，离心，得到的沉淀为秀丽线虫虫卵。
44.在本发明中，所述第一双酚af溶液中双酚af浓度梯度依次为0.1mm、0.25mm、0.5mm或0.75mm，还包括乙醇；乙醇的终浓度为0.1％。96孔板中每个孔添加的第一双酚af溶液的体积为200μl。lc
50
的计算是将线虫的死亡数目输入软件中，在spss软件当中获得。
45.根据lc
50
结果，确定双酚af的梯度浓度，配制系列梯度的双酚af污染培养基，具体将含浓度梯度的双酚af和体积浓度0.1％的乙醇的m9缓冲溶液分别与大肠杆菌菌液等体积混合，得到梯度混合液，分别取50μl所述梯度混合液涂布在ngm固体培养基上，得到系列梯度的双酚af污染培养基。所述m9缓冲溶液中双酚af的浓度梯度为0、0.001μm、0.01μm、0.1μm、1μm、10μm或100μm，根据浓度由低至高分别标记为a，b，c，d，e，f，g，每个浓度设置3个平行，依次记为a1-a3，b1-b3，c1-c3，d1-d3，e1-e3，f1-f3和g1-g3。所述大肠杆菌菌液的活菌数优选为3～5
×
108cfu/ml，更优选为4
×
108cfu/ml。大肠杆菌涂布的目的是喂养秀丽线虫，即大肠杆菌是秀丽线虫的食物。本发明对所述大肠杆菌的菌株种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的大肠杆菌的菌株种类即可。所述m9缓冲溶液的制备方法优选如下：每1l水中包含以下含量的组分：3g kh2po4，6g na2hpo4，5g nacl，1ml 1m mgso4，将上述组分全部溶解后在121℃灭菌30min。
46.得到系列梯度的双酚af污染培养基后，本发明将l1期的秀丽线虫幼虫重悬后涂布在每个梯度的双酚af污染培养基上培养至l4期，得到双酚af污染的秀丽线虫模型。
47.在本发明中，所述l1期的秀丽线虫幼虫的获得方法与上述记载的l1期的秀丽线虫幼虫的获得方法一致，在此不做赘述。每批线虫在每个梯度的双酚af中是平均分配的，每个梯度的双酚af污染培养基中暴露的线虫数量不少于3000条。培养至l4期的时间优选为48h。
48.本发明提供了所述构建方法构建得到的双酚af污染的秀丽线虫模型的检测方法，包括以下步骤：
49.将双酚af污染的秀丽线虫模型转移至含大肠杆菌的ngm培养基上培养，此时记为f0代，长至成年时期转移新的含大肠杆菌的ngm培养基上，以后每2天更换一次新的含大肠杆菌的ngm培养基，直至产卵结束；培养期间，检测秀丽线虫的运动能力的指标、生长发育的指标、生殖系统的指标和抗氧化能力。
50.在本发明中，所述运动能力的指标优选包括头部摆动频率、身体弯曲频率和/或爬行速率。
51.所述生长发育的指标优选包括寿命、体长、体表面积和/或生长速率。
52.所述生殖系统的指标优选包括产卵量、子代数目和/或世代时间。
53.所述抗氧化能力优选包括ros水平、sod水平和/或细胞凋亡情况。
54.本发明提供的方法适用于所有种类的秀丽线虫，为了举例说明具体的构建方法及检测方法，本发明实施例中以秀丽隐杆线虫为例加以说明。
55.结果表明，双酚af对秀丽线虫的运动、生殖系统的均存在负面影响。这说明日常生活中所能接触的低浓度的双酚af可以减弱秀丽线虫的运动行为，能够减少子代数量，线虫的生长发育受到抑制，对生殖能力具有一定的损伤，也能引起不同程度的氧化损伤。根据这些指标得出结论，认为双酚af在环境中低浓度的暴露对秀丽线虫存在负面影响，其安全性必须得到人们的重视。
56.下面结合实施例对本发明提供的一种六氟双酚af污染的秀丽线虫模型的构建方法及其检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
57.试验所用试剂的配制
58.ngm(nematode growth medium,ngm)固体培养基：于1l烧杯中准确称取3g nacl、2.5g蛋白胨，加去离子水1l溶解，之后分装到250ml锥形瓶中，每瓶加入5g琼脂粉。充分搅拌后封口121℃灭菌20min(分装后加入琼脂的目的是使溶解性相对较差的琼脂粉均匀地分到4个锥形瓶中，使各瓶成分保持一致)。灭菌后的ngm培养基冷却至60℃左右，无菌条件下每瓶加入1m的cacl2溶液、1m的mgso4溶液、胆固醇溶液(5mg/ml，无水乙醇配制)各0.25ml，1m磷酸钾缓冲液(ph值6.0)6.25ml，混匀之后使用。
59.m9缓冲液：准确称取3g kh2po4，6g na2hpo4，5g nacl，1ml 1m mgso4，加去离子水1l，待全部溶解后在121℃灭菌30min。
60.秀丽线虫裂解液：将m9缓冲液、naclo与1m naoh按照2：1：2(v:m：v)的比例混合，用于裂解产卵期线虫获得虫卵。
61.第一双酚af溶液的配制：用无水乙醇配制1mm的双酚af母液，用移液枪从母液中吸取一定量的双酚af，加入m9溶解，得到稀释的双酚af的浓度梯度为0.1mm、0.25mm、0.5mm、0.75mm，乙醇的终浓度为0.1％。
62.第二双酚af溶液的配制：通过测定秀丽线虫暴露于第一双酚af溶液24h的线虫的存活率，经数据分析得到在该条件下的双酚af对秀丽隐杆线虫的lc
50
(24h)，基于此数据以及双酚af在生活中的可能的暴露情况，设置更低浓度的双酚af溶液，其浓度梯度为0、0.001、0.01、0.1、1、10、100μm，所述第二双酚af溶液是用含有0.1％乙醇的m9缓冲液进行稀释获得，使得其乙醇含量均为0.1％。
63.实施例1
64.1.制备9cm的含大肠杆菌的ngm培养基用于扩大培养秀丽线虫：将灭菌后的ngm固体培养基等量倒入9cm培养皿当中，待其冷却凝固后即为空白ngm培养基，表面涂布200μl活菌数为4
×
108cfu/ml的e.coli菌液。
65.2.快速获得处于同一时期的秀丽线虫：将处于产卵期的秀丽隐杆线虫用m9缓冲液从含大肠杆菌的ngm培养基上冲洗下来，自然沉降，弃去上清液获得秀丽隐杆线虫沉淀，用m9缓冲液清洗三次，除去多余的e.coli后与秀丽线虫卵裂解液混合，快速震荡3min获得秀丽隐杆线虫虫卵，用m9清洗三次除去裂解液，置于直径3.5cm含ngm培养基的培养皿中20℃条件下过夜孵育，获得处于l1期的秀丽隐杆线虫幼虫。
66.3.根据第一双酚af溶液对秀丽线虫存活率的影响，测定lc
50
：将步骤2获得的处于l1期的秀丽隐杆线虫幼虫，转移至含大肠杆菌的ngm培养基中继续培养48小时后得到l4期秀丽隐杆线虫，在96孔板中分别加入200μl不同浓度的第一双酚af溶液，从含大肠杆菌的ngm培养基中挑取l4期线虫20只转移到含有第一双酚af溶液的96孔板中，在20℃培养箱中暴毒24h后显微镜下计数。
67.4.制备3.5cm的梯度秀丽线虫污染ngm培养基：将空白的ngm培养基等分为七组，将第二双酚af溶液和e.coli菌液按照体积比1：1的比例混合均匀，每组空白ngm培养基表面涂布对应浓度的混合液50μl。每组根据浓度由低至高分别标记为a，b，c，d，e，f，g。
68.5.将步骤2获得的处于l1期的秀丽隐杆线虫幼虫，等量接种到秀丽线虫污染ngm培养基中，每组平行取三个板，分别标记为a1-a3，b1-b3，c1-c3，d1-d3，e1-e3，f1-f3，g1-g3。
69.6.将a1-a3，b1-b3，c1-c3，d1-d3，e1-e3，f1-f3，g1-g3培养基上的秀丽线虫培养48h至l4期，检查每板上虫子的数量，用于后续线虫各项指标的测定。
70.7.从a1-a3，b1-b3，c1-c3，d1-d3，e1-e3，f1-f3，g1-g3上分别随机挑取虫子数目为10只(a1，b1，c1，d1，e1，f1，g1各10只；a2，b2，c2，d2，e2，f2，g2各10只；a3，b3，c3，d3，e3，f3，g3各10只)，将其转移至新的含大肠杆菌的ngm培养基中，此时的线虫标记为f0代。
71.8.f0代秀丽隐杆线虫长至成年时期，将每板的10只线虫转移到新的含大肠杆菌的ngm培养基上，以后每2天更换一次新的含大肠杆菌的ngm培养基，直至产卵结束。在此过程中也可以对其进行指标检测和记录：
72.(1)对a-f板上的影响线虫运动能力的指标进行测定：
73.a.头部摆动频率：记录在1min内秀丽隐杆线虫的头部从一侧摆向另一侧，再重新摆回这一侧的次数。
74.b.身体弯曲频率：记录在30s内秀丽隐杆线虫相对于自身体轴方向向前走过的一个波长的次数。
75.c.爬行速率：记录1min内秀丽隐杆线虫从计时起始位置到计时结束所爬行的s曲线的数量。
76.(2)对a-f板上的影响线虫生长发育的指标进行测定：
77.a.寿命：以线虫虫卵孵化记为生命起始的第一天(标记为0天)，以线虫死亡作为生命终结的最后一天(标记为第n天)。
78.b.体长：对l4期的秀丽隐杆线虫进行显微镜下拍照，记录其从头到尾部中轴线的长度。
79.c.体表面积：对l4期的秀丽隐杆线虫进行显微镜下拍照，记录线虫宽度和长度，计算得到线虫的体表面积。
80.d.生长速率：对暴露48h的秀丽线虫在显微镜下记录线虫的生长时期，并计算获得线虫的生长速率。
81.(3)对a-f板上的影响线虫生殖系统的指标进行测定：
82.a.每板挑10只线虫对其36小时产卵数目进行测定，对比不同低浓度双酚af对线虫产卵量的影响。
83.b.子代数目：记录整个产卵期所有卵的数目。
84.c.世代时间：l4线虫从第一个产卵期到下一个产卵期的时间间隔。
85.(4)对a-f板上的影响线虫的抗氧化能力进行测定：
86.a.ros水平：利用cm-h2dcfda荧光探针法来检测秀丽线虫体内的ros水平，用多功能酶标仪在激发波长为485nm和发射波长为535nm的条件下检测ros水平。
87.b.sod水平：每组至少获得约5000只秀丽隐杆线虫，m9清洗三遍以除去大肠杆菌。离心弃上清液，加入适量的m9缓冲液后进行超声破碎。再次离心吸取上层液体与购买的t-sod试剂盒相关试剂反应。操作严格按试剂盒说明书步骤执行。反应结束后在450nm波长处测量吸光值。
88.c.细胞凋亡情况：在显微镜下对l4期的线虫进行荧光拍照，从而计算其荧光强度了解细胞凋亡的情况。
89.按照所述检测线虫的各项指标的检测方法检测f1-f3代的各项相关的生理指标，并进行分析。具体实施步骤如下：
90.上述a-f板上的成虫到产卵期时分别转移到对应的新的梯度秀丽线虫污染ngm培养基上产卵1h后放回原板，此次产卵的批次板标记为f1代，培养至l4期后继续进行各指标的测定并进行数据及分析，计算f1代的受影响程度。
91.f1代生长到产卵期时再次转移至对应的新的梯度秀丽线虫污染ngm培养基上产卵1h放回f1代板，新产卵的批次板标记为f2代，培养至l4期后继续测定各个指标进行数据及分析，计算f2代的受影响程度。
92.f2代生长到产卵期时再次转移至对应的新的梯度秀丽线虫污染ngm培养基上产卵1h放回f2代板，新产卵的批次板标记为f3代，培养至l4期后继续测定各个指标并进行数据分析，计算f3代的受影响程度。
93.9.所有数据均以平均值
±
标准误差(mean
±
sem)的形式表示，采用graphpadprimer7进行绘图，利用spss19.0进行显著性分析，显著性水平设定为*p《0.05和**p《0.01。
94.三、检测结果分析
95.1.根据表1的结果，通过数据处理得到模拟方程为probit(p)＝-1.486+1.745x，计
算获得双酚af对秀丽线虫的lc
50
为382.63mg/l，此数据表明双酚af的安全性应该引起警惕。
96.表1双酚af对秀丽隐杆线虫lc
50
的数据
[0097][0098]
2.基于上述数据结果，测定更低双酚af暴露浓度下秀丽隐杆线虫的各项指标，结果示例如下：
[0099]
1)通过对秀丽隐杆线虫运动行为的检测，发现在双酚af浓度为1μm时，对秀丽隐杆线虫的运动行为指标(头部摆动频率、身体弯曲频率)都有不同程度的抑制，尤其不同浓度的双酚af的对秀丽隐杆线虫的头部摆动的抑制最为显著，结果如图1和图2所示。
[0100]
2)双酚af还会影响秀丽隐杆线虫的生长发育，图3为对秀丽隐杆线虫的体长的测定结果。结果显示，随着双酚af的浓度增加线虫的体长显著性减少，尤其当浓度双酚af浓度为100μm时，与对照组相比，秀丽隐杆线虫的体长下降了5.98％。这表明双酚af能够显著影响秀丽隐杆线虫的生长发育。
[0101]
3)双酚af对秀丽线虫的子代数目也有显著的抑制作用，从图4中知道当双酚af的浓度达到100μm，相比于对照组线虫的子代数目下降了25.2％，这表明双酚af对秀丽隐杆线虫的生殖系统产生了负面的影响，而且影响较为显著。
[0102]
4)双酚af对秀丽线虫抗氧化系统的影响如图5和图6所示，在浓度分别为0.1μm和10μm，双酚af能够使秀丽隐杆线虫的ros水平显著升高、sod水平显著降低。在浓度为100μm时，sod水平受抑制显著，相比于对照组下降了28.8％。在本次对线虫生化指标的研究中，sod与ros的研究结果相互印证，说明了双酚af能够引起秀丽线虫的氧化损伤。
[0103]
综上可知，日常生活中所能接触的低浓度的双酚af可以减弱秀丽线虫的运动行为，能够减少子代数量，线虫的生长发育受到抑制，对生殖能力具有一定的损伤，也能引起不同程度的氧化损伤。根据这些指标得出结论，认为双酚af在环境中低浓度的暴露对秀丽线虫存在负面影响，其安全性必须得到人们的重视。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。