1.本发明属于生物医学复合材料技术领域，具体涉及一种可介导神经化的骨修复支架材料及其制备方法、应用。


背景技术：

2.骨与神经的生长发育阶段具有一致性，神经以特定的形式延伸到骨发育中，形成“神经-骨”的结构。在成熟的骨中，骨与神经紧密结合。骨损伤后，骨组织中的神经纤维分泌神经肽促进骨的修复，在骨不连和骨缺损延迟愈合的临床案例中发现，骨痂中几乎没有神经纤维。这说明骨缺损部位的神经化可以显著促进骨修复的过程，而骨缺损部位的神经化直接影响到患者运动能力的恢复和生活质量，是衡量骨修复效果的重要参考。
3.神经化过程的主要目的是促进神经的生长，神经营养因子(neurotrophic factor,ntf)可以介导神经化过程，如神经生长因子(nerve growth factor,ngf)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,bdnf)可促进神经干细胞分化为神经元，促进神经干细胞分化的神经元轴突数量的增加，具有明显的促神经再生的作用。现有研究证实，ngf具有潜在的神经修复能力，可促进骨缺损的神经发生及血管生成，还可扩大感觉神经分布从而促进长骨发育，对原发性和继发性骨化至关重要。临床中，骨缺损部位持续应用ngf治疗可提高骨修复率和疗效，增强皮质内骨重塑活动，ngf的添加可达到促进种植体周围新骨的形成，促进骨小梁的成熟，缩短骨修复时间等效果。bdnf具有骨和神经保护作用，在体内外均促进hbmscs成骨和神经发生，提示bdnf可能通过促进神经发生间接促进成骨。因此，促进神经化不仅能促进感觉的恢复，而且可以进一步促进骨缺损的修复过程。目前已有相关的研究，例如中国专利申请号cn202010594528.1公开一种骨修复支架材料及其制备方法和应用，该骨修复支架材料呈纤维状支架结构，所述骨修复支架材料由负载有oob融合蛋白的掺镁介孔生物活性玻璃组成；所述oob融合蛋白由ocn、opn以及bgn连接而成；该制备方法包括制备掺镁介孔生物活性玻璃、获得oob融合蛋白、负载以及静电纺丝；所述的骨修复支架材料的骨修复性能优异，且可为骨修复过程提供长效的供给；所述的的制备方法可成功制备获得包含ocn、opn以及bgn三种蛋白的骨修复支架材料，该骨修复支架材料可应用于临床骨缺损修复中。
4.骨基质在结构上为纳米纤维状网格，为成骨细胞增殖、分化、骨基质矿化提供有利的结构。静电纺丝以聚合物溶液或熔体在强电场中进行喷射纺丝，可以制备出纳米级纤维网格支架，实现对骨基质结构的高度拟合。静电纺丝制备的支架具有独特的微观结构和适当的力学性能，可以模拟天然骨基质的编织状的网格结构促进骨修复。
5.因此，静电纺丝工艺制备的骨修复支架材料可以拟合骨基质中的纳米纤维网格结构，为骨缺损部位的细胞提供适合的微环境，提高骨修复效果。同轴静电纺丝作为双来源的纺丝体系，可以将多种需求融合在一个支架材料中，为神经化的骨缺损修复材料的制备提供保障。


技术实现要素：

6.针对现有技术中骨修复材料仅仅修复骨缺损，没有对神经一同进行修复，导致修复后修复部位没有感觉，最终影响患者的生活质量的问题，本发明提供了一种可介导神经化的骨修复支架材料及其制备方法、应用，本发明所述的一种可介导神经化的骨修复支架材料能够实现对骨基质支架结构的模拟作用，从而为骨缺损修复中成骨化、神经化提供合适的微环境，促进骨缺损的快速修复及感觉的恢复。
7.本发明所述的一种可介导神经化的骨修复支架材料的制备方法，以溶胶-凝胶及模板法合成了掺镁的介孔生物活性玻璃(mg-mbg)材料，将ocn-opn-bgn融合蛋白(oob融合蛋白)吸附于mg-mbg材料中，作为同轴静电纺丝的“核”进行纺丝，能够为骨修复过程提供长效的供给；神经营养因子(ntf)负载于采用煮沸法提取得到的丝素蛋白(sf)中，作为同轴静电纺丝的“壳”进行纺丝，能够为骨修复过程中的神经化提供支撑和供给；因此，具有成骨化的“核”和神经化的“壳”的可介导神经化的骨修复支架材料为骨缺损的成骨化及神经化提供了支架结构，促进了骨修复及神经化过程。
8.本发明的目的通过以下技术方案来实现：
9.一种可介导神经化的骨修复支架材料的制备方法，包括以下步骤：
10.1)将在体外异源表达的ocn-opn-bgn融合蛋白(oob融合蛋白)与掺镁的介孔生物活性玻璃(mg-mbg)，按照(100-300)g:20mg的比例，进行混合搅拌后，置于4℃冰箱静置吸附，12,000rpm离心5min，取沉淀，得到负载oob融合蛋白的mg-mbg材料(oob@mg-mbg)；
11.2)按照(3-8)g:(2.2-4.4)g/l的比例，将蚕茧通过na2co3水溶液煮沸进行脱胶后，烘干，通过7-10m的溴化锂溶液得到溶解后的丝素蛋白；
12.将溶解后的丝素蛋白通过去离子水进行透析后，通过5-20％的分子量10000的peg溶液进行浓缩；
13.最后将浓缩后的丝素蛋白通过4℃，7000-12000rpm离心2次，每次20min，去除杂质，最终得到丝素蛋白原溶液；
14.3)将神经营养因子(ntf)与丝素蛋白(sf)溶液，按照(5-8)μg:(10-30)mg的比例，进行混合搅拌后，置于4℃冰箱静置吸附，12,000rpm离心5min，取沉淀，得到负载ntf的sf材料(ntf@sf)；
15.4)将聚ε己内酯(pcl)置于六氟异丙醇溶液中，按照(4-6)g:50ml的比例，磁力搅拌至溶液完全澄清，得到纺丝溶液；
16.将步骤1)得到的负载oob融合蛋白的mg-mbg材料(oob@mg-mbg)和步骤3)得到的负载ntf的sf材料(ntf@sf)，分别按照5-15mg/ml加入到纺丝溶液中，将负载oob融合蛋白的mg-mbg材料(oob@mg-mbg)作为内核，负载ntf的sf材料(ntf@sf)作为外壳，通过搅拌、超声使得溶液充分混匀，在18-22kv的高压直流电场下，通过数字注射泵，控制速度在0.60-0.85ml/h，温度为20-25℃，相对湿度为30-60％，进行静电纺丝，得到一种可介导神经化的骨修复支架材料。
17.本发明中：
18.步骤1)所述的搅拌，时间是1-2h；所述的静置吸附，时间是24-48h。
19.步骤2)所述的烘干，是置于40-80℃的烘箱中；所述的通过7-10m的溴化锂溶液得到溶解后的丝素蛋白，是通过7-10m的溴化锂溶液在40-80℃的烘箱中使其完全溶解得到溶
解后的丝素蛋白；所述的浓缩，时间是12-60小时。
20.步骤3)所述的搅拌，时间是1-2h；所述的静置吸附，时间是24-48h。
21.步骤4)中，是通过数字注射泵，控制速度在0.70ml/h，温度为25℃，相对湿度为44％，进行静电纺丝。
22.本发明还涉及一种可介导神经化的骨修复支架材料，采用上述一种可介导神经化的骨修复支架材料的制备方法得到。
23.本发明所述的一种可介导神经化的骨修复支架材料，不仅可以促进成骨过程，而且负载ntf的sf可以促进神经化的过程，在骨缺损的修复过程中具有广阔的应用前景。
24.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
25.1、本发明所述的一种可介导神经化的骨修复支架材料的制备方法，将异源表达的骨基质融合蛋白吸附到通过溶胶-凝胶和模板自组装的方法，制备得到的钙镁掺杂的介孔生物活性玻璃中作为内核，将促进神经生长的神经生长因子负载到蚕丝蛋白中作为外壳，再通过同轴静电纺丝技术制备出具有核壳结构的可介导神经化的骨修复支架材料。相比于现有材料的针对骨修复中只是修复骨组织具有明显的优势，本发明将骨与神经同时进行修复，而修复的神经还可以进一步促进骨组织的修复，从而加快骨修复的节奏。其次，现有的材料针对骨修复是将骨组织部位的血管化进行修复，从而促进骨修复过程，但是现有的材料不能解决修复好的骨组织部位恢复知觉的问题，而采用本发明所述的一种可介导神经化的骨修复支架材料能够进行双修复，即骨修复及神经化修复。
26.2、本发明得到的一种可介导神经化的骨修复支架材料，具有很好的细胞相容性、成骨活性、成神经活性及促进钙沉积的作用，能够促进骨髓间充质干细胞向成骨方向的增殖、分化以及矿化过程，也可以促进神经元的存活过程，作为骨修复材料在骨缺损修复及恢复损伤部位的知觉的临床应用中具有广阔的前景。
27.3、本发明得到的一种可介导神经化的骨修复支架材料，具有纳米纤维状的纤维结构，这种结构为细胞的增殖、分化及矿化过程提供微环境，实现对骨基质结构的高度拟合，从而可以促进骨修复的过程，也可以促进神经细胞沿纳米纤维线进行生长，从而也达到神经修复的目的。
附图说明
28.图1为实施例1得到的一种可介导神经化的骨修复支架材料通过扫描电子显微镜得到的微观表面结构的图；
29.图2是实施例1中的mg-mbg、oob@mg-mbg及可介导神经化的骨修复支架在模拟人体体液的液体(sbf)(142.0mm na
+
，5.0mm k
+
，1.5mm mg
2+
，2.5mm ca
2+
，103.0mm cl-，27.0mm hco
3-，1.0mm hpo
42-，0.5mm so
42-)中测试体外矿化的程度，采用扫描电子显微镜的图；
30.图3是实施例1中的mg-mbg、oob@mg-mbg及可介导神经化的骨修复支架材料对骨髓间充质干细胞的增殖能力通过cell counting kit-8(cck-8)进行测定，在酶标仪450nm的波长下读取吸光度值的图；
31.图4是实施例1中的mg-mbg、oob@mg-mbg及可介导神经化的骨修复支架材料对骨髓间充质干细胞的分化能力通过检测细胞分化的前期指标碱性磷酸酶的活性进行测定的图；
32.图5是实施例1中的mg-mbg、oob@mg-mbg及可介导神经化的骨修复支架材料对骨髓
间充质干细胞的矿化能力通过茜素红染矿化结节进行测定的图；
33.图6是实施例1中的mg-mbg、oob@mg-mbg及可介导神经化的骨修复支架材料对骨髓间充质干细胞向神经方向分化的能力通过免疫荧光进行测定的图。
具体实施方式
34.以下通过实施例进一步详细描述本发明，但这些实施例不应认为是对本发明的限制。
35.实施例1：
36.一种可介导神经化的骨修复支架材料的制备方法，包括以下步骤：
37.1)将在体外异源表达的ocn-opn-bgn融合蛋白(oob融合蛋白)与掺镁的介孔生物活性玻璃(mg-mbg)，按照200g:20mg的比例，进行混合搅拌1h后，置于4℃冰箱静置吸附24h，12,000rpm离心5min，取沉淀，得到负载oob融合蛋白的mg-mbg材料(oob@mg-mbg)；
38.2)按照6g:2.2g/l的比例，将蚕茧通过na2co3水溶液煮沸进行脱胶后，置于50℃的烘箱中烘干，通过8m的溴化锂溶液在50℃的烘箱中使其完全溶解得到溶解后的丝素蛋白；
39.将溶解后的丝素蛋白通过去离子水进行透析后，通过10％的分子量10000的peg溶液进行浓缩60小时；
40.最后将浓缩后的丝素蛋白通过4℃，8000rpm离心2次，每次20min，去除杂质，最终得到丝素蛋白原溶液；
41.3)将神经营养因子(ntf)与丝素蛋白(sf)溶液，按照6μg:20mg的比例，进行混合搅拌1h后，置于4℃冰箱静置吸附24h，12,000rpm离心5min，取沉淀，得到负载ntf的sf材料(ntf@sf)；
42.4)将聚ε己内酯(pcl)置于六氟异丙醇溶液中，按照5g:50ml的比例，磁力搅拌至溶液完全澄清，得到纺丝溶液；
43.将步骤1)得到的oob@mg-mbg和步骤3)得到的ntf@sf，分别按照5-15mg/ml加入到纺丝溶液中，将oob@mg-mbg作为内核，ntf@sf作为外壳，通过搅拌、超声使得溶液充分混匀，在22kv的高压直流电场下，通过数字注射泵，控制速度在0.70ml/h，温度为25℃，相对湿度为44％，进行静电纺丝，得到一种可介导神经化的骨修复支架材料。
44.实施例2：
45.一种可介导神经化的骨修复支架材料的制备方法，包括以下步骤：
46.1)将在体外异源表达的ocn-opn-bgn融合蛋白(oob融合蛋白)与掺镁的介孔生物活性玻璃(mg-mbg)，按照100g:20mg的比例，进行混合搅拌2h后，置于4℃冰箱静置吸附48h，12,000rpm离心5min，取沉淀，得到负载oob融合蛋白的mg-mbg材料(oob@mg-mbg)；
47.2)按照3g:4.4g/l的比例，将蚕茧通过na2co3水溶液煮沸进行脱胶后，置于40℃的烘箱中烘干，通过10m的溴化锂溶液在40℃的烘箱中使其完全溶解得到溶解后的丝素蛋白；
48.将溶解后的丝素蛋白通过去离子水进行透析后，通过5％的分子量10000的peg溶液进行浓缩48小时；
49.最后将浓缩后的丝素蛋白通过4℃，7000rpm离心2次，每次20min，去除杂质，最终得到丝素蛋白原溶液；
50.3)将神经营养因子(ntf)与丝素蛋白(sf)溶液，按照5μg:10mg的比例，进行混合搅
拌2h后，置于4℃冰箱静置吸附48h，12,000rpm离心5min，取沉淀，得到负载ntf的sf材料(ntf@sf)；
51.4)将聚ε己内酯(pcl)置于六氟异丙醇溶液中，按照4g:50ml的比例，磁力搅拌至溶液完全澄清，得到纺丝溶液；
52.将步骤1)得到的oob@mg-mbg和步骤3)得到的ntf@sf，分别按照5-15mg/ml加入到纺丝溶液中，将oob@mg-mbg作为内核，ntf@sf作为外壳，通过搅拌、超声使得溶液充分混匀，在18kv的高压直流电场下，通过数字注射泵，控制速度在0.60ml/h，温度为20℃，相对湿度为60％，进行静电纺丝，得到一种可介导神经化的骨修复支架材料。
53.实施例3：
54.一种可介导神经化的骨修复支架材料的制备方法，包括以下步骤：
55.1)将在体外异源表达的ocn-opn-bgn融合蛋白(oob融合蛋白)与掺镁的介孔生物活性玻璃(mg-mbg)，按照300g:20mg的比例，进行混合搅拌1.5h后，置于4℃冰箱静置吸附32h，12,000rpm离心5min，取沉淀，得到负载oob融合蛋白的mg-mbg材料(oob@mg-mbg)；
56.2)按照8g:3.3g/l的比例，将蚕茧通过na2co3水溶液煮沸进行脱胶后，置于80℃的烘箱中烘干，通过7m的溴化锂溶液在80℃的烘箱中使其完全溶解得到溶解后的丝素蛋白；
57.将溶解后的丝素蛋白通过去离子水进行透析后，通过20％的分子量10000的peg溶液进行浓缩12小时；
58.最后将浓缩后的丝素蛋白通过4℃，12000rpm离心2次，每次20min，去除杂质，最终得到丝素蛋白原溶液；
59.3)将神经营养因子(ntf)与丝素蛋白(sf)溶液，按照8μg:30mg的比例，进行混合搅拌1.5h后，置于4℃冰箱静置吸附32h，12,000rpm离心5min，取沉淀，得到负载ntf的sf材料(ntf@sf)；
60.4)将聚ε己内酯(pcl)置于六氟异丙醇溶液中，按照6g:50ml的比例，磁力搅拌至溶液完全澄清，得到纺丝溶液；
61.将步骤1)得到的oob@mg-mbg和步骤3)得到的ntf@sf，分别按照5-15mg/ml加入到纺丝溶液中，将oob@mg-mbg作为内核，ntf@sf作为外壳，通过搅拌、超声使得溶液充分混匀，在20kv的高压直流电场下，通过数字注射泵，控制速度在0.85ml/h，温度为24℃，相对湿度为30％，进行静电纺丝，得到一种可介导神经化的骨修复支架材料。
62.实验例：
63.实施例1中得到的一种可介导神经化的骨修复支架材料的表征测量及结果：
64.图1为实施例1得到的一种可介导神经化的骨修复支架材料通过扫描电子显微镜得到的微观表面结构的图。
65.将mg-mbg、oob@mg-mbg及骨修复支架喷金30s，开启系统后，将待测样品放入样品室后关闭样品室抽真空进行观察，如图1显示，mg-mbg、oob@mg-mbg及可介导神经化的骨修复支架均具有均匀的支架结构。
66.图2是实施例1中的mg-mbg、oob@mg-mbg及可介导神经化的骨修复支架在模拟人体体液的液体(sbf)(142.0mm na
+
，5.0mm k
+
，1.5mm mg
2+
，2.5mm ca
2+
，103.0mm cl-，27.0mm hco
3-，1.0mm hpo
42-，0.5mm so
42-)中测试体外矿化的程度，采用扫描电子显微镜的图。
67.该实验的反应温度为37℃，在矿化后，采用扫描电子显微镜进行观察显示，oob@
mg-mbg及可介导神经化的骨修复支架比mg-mbg支架在体外矿化的多，这种矿化沉积的形态和钙沉积的形态相似，因此，可介导神经化的骨修复支架能在体外进行良好的矿化过程。
68.图3是实施例1中的mg-mbg、oob@mg-mbg及可介导神经化的骨修复支架材料对骨髓间充质干细胞的增殖能力通过cell counting kit-8(cck-8)进行测定，在酶标仪450nm的波长下读取吸光度值的图。
69.按照说明书所述，在测试前4小时根据培养液体积的10％加入cck-8，在细胞生长1、3、5及7天时在酶标仪的450nm的波长下读取吸光度值对其增殖进行测定，结果表明，可介导神经化的骨修复支架材料促进mc3t3-e1细胞的增殖。
70.图4是实施例1中的mg-mbg、oob@mg-mbg及可介导神经化的骨修复支架材料对骨髓间充质干细胞的分化能力通过检测细胞分化的前期指标碱性磷酸酶的活性进行测定的图。
71.在检测时，细胞分为两组分别进行检测，一组采用对硝基酚磷酸(pnpp)工作溶液(8mm pnpp，0.1％triton x-100，2mm mgcl2，0.1m na2co
3-nahco3缓冲液(ph10.3))，按照每孔100μl工作液加入细胞内，在37℃孵育30分钟后，通过酶标仪测定405nm的吸光度，另外一组采用基于二喹啉甲酸(bca)法测定细胞内蛋白浓度作为内参，按照说明书所述每孔加入200μl工作液并在37℃孵育30分钟后，通过酶标仪测定550nm的吸光度，根据公式计算碱性磷酸酶活性＝a
405
/a
550
。
72.结果显示(图4)，骨髓间充质干细胞培养在可介导神经化的骨修复支架中的碱性磷酸酶活性最高，oob@mg-mbg支架中次之，mg-mbg支架中最低；因此，可介导神经化的骨修复支架材料对成骨细胞的分化能力最强，oob@mg-mbg支架次之，mg-mbg支架最低。
73.图5是实施例1中的mg-mbg、oob@mg-mbg及可介导神经化的骨修复支架材料对骨髓间充质干细胞的矿化能力通过茜素红染矿化结节进行测定的图。
74.骨髓间充质干细胞以5
×
105个/毫升的密度种在支架材料中，并在支架材料中连续培养3天后换为矿化培养基(含10mm β-甘油磷酸钠，50μg/ml维生素c，10％fbs的αmem培养液)继续培养；在细胞培养的第14天进行矿化结节的测定，具体为通过75％的乙醇将细胞在室温固定10min后，茜素红工作液(ph4.2，40mm)37℃染矿化结节10min，再采用去离子水将多余的工作液洗净，干燥后拍照。结节数量越多，说明矿化效果越好。
75.结果如图5所示，可介导神经化的骨修复支架材料对骨髓间充质干细胞的矿化能力最大，oob@mg-mbg支架次之，mg-mbg支架最小。
76.图6是实施例1中的mg-mbg、oob@mg-mbg及可介导神经化的骨修复支架材料对骨髓间充质干细胞向神经方向分化的能力通过免疫荧光进行测定的图。
77.骨髓间充质干细胞分别在三种支架材料上经过诱导之后，采用甲醇:丙酮(1:1)室温固定30分钟后，通过10％马血清4℃封闭过夜，anti-nse及anti-gfap的抗体以1:100的比例进行稀释后对细胞4℃孵育过夜后，fitc及alexa fluor 594标记的二抗以1:100的比例进行稀释对细胞室温孵育2小时，4,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染细胞核5分钟后在具有紫外、蓝光和绿光激发波的显微镜(leica，德国)下观察神经细胞的种类、数量和形态。
78.结果如图6显示，可介导神经化的骨修复支架材料对神经元细胞，氨基修饰的生物活性玻璃其次，生物活性玻璃最次，说明氨基修饰的生物活性玻璃对成骨细胞的附着及伸展具有正向调节作用，氨基修饰的生物活性玻璃协同表皮生长因子后促进了成骨细胞的粘附。
79.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。