一种用于慢性治疗咳嗽的中药组合物及其制备方法与应用
(一)技术领域
1.本发明涉及中医制药技术领域，特别涉及一种用于治疗慢性咳嗽的中药组合物及其制备方法和应用。
(二)

背景技术：

2.大多数慢性咳嗽病程自限，或经治疗后很快消失，但相当一部分病人该症状持续存在，尤其是烟酒过度，经常熬夜以及日常用嗓过度的人群。在中医理论中，烟酒过度之人，特别是抽烟，烟草本身是一个火热之邪，长期抽烟，咽喉及肺部，除了浑浊之外，也会气阴耗伤，特别是肺阴耗伤，容易损伤肺部；经常熬夜之人存在肺阴耗伤，还包括心阴肝阴虚等；日常用嗓过度的人群，如主持人老师等，存在耗气伤阴的过程，因此本类人群容易口舌干燥、咽喉不适、咽喉痒、咽喉痛，存在干咳少痰，咳声短促，或痰中带血丝，低热，午后颧红，盗汗，口干，舌质红，少苔等症状。慢性咳嗽是指病程超过3周以上的咳嗽，咳嗽是唯一或主要的临床症状，患者既往无相应的慢性呼吸系统疾病病史，胸部体检和胸片都无异常发现，常规抗感染或镇咳治疗无效。由于病因不明或长期误诊，治疗上无针对性，患者经常反复就医，滥用抗生素、抗菌药物，或是止咳药物枸橼酸喷托维林，或是服用含有枇杷(具有润肺、止咳、健胃、清热的功效)成分等相关的中成药，或者因诊断不清而反复进行各种检查，不仅加重患者的身心负担和医疗花费，还影响患者的日常工作和生活质量，且效果不佳。
3.因此，针对该类人群，急需开发一种副作用小，口感佳，能够长期服用的中药组合物，该组合物该针对病因机理进行组方，从而达到预防和治疗的目的。
(三)

技术实现要素：

4.本发明目的是提供一种用于治疗慢性咳嗽的中药组合物及其制备方法与应用，本发明提出的中药组合物具有相对于枇杷提取物更好的清肺止咳效果，从而达到预防和治疗的目的，克服现有技术的缺陷。
5.本发明采用的技术方案是：
6.本发明提供一种用于治疗慢性咳嗽的中药组合物，所述中药组合物由下列重量份的原料制成：枇杷叶或枇杷果5-13份、桔梗1-5份、藏青果1-5份、干芦根10-20份、薄荷1-4份、甘草1-5份。
7.进一步，所述的中药组合物由下列重量份的原料制成：枇杷叶或枇杷果9份、桔梗3份、藏青果3份、干芦根15份、薄荷2份、甘草3份。
8.进一步，所述中药组合物为各原料的水提物。
9.本发明还提供一种所述中药组合物的制备方法，所述方法为：按配方量，各原料混合，加入水，浸泡加热至沸腾后煎煮1.5h，煎煮2次，合并提取液，获得所述中药组合物。所述水的质量用量为各原料总重量的5-20倍，优选10倍。所述提取液还可以浓缩去除部分水分，制成不同的剂型。
10.本发明所述中药组合物的给药量为1.5g/kg、3.0g/kg或6.0g/kg。
11.本发明所述中药组合物的剂型包括饮品，口服液，颗粒剂，胶囊剂，片剂，丸剂，或是散剂。
12.本发明还提供一种所述中药组合物在制备治疗慢性咳嗽药物中的应用，所述药物用于烟酒过度，经常熬夜以及用嗓过度的人群。
13.本发明的组合物药理药效：
14.通过分析烟酒过度，经常熬夜以及用嗓过度的人群的病机机理，根据药物的四性五味制定相应的处方以期达到相应的治疗目标。组合物中枇杷叶具有疏风散热，清肺止咳的功效，定为处方中的君药；桔梗和藏青果，具有清利咽喉的功效，而桔梗擅长宣肺止渴，藏青果擅长清喉开音，利咽开音，因此定为处方中的佐药；薄荷、芦根和甘草，薄荷和芦根药性偏凉，有很好的透肺弱热邪防热欲化火的作用，甘草具有调和药性，防止整个处方寒凉过度，而且甘草是入脾经，有一定的保护脾胃作用，因此定为处方中的使药；通过中医理论，所调配的处方中药组合物具有更好预防和治疗功效。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：该主方中的6味中药材，均属于药食同源的药物，且该方不仅针对咳嗽的症状，还考虑了整个方中药物的寒凉特点，进行配伍；在治疗疾病的同时，还对脾胃有一定的保护作用。
(四)具体实施方式
16.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
17.本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。以下实施例中所用试剂和原料均可通过商购获得。
18.实验动物：icr小鼠(清洁级，20g)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(中国，上海)，动物合格证号scxk(浙)2019—0004。小鼠饲养于浙江工业大学实验动物中心清洁级屏障动物房，不限制其进食饮水，饲养温度在25℃左右，相对湿度在55％-75％之间，光照周期为12/12h。入组小鼠周龄、体重、暴露因素等无统计学差异，且所有小鼠的护理和实验程序均在特定的无病原体(spf)条件下进行。本动物实验经浙江工业大学伦理委员会批准(动物伦理编号为：20210408018)，对动物的处理方法严格按照《关于善待实验动物的指导性意见》执行，该指导意见由中华人民共和国科学技术部颁发。
19.本发明所用药物均按照《中国药典》2020版采集制备。
20.实施例1：
21.1、配方：枇杷叶9份、桔梗3份、藏青果3份、干芦根15份、薄荷2份、甘草3份。
22.2、中药组合物：按配方量，精密称取枇杷叶9g、桔梗3g、藏青果3g、干芦根15g、薄荷2g、甘草3g，加入总重量10倍量的水，沸腾后煎煮1.5h后，过滤，滤饼再加入等量的水煎煮1.5h，总共煎煮2次，合并提取液，浓缩至含药量为0.125g/ml，得到中药组合物提取液1，即枇杷增液汤。
23.实施例2：
24.将实施例1中药组合物浓缩至含药量为0.25g/ml，得到中药组合物提取液2。
25.实施例3：
26.将实施例1中药组合物浓缩至含药量为0.5g/ml，得到中药组合物提取液3。
27.对比例1：
28.精密称取枇杷叶200g，加入重量10倍量的水，沸腾后煎煮1.5h后，过滤，滤饼再加入等量的水煎煮1.5h，总共煎煮2次，合并提取液，浓缩至含药量为0.5g/ml的提取液，得到枇杷叶浓缩液。
29.对比例2：
30.将对比例1中枇杷叶替换为枇杷花200g，其他操作相同，得到含药量为0.5g/ml的枇杷花浓缩液。
31.对比例3：
32.市售的枸橼酸喷托维林片作为对比例3。
33.实施例4、
34.1、实验
35.(1)小鼠氨水引咳实验
36.将70只icr小鼠随机分为模型组、阳性药组(对比例3)、中药组合物低剂量组(实施例1)、中药组合物中剂量组(实施例2)、中药组合物高剂量组(实施例3)、枇杷花组(对比例2)、枇杷叶组(对比例1)，每组10只。
37.适应性饲养7天后，模型组按0.1ml/10g体重的给药量给予生理盐水，阳性药组按0.1ml/10g体重给予枸橼酸喷托维林(给药量为0.013g/kg)；中药组合组低剂量组按0.1ml/10g体重给予中药组合物提取液1(给药量为1.5g/kg)；中药组合组中剂量组按0.1ml/10g体重给予中药组合物提取液2(给药量为3.0g/kg)；中药组合组高剂量组按0.1ml/10g体重给予中药组合物提取液3(给药量为6.0g/kg)；枇杷叶组按0.1ml/10g体重给予枇杷叶浓缩液(给药量为6.0g/kg)；枇杷花组按0.1ml/10g体重给予枇杷花浓缩液(给药量为6.0g/kg)。每天1次，连续给药7天。
38.(2)小鼠受氨水刺激后咳嗽时间及咳嗽次数的测定
39.步骤(1)连续灌胃7天后，在末次给药后1小时将小鼠置于倒置的500ml烧杯内，用1ml注射器吸取0.2ml浓氨水并注入50mg棉球后放入烧杯内，2分钟后即取出，观察和记录小鼠放入棉球后咳嗽潜伏期及咳嗽次数(以小鼠腹肌剧烈收缩，肩背怂动伴有张嘴为咳嗽指标)；将小鼠移出含有浓氨水的烧杯中，放在场外，观察其在1分钟内的咳嗽次数，并记录小鼠在3分钟内咳嗽的总次数。
40.(3)血清的采集
41.步骤(2)收集完小鼠氨水刺激后咳嗽时间及咳嗽次数的数据后，采用眼眶毛细管采血的方式采血，用1.5ml的ep管收集，收集到的血液，放37℃水浴锅温育30min，在速度为3500rpm的条件下离心15分钟，收集到的血清转移至另外一个干净的ep管中，-80℃冰箱保存备用。
42.(4)小鼠血清中il-6、il-1、tnf-α的水平含量测定
43.用elisa试剂盒(小鼠，上海酶联)测定步骤(3)采集的血清中il-6、il-1、tnf-α的水平，elisa检测的详细步骤见下表1。
44.表1、elisa试剂盒使用步骤
[0045][0046][0047]
(5)小鼠支气管切片的准备
[0048]
将小鼠采血后，暴露小鼠气管，剪下至甲状软骨下缘及气管分支处的一段气管，并用4％中性甲醛溶液将组织固48h后取出，放入包埋盒中，用流动的自来水持续冲洗2小时。此后，将冲洗后的小鼠气管组织放入脱水机中进行脱水，使小鼠气管组织透明。脱水步骤如表2所示。
[0049]
将已经脱水的气管组织浸泡在石蜡液体内，石蜡包埋机的温度设置为60℃。将熔融状态的石蜡，放入组织包埋用的铁槽中，然后迅速的将整个铁槽放置于包埋机的冷凝板上冷凝，透明的气管组织放在石蜡凝固后的包埋铁槽的凹陷中，用做了标记的包埋盒固定标记，然后再添加石蜡直至填满包埋铁盒区域，并放在冷凝板上凝固，将石蜡标本放在室温环境中，第2天后放入-20℃冰箱中保存，备用。
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表2、小鼠气管脱水浸蜡流程
[0051]
[0052][0053]
用切片机将包埋好的组织切片，切片的厚度控制再4um，用转轮式的切片方法。片子切好后，将片子放于43℃的水浴中展平，用黏附式的载玻片将展开的片子捞起、取出，控干水，烤片，然后再进行下一步实验操作，组织染色或者免疫组化。
[0054]
表3、小鼠气管切片、展片、烤片流程
[0055][0056]
(6)组织切片染色
[0057]
将步骤(5)切片放于60℃的烘箱中进行融蜡，20分钟后取出片子，进行苏木素-伊红(h&e)染色，具体步骤见表4。将染色好的片子用中性树胶进行封片，置于室温条件进行风干，再放置于高倍的显微镜下进行观察，选择合适的倍数、条件进行观察，并拍照。
[0058]
表4、苏木素-伊红(h&e)染色步骤
[0059][0060]
2、统计分析
[0061]
数据结果以x
±
sd表示，用spss 24.0和graphpad prism 5.0对数据结果进行分析，anova分析用于组与组之间的比较，差异具有统计学意义用p＜0.05表示，差异具有显著统计学意义用p＜0.01表示。
[0062]
3、实验结果
[0063]
中药组合物提取液、枇杷花提取液及枇杷叶提取液对小鼠氨水引咳实验引起的小
鼠咳嗽潜伏期及小鼠在3min内的咳嗽次数的影响，结果见下表5。
[0064]
表5、小鼠咳嗽时间及咳嗽次数(n＝10)
[0065][0066]
实验结果：从上表可以看出：通过与模型组对比研究，枸橼酸喷托维林组(对比例3)的小鼠咳嗽时间显著性延长及咳嗽次数明显减少；说明枸橼酸喷托维林对氨水引咳导致小鼠咳嗽有较好的预防作用。同时，给予中药组合物中剂量组(实施例2)的小鼠和高剂量(实施例3)的小鼠的咳嗽时间较给予生理盐水组的小鼠咳嗽时间明显延长，且呈剂量依赖性，随着枇杷增液汤浓度的增加，咳嗽时间延长，说明枇杷增液汤可以有效的延长小鼠咳嗽时间，相对于空白组小鼠咳嗽时间；同时，在咳嗽次数上，也呈现着剂量依赖的关系，随着给药浓度的增加，小鼠咳嗽次数较给予生理盐水组的小鼠明显的减少。高浓度提取液组(实施例3)延长小鼠咳嗽时间长达27.33s，咳嗽抑制率高达17.59，与阳性药物基本一致。
[0067]
实施例2及实施例3效果优于对比例1和对比例2，尤其是高剂量组。
[0068]
表6、不同实施例及对比例组提取液对小鼠氨水引咳实验中炎症因子的影响(n＝10)
[0069][0070][0071]
表7、不同实施例及对比例组提取液对小鼠氨水引咳实验的气管影响(n＝10)
[0072][0073]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示
例”、或“一些示例”等描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含本发明的至少一个实施例或示例中。在本发明说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外在不互相矛盾的情况下，本领域技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例的特征进行结合或组合。
[0074]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。