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树豆内酯A在制备治疗后天肥胖及其伴随症制剂中的应用的制作方法

时间:2022-01-18 阅读: 作者:专利查询

树豆内酯A在制备治疗后天肥胖及其伴随症制剂中的应用的制作方法
clinical guide. maturitas 2018;117:6-10;lima r,et al.hypertension in postmenopausal women.currenthypertension reports,2012,14:254-260.]。女性绝经后肥胖的致病机理是:由于雌激素分缺乏,机体的能量代谢能力减弱,导致脂肪生成过多、脂肪细胞肥大。补充雌激素可改善绝经后肥胖,但存在诱发雌激素依赖性肿瘤的危险。研究开发非雌激素类型的而且不作用于雌激素受体信号通路的药物,可以改善绝经后内脏肥胖、避免发生雌激素依赖性肿瘤。
3.超重与肥胖已经成为全球各国共同面对的公共卫生难题。据who数据,2016年全球成年人中有逾19亿人(占39%)超重;其中超过6.5亿人(占13%)达到肥胖症指标。在中国, 2018年40-79岁的中老年人中患肥胖症患者约有8400万(占13%);55岁以上的绝经后女性人群超过2000万人。由于肥胖人群易于发生高血压、冠心病、糖尿病、动脉粥样硬化、多囊卵巢综合征、不孕不育、中风、痴呆、抑郁症等,在bmi大于30的人群中,肥胖相关疾病的发生率严重增加。肥胖症的治疗显得越来越重要。据美国和欧洲内分泌协会与肥胖协会制订的《肥胖的药物管理:美国内分泌学会临床实践指南》,bmi≥30kg/m2的患者包括节食或锻炼减肥失败的患者,或者bmi≥27kg/m2伴有高血压、高血脂、2型糖尿病和阻塞性睡眠呼吸暂停的患者,应该使用减肥药治疗。
4.树豆内酯a是一种自豆科植物树豆中提取得到的天然产物,cn101422450a公开了其化学结构(化合物3),其结构式为:
[0005][0006]
cn103356607a公开了树豆内酯a在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。ob/ob小鼠(一种基因缺陷小鼠,由于天性缺乏瘦素,形成了先天性肥胖、多食、高血糖、胰岛素抵抗的病理生理学特征,因而被本领域专业技术人员用来模拟先天性肥胖症和2型糖尿病人群)体内药效试验数据表明,连续21天口服树豆内酯a(20mg/kg/d):(1)对ob/ob肥胖小鼠体重没有明显影响;(2)可以显著增加ob/ob小鼠的骨密度,显著降低血清alp水平和tracp 水平,提高血钙浓度。说明树豆内酯a对治疗骨质疏松,特别是对先天肥胖和高血糖致骨质疏松有明确的治疗效果,同时能够改善血脂代谢,在一定程度上避免肥胖—糖尿病—糖尿病慢性并发症—骨质疏松的疾病转变。该文件的实验数据同时表明口服树豆内酯a对先天瘦素缺乏肥胖并没有调节作用。
[0007]
wo2013013417a1公开了在先天肥胖糖尿病db/db(瘦素受体突变)小鼠中,连续16天腹腔注射10mg/kg/d的树豆内酯a,对小鼠的休重没有明显的影响,体重增加和模型组相比无明显差异(25.4%vs.26.9%,p》0.05);在ob/ob小鼠中,连续14天腹腔注射10mg/kg/d 的树豆内酯a可一定程度放缓小鼠体重增加的速度(31.9%vs.45.4%,树豆内酯a组vs.模
型组)。说明腹腔注射树豆内酯a可一定程度抑制先天瘦素缺乏肥胖小鼠的体重上升速度,但不能逆转其肥胖进程。


技术实现要素:

[0008]
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足,提供树豆内酯a在制备治疗或改善非先天因素引起的肥胖和肥胖相关脂肪肝的制剂中的应用。
[0009]
本发明所采取的技术方案是:
[0010]
本发明的第一个方面,提供:
[0011]
树豆内酯a在制备治疗或改善后天肥胖及其伴随症制剂中的应用,所述后天肥胖选自热量摄入过多导致的肥胖,或女性雌激素缺乏导致的肥胖。
[0012]
在一些实例中,所述伴随症选自后天肥胖相关脂肪肝。
[0013]
在一些实例中,所述女性雌激素缺乏是由绝经或卵巢摘除引起的。
[0014]
在一些实例中,所述肥胖是指体质量指数bmi不低于25,或体脂率超过33%,或内脏脂肪率超过9%,或腹部脂肪率超过9%。
[0015]
在一些实例中,所述制剂的剂型为口服制剂或注射剂。
[0016]
在一些实例中,所述口服制剂选自片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、固体饮料、功能性食品。
[0017]
本发明的第二个方面,提供:
[0018]
组合物在制备治疗或改善后天肥胖及其伴随症制剂中的应用,所述后天肥胖选自热量摄入过多导致的肥胖,或女性雌激素缺乏导致的肥胖,所述组合物中含有树豆内酯a。
[0019]
在一些实例中,所述组合物中树豆内酯a的质量含量不低于1%。
[0020]
在一些实例中,所述伴随症选自后天肥胖相关脂肪肝。
[0021]
在一些实例中,所述女性雌激素缺乏是由绝经或卵巢摘除引起的。
[0022]
在一些实例中,所述肥胖是指体质量指数bmi不低于25,或体脂率超过33%,或内脏脂肪率超过9%,或腹部脂肪率超过9%。
[0023]
在一些实例中,所述组合物的剂型为口服制剂或注射剂。
[0024]
在一些实例中,所述口服制剂选自片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、固体饮料、功能性食品。
[0025]
本发明的有益效果是:
[0026]
发明人在研究过程中意外发现,与之前的研究结果不同,口服树豆内酯a能有效地抑制非先天因素(能量摄入过多或绝经后雌激素缺乏)引起的肥胖。在采用高脂饮食小鼠模型(能量摄入过多)或双侧卵巢切除小鼠模型(雌激素缺乏)进行的试验中,口服树豆内酯a能显著抑制模型小鼠体重、总体脂率、皮下脂肪率及内脏脂肪率的上升;显著抑制模型小鼠腹膜后(内脏)和腹股沟(皮下)白色脂肪组织的质量增加和脂肪细胞肥大;明显抑制模型小鼠肝部脂质沉积和肝功能损伤。显示树豆内酯a无论是作为治疗过度饮食引起的肥胖和肥胖相关脂肪肝的制剂,还是作为治疗女性绝经后肥胖的制剂,均有着极其广阔的应用前景。
附图说明
[0027]
图1树豆内酯对高脂饮食(hfd)所致肥胖小鼠体重的影响。(a)实验期间小鼠体重
增长趋势和实验结束时整体形态代表图;(b)实验结束时各组小鼠体重增量。数据显示为均值
±
标准误(n=8)。
*
p《0.05,
**
p《0.01,
***
p《0.001,与正常对照(nc)组相比;
#
p《0.05,
##
p《0.01,
###
p《0.001,与高脂饮食模型(hfd)组相比。
[0028]
图2树豆内酯a对hfd所致肥胖小鼠体脂肪量、体脂率和体脂分布的影响(micro ct 扫描结果)。(a)各组小鼠的全身白色脂肪量;(b各组小鼠的体脂率;(c)各组小鼠的典型x射线画像;(d)断层图像,黄色代表皮下脂肪,紫色代表内脏脂肪,蓝色代表肌肉。数据显示为均值
±
标准误(n=8)。***p《0.001,与nc组相比;##p《0.01,###p《0.001,与hfd组相比。
[0029]
图3树豆内酯a对hfd所致肥胖小鼠内脏腹膜后白色脂肪组织(pgwat)的影响。(a) micro ct测得各组小鼠pgwat质量(n=8);(b)组织病理学h&e染色图(400
×
)显示各组pgwat脂肪细胞的大小。数据显示为均值
±
标准误。
***
p《0.05,与nc组相比;
###
p《0.05,与hfd组相比。
[0030]
图4树豆内酯a对hfd所致肥胖小鼠皮下腹股沟白色脂肪组织(ingwat)的影响。 (a)micro ct测得各组小鼠皮下脂肪组织质量(n=8);(b)组织病理学h&e染色图(400
×
) 显示各组ingwat脂肪细胞的大小。数据显示为均值
±
标准误;***p《0.05,与nc组相比; ###p《0.05,与hfd组相比。
[0031]
图5树豆内酯a对hfd小鼠棕色脂肪组织(bat)的影响。(a)小鼠bat指数=bat 质量/体质量(g/g)(均值
±
标准误,n=8);(b)micro-ct bat三维重建图;(c)bat 组织病理学h&e染色图(400
×
)。
[0032]
图6树豆内酯a对hfd所致肥胖小鼠肝部脂肪沉积和肝功能的影响。(a)肝脏组织病理学h&e染色观察肝脏组织的脂肪空泡(白色圆形)(400
×
);(b)油红o染色观察肝脏组织中的脂肪积累(红色)(400
×
);(c)血清alt水平;(d)血清ast水平。
[0033]
图7树豆内酯a对hfd所致肥胖小鼠48小时整体能量代谢的影响。(a)小鼠在监测期间的总摄食量;(b)产热量;(c)呼吸交换率;(d)二氧化碳产量;(e)耗氧量; (f)活动率。数据显示为mean
±
sem(n=5)。
[0034]
图8树豆内酯a对双侧卵巢摘除(ovx)所致肥胖小鼠体重的影响。a:实验期间各组小鼠体重变化趋势图;b:实验结束时各组小鼠的体重增量。与假手术(sham)组相比,
*
p《0.05,
**
p《0.01,
***
p《0.001;与ovx组相比,
#
p《0.05,
##
p《0.01,
###
p《0.001。
[0035]
图9树豆内酯a对ovx所致肥胖小鼠瘦体重、内脏脂肪率、皮下脂肪率、总体脂率的影响。a:活体小鼠micro-ct成像图;b:各组小鼠瘦体重;c:各组小鼠内脏脂肪率;d:各组小鼠皮下脂肪率;e各组小鼠总体脂率。与sham组相比,
*
p《0.05,
**
p《0.01,
***
p《0.001;与ovx组相比,
#
p《0.05,
##
p《0.01,
###
p《0.001。
[0036]
图10树豆内酯a对ovx所致肥胖小鼠内脏腹膜后白色脂肪组织(pgwat)的影响。 a:各组小鼠腹膜后脂肪率;b:各组小鼠pgwat的h&e染色病理观察;c:各组小鼠pgwat 细胞直径;d:各组小鼠pgwat细胞直径数目分布比;e:各组小鼠pgwat细胞面积;f:各组小鼠pgwat细胞面积数目分布比。与sham组相比,
*
p《0.05,
**
p《0.01,
***
p《0.001;与ovx组相比,
#
p《0.05,
##
p《0.01,
###
p《0.001。
[0037]
图11树豆内酯a对ovx所致肥胖小鼠肝脏的影响。各组小鼠肝脏组织h&e染色。
[0038]
图12树豆内酯a对双侧卵巢摘除致肥胖小鼠(hfd饲喂)子宫萎缩的影响。a.子宫指数(子宫质量/体重;mg/g),数据显示为mean
±
s(n=8),
***
p《0.001,与sham组相比;
###
p《
0.001,与ovx组相比;b.子宫组织学h&e染色。
具体实施方式
[0039]
以下用实施例进一步说明本发明的内容。通过实施例,本领域技术人员能够了解本发明所说的树豆内酯a用于制备治疗高脂高热量饮食引起的肥胖和肥胖相关脂肪肝的制剂,或者作为治疗女性绝经后肥胖的制剂的依据及制剂作用特点。但是这些实施例不得理解为对本发明保护范围的限定。
[0040]
树豆内酯a对高脂饮食(hfd)所致肥胖小鼠体重增量、体脂、内脏脂肪和肝组织病变的改善作用
[0041]
1实验材料和仪器
[0042]
c57bl/6雌性小鼠,8周龄,体重16-20g,购自广州中医药大学实验动物中心,质量合格证明:no.44005800006766。实验单位使用许可证编号:scxk(粤)2013-0001。
[0043]
树豆内酯a(英文名称cajanolactone a,代号cla),自制,纯度:98.3%(hplc法)。灌胃给药时加0.25%羧甲基纤维素钠(cmcna)研磨,制成混悬液。
[0044]
丙氨酸转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
[0045]
aloka latheta lct-200micro ct分析仪(aloka公司),varioskan
tm
lux多功能微孔板读数仪(thermo scientific),olympus ix73倒置荧光显微镜(日本olympus公司),leica tp1020自动脱水机、leica eg1160组织包埋机、leica2135石蜡切片机(leica公司),
ꢀ-
80℃超低温冰箱(heraeus公司),580br10905 pcr仪(bio-rad公司),垂直蛋白电泳仪 (bio-rad公司)。
[0046]
2实验方法
[0047]
2.1实验动物分组
[0048]
spf级雌性c57bl/6j小鼠,24只,常规饲养至9周龄,随机分为正常饮食组(nc)、高脂饮食组(hfd)、高脂饮食加树豆内酯a组(hfd+cla),每组8只。其中,正常组小鼠继续采用标准饲料饲养,其余组采用广东省医学实验动物中心提供的d12494号高脂饲料饲养。hfd+cla组小鼠每天一次灌胃给予40mg/kg的树豆内酯a,nc组和hfd组小鼠灌胃给予等量0.25%的cmcna,连续16周。
[0049]
2.2体重测定
[0050]
每周称量小鼠体重,记录各实验组小鼠体重增长趋势。
[0051]
2.3能量代谢监测
[0052]
给药结束后,采用promethion(sable)小动物代谢测量分析系统对小鼠的整体能量代谢情况进行分析。小鼠在代谢笼适应24小时后开始采集后续48小时内不同时间段和不同温度下的能量代谢数据,包括总进食量、产热量、呼吸交换率、总耗氧量、二氧化碳生成量和活动率。
[0053]
2.4身体成分分析
[0054]
能量代谢监测完成后,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠,采用latheta lct-200micro ct 对小鼠进行全身白色脂肪组织和棕色脂肪组织扫描。采用仪器自带latheta v3.51软件进行数据处理,计算全身脂肪量、瘦体重、内脏脂肪、皮下脂肪、体脂率和棕色脂肪量,并构建棕色脂肪三维重建画像。
[0055]
2.5血清和组织样本采集
[0056]
完成成分分析后的小鼠,禁食不禁水过夜(12h),通过眶后窦收集血液至ep管中,室温静置30min,于4℃、3000rmp离心15min。吸取上清,分装并保存在-80℃备用。随后小鼠经颈椎脱臼法处死,迅速采集肝脏、ingwat、pgwat、bat和下丘脑,使用无菌生理盐水洗涤后滤纸吸干。肝脏称重后和ingwat、pgwat、bat各剪取一部分置4%多聚甲醛固定,其余和下丘脑置于ep管中经液氮速冻后转移至-80℃保存备用。
[0057]
2.6组织病理学分析
[0058]
将在4%多聚甲醛溶液中固定48h以上的脂肪和肝脏组织采用常规方法进行脱水、石蜡包埋,再切成厚度为5μm的蜡片。将蜡片脱蜡、水化后,采用苏木素&伊红(h&e)染色。染色好的切片用中性树脂封片剂封片后,采用olympus ix73显微镜进行病理学观察。
[0059]
2.7肝脏油红o染色分析
[0060]
取新鲜肝脏组织用手术刀修平整后置于包埋台上,将oct包埋剂滴在组织周围,再将包埋台置于leica冰冻切片机的速冻台上速冻包埋。待oct变白变硬后,用冰冻切片机将组织块切成厚度7μm的薄片。将切片迅速粘附于干净的载玻片上,待其风干后进行如下操作:
[0061]
(1)在油红o染液中避光浸染8-10min;
[0062]
(2)于60%异丙醇ⅰ中分化3s,再于60%异丙醇ⅱ中分化5s;
[0063]
(3)于超纯水ⅰ中浸洗10s,再于超纯水ⅱ中浸洗10s;
[0064]
(4)浸入苏木素染液-harris中复染3-5min;
[0065]
(5)于超纯水ⅰ中浸洗10s,再于超纯水ⅱ中浸洗20s;
[0066]
(6)在以60%乙醇为溶剂的分化液中分化3s;
[0067]
(7)在超纯水ⅰ中浸洗10s,再在超纯水ⅱ中浸洗10s;
[0068]
(8)在返蓝液中返蓝1s;
[0069]
(9)将切片轻轻浸入自来水ⅰ和ⅱ中分别浸洗5s和10s;
[0070]
(10)将切片用甘油明胶封片剂封片;
[0071]
(11)于olympus ix73生物荧光显微镜下进行组织病理学观察并拍照。
[0072]
2.8血清转氨酶水平检测
[0073]
采用alt、ast检测试剂盒,按说明书操作指引测量血清alt和ast水平。
[0074]
2.9统计分析
[0075]
采用spss 22.0统计分析软件对实验数据进行分析,结果以均值
±
标准误(mean
±
sem) 表示。统计方法采用单因素方差分析(one-way anova)和lsd事后检验进行比较,p《0.05 表示差异具有统计学意义。图像输出采用graphpad prism 6.0软件进行处理。
[0076]
3实验结果
[0077]
3.1树豆内酯a明显抑制hfd所致肥胖小鼠体重的增加和体型胖大
[0078]
如图1所示:nc组小鼠体重增加缓慢,实验结束时体重净增仅3g。和nc组小鼠相比, hfd组小鼠体重增加迅速,到实验结束时体型明显胖大,体重净增加达12g。和hfd组小鼠相比,树豆内酯a干预组小鼠(hfd+cla组)体重增长明显变缓,实验结束时的体重平均减轻7.08g(22.92%),总体脂率减少9.02%,体型更接近nc组小鼠。说明口服树豆内酯a 能有效抑制高脂饮食诱导的体重增加和体型肥大。
[0079]
3.2树豆内酯a显著抑制hfd所致肥胖小鼠总体脂肪量和总体脂率的增加
[0080]
实验结束时对小鼠的microct扫描结果显示:和nc组小鼠相比,hfd组小鼠皮下白色脂肪量、内脏白色脂肪量、总体脂肪量和总体脂率有显著增加。而树豆内酯a干预组小鼠 (hfd+cla)皮下白色脂肪量、内脏白色脂肪量、总体脂肪量和总体脂率都明显低于hfd 组小鼠,说明树豆内酯a能明显抑制高脂饮食诱导的小鼠皮下肥胖和内脏肥胖。见图2。
[0081]
3.3树豆内酯a能有效抑制hfd所致肥胖小鼠白色脂肪堆积及脂肪细胞肥大
[0082]
micro ct测得各组小鼠腹膜后白色脂肪组织(pgwat)和腹股沟白色脂肪组织(ingwat) 质量结果显示hfd组小鼠的内脏脂肪量和皮下脂肪量较nc组有显著增加。h&e染色组织病理学分析结果显示pgwat和ingwat的脂肪细胞较nc组明显肥大。而树豆内酯a的干预有效减少了hfd诱导的pgwat和ingwat质量增加以及脂肪细胞的肥大。说明树豆内酯a 主要通过减少内脏和皮下脂肪组织中脂质的积累来控制体重、减少皮下和内脏肥胖。见图3、图4。
[0083]
3.3树豆内酯a能有效抑制hfd所致肥胖小鼠棕色脂肪细胞内脂肪的积累
[0084]
尽管micro ct测得nc组、hfd组和hfd+cla组的棕色脂肪组织(bat)质量和棕色脂肪率都无明显差异,但h&e染色bat病理学分析结果显示hfd组bat表现出一些白化特征,即脂肪细胞内积聚了更多、更大的脂滴。和hfd组相比,hfd+cla组小鼠bat的脂肪细胞变小、细胞内脂滴融合减少,形态更接近nc组。说明树豆内酯a可抑制高脂饮食诱导的棕色脂肪组织内脂质堆积。见图5。
[0085]
3.4树豆内酯a能有效抑制hfd所致肥胖小鼠的肝部脂质沉积,改善肝功能
[0086]
和nc组相比,hfd组肝脏组织病理切片的h&e染色结果显示明显的白色脂肪空泡,而油红o染色结果显示细胞内有过量的脂质堆积(红色),说明高脂饮食导致小鼠肝部出现明显脂肪变性。与之相对应,hfd组小鼠血清alt水平明显高于nc组小鼠,说明高脂饮食对肝功能有伤害。本研究中,hfd+cla组小鼠肝部的白色脂肪空泡和油红o染色度、血清 alt水平都明显低于hfd组而更接近nc组。说明树豆内酯a能有效抑制高脂饮食诱导的肝部脂肪变性和肝功能异常,有助于预防和治疗非酒精性脂肪肝。见图6。
[0087]
3.5树豆内酯a能降低hfd所致肥胖小鼠的摄食量、增强小鼠的整体能量消耗
[0088]
采用小动物能量代谢检测系统对小鼠进行了48小时摄食量和整体能量消耗监测。发现: hfd组小鼠不管是在常温(25℃)环境还是在4℃环境、不管是在白天(早上6点至下午18 点)还是夜晚(下午18点至次日早上6点),其产热量(heat production)、呼吸交换率(rer),二氧化碳产量(vco2)、耗氧量(vo2)都明显低于nc组小鼠。说明高脂饮食诱导的肥胖导致了小鼠总体能耗的下降。本研究中,hfd+cla组小鼠的产热量、vco2和vo2值都高于hfd组小鼠而更接近nc组小鼠,说明树豆内酯a的干预改善了高脂饮食小鼠的能量代谢,增强了能量消耗。与此同时,hfd+cla组小鼠48小时总摄食量也较hfd组小鼠少,说明树豆内酯a也可通过减少高脂饮食小鼠的能量摄取起到抑制其肥胖的作用。见图7。
[0089]
综上,发明人在c57bl/6j小鼠模型上的研究显示:和正常饲养的小鼠相比,高脂饲料饲养的小鼠的体脂率、皮下脂肪和内脏脂肪率随饲养时间延长而明显升高;腹膜后白色脂肪细胞、腹股沟白色脂肪细胞明显肥大;整体能量消耗减少;肝部出现脂肪变性;血清转氨酶水平明显升高。基于该模型我们观察到了树豆内酯a口服给药干预16周的结果:树豆内酯a 能有效抑制高脂饲料饲养小鼠的体重、体脂率、皮下脂肪率和内脏脂肪率上升,改善肝
部脂肪变性,降低血清转氨酶水平,控制摄食量,促进能量消耗,显示了作为治疗高脂高热量饮食引起的超重、肥胖、脂肪肝制剂的前景。
[0090]
树豆内酯a对卵巢摘除所致肥胖雌性小鼠体重增量、体脂、内脏脂肪和肝组织病变的改善作用
[0091]
1实验材料和仪器
[0092]
spf级雌性c57bl/6j小鼠,48只,8周龄,体重20
±
2g,购自广州中医药大学三元里实验动物中心,no:44005800006766,实验单位使用许可证编号:scxk(粤)2013-0001。
[0093]
树豆内酯a(英文名称cajanolactone a,代号cla),自制,纯度:98.3%(hplc法)。灌胃给药时加0.25%cmcna研磨,制成混悬液。
[0094]
戊酸雌二醇片(1mg/片)(对照药物)购自拜耳医药保健有限公司,用0.25%cmcna 制成混悬液灌胃给药。乙醇、二甲苯购自广州化学试剂厂,均为分析纯;苏木素染液购自九州柏林公司;伊红染液购自北京世济合力生物科技有限公司;总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、丙氨酸转氨酶(alt) 和谷草转氨酶(ast)测试盒购自南京建成生物工程研究所。
[0095]
aloka latheta lct-200micro ct分析仪(aloka公司),varioskan
tm
lux多功能微孔板读数仪(thermo scientific),olympus ix73倒置荧光显微镜(日本olympus公司),leica tp1020自动脱水机、leica eg1160组织包埋机、leica2135石蜡切片机(leica公司),
ꢀ-
80℃超低温冰箱(heraeus公司)
[0096]
2实验方法
[0097]
2.1实验模型建立
[0098]
小鼠饲养于广州中医药大学三元里实验动物中心spf级动物房,实验经广州中医药大学伦理委员会批准。饲养环境:温度为23
±
2℃,相对湿度为55-65%,光照为12h节律(白天/ 黑暗),并给予小鼠普通饲料,自由取食饮水。小鼠饲养至12周龄时,称量体重,并随机分为去卵巢组(n=40)和假手术组(n=8)。
[0099]
去卵巢组:小鼠用1%戊巴比妥钠溶液(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,背部皮肤去毛,腹卧位固定。髂脊周围备皮,碘伏消毒,无菌手术剪在髂脊顶部上方之腰椎骶棘肌两侧切开,进入腹腔,在肾下极附近寻找,可见乳白色发亮脂肪团中包埋有深粉红色颗粒状的卵巢及紧密相连的子宫角,在子宫角上结扎,用眼科剪将卵巢摘除,检查有无出血,用无菌生理盐水冲洗后,把脂肪组织推回腹腔,将腹膜、肌层一起缝合,再缝合背肌、皮肤。术后所有动物抗感染处理,同等条件下摄食,自由饮水,饲养温度为23
±
2℃,相对湿度为55-65%。
[0100]
假手术组:该组小鼠手术进腹腔后仅切除卵巢周围的少量脂肪组织,保留卵巢,缝合后抗感染处理,同等条件下摄食,自由饮水,饲养温度为23
±
2℃,相对湿度为55-65%。
[0101]
2.2实验分组
[0102]
小鼠术后恢复2周,称量体重。除假手术组(sham)外,去卵巢组随机分为5组,每组 8只。具体实验分组如下:
[0103]
sham:假手术组;ovx:去卵巢模型组;ev:去卵巢+戊酸雌二醇组(0.1mg/kg/d);l-cla:去卵巢+树豆内酯a低剂量组(10mg/kg/d);m-cla:去卵巢+树豆内酯a中剂量组(20mg/kg/d);h-cla:去卵巢+树豆内酯a高剂量组(40mg/kg/d)。
[0104]
2.3实验治疗方案
[0105]
除假手术组和去卵巢组灌胃给予0.25%cmcna外,其余各实验组小鼠每天灌胃口服给予相应药物,每周称量体重,连续16周。
[0106]
2.4检测的指标和方法
[0107]
2.4.1体重的测定
[0108]
每周称量小鼠体重,观察各实验组小鼠体重增长趋势。体重增加量=第16周小鼠体重
-ꢀ
手术前小鼠体重。
[0109]
2.4.2micro ct分析小鼠瘦体重、内脏脂肪率、皮下脂肪率和总体脂率
[0110]
各实验组小鼠用1%戊巴比妥钠(50mg/kg体重)腹腔注射麻醉,采用aloka lathetalct-200micro ct分析仪对所有小鼠进行扫描。设置扫描电压80kv,电流0.5ma,层厚96 μm,分辨率96μm,旋转角度360度。采用latheta v3.51软件进行数据处理,计算小鼠瘦体重、内脏脂肪率、皮下脂肪率及全身体脂率。
[0111]
2.5.3动物样本收集
[0112]
小鼠处死前禁食不禁水16h,摘眼球采血,收集小鼠血液,室温静置15分钟后,3000rpm, 4℃离心10分钟,分离血清,于-80℃保存。收集各小鼠肝脏和腹膜后生殖腺附近脂肪组织,并称量重量。将肝脏和脂肪组织分为两部分,一部分置于4%多聚甲醛中固定,另一部分分别置于1.5ml ep管中,放入液氮速冻,于-80℃保存。
[0113]
2.5.4小鼠血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸转氨酶和谷草转氨酶检测
[0114]
根据总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸转氨酶和谷草转氨酶(南京建成生物工程研究所)测试盒说明书进行检测分析。
[0115]
2.5.4腹膜后脂肪组织和肝脏病理学分析
[0116]
将在4%多聚甲醛溶液中固定48h以上的腹膜后脂肪组织和肝脏组织采用常规方法进行脱水、石蜡包埋,再切成厚度为4μm的蜡片。将蜡片脱蜡、水化后,采用苏木素&伊红(h&e) 染色。染色好的切片用中性树脂封片剂封片后,采用olympus ix73显微镜进行病理学观察。
[0117]
3数据分析
[0118]
实验所得结果用均数
±
标准误表示,采用spss 22.0统计分析软件,组间比较采用单因素方差分析和lsd检验,采用graphpad prism 6.0软件作图,p《0.05差异具有统计学意义。
[0119]
4实验结果
[0120]
4.1树豆内酯a对ovx所致肥胖小鼠体重的影响
[0121]
如图8所示,术前各组小鼠间体重未见差异。术后两周,去卵巢模型组(ovx)小鼠的体重已显著高于假手术组(sham)小鼠(p《0.01),说明卵巢切除术是成功的,雌激素缺乏导致小鼠在普通饲料饲养条件下出现了体重的快速增长。实验结束时(术后第18周),ovx 组小鼠和sham组相比超重达35%(31.5g vs.23.3g)。与无药物干预的ovx组小鼠相比,与 ovx组相比,树豆内酯a(cla)可剂量依赖地显著抑制小鼠体重和的增加。如图8所示,采用cla高剂量组(40mg/kg)和阳性药物戊酸雌二醇(ev)干预16周的小鼠,体重分别为25.3g和24.7g,和ovx组相比分别下降了6.83g和6.08g。说明雌激素替代疗法能抑制雌激素缺乏诱导的小鼠肥胖,而非雌激素的cla同样也能显著抑制雌激素缺乏引起的小鼠肥胖。
[0122]
4.2树豆内酯a对ovx所致肥胖小鼠瘦体重、内脏脂肪率、皮下脂肪率、总体脂率的影响
[0123]
与sham组小鼠相比,ovx组小鼠内脏脂肪率、皮下脂肪率和总体脂率均有显著性增加;而cla干预可显著性降低小鼠的总体脂率、皮下脂肪率及内脏脂肪率,但不影响瘦体重,效果和ev一致。说明cla能显著抑制雌激素缺乏导致的皮下和内脏脂肪堆积。结果见图9。
[0124]
4.3树豆内酯a对ovx所致肥胖小鼠血清转氨酶活性影响
[0125]
与sham组相比,ovx组小鼠血清中alt水平明显升高,且其均值达到异常的标准,提示肝脏功能异常,说明产生了一定程度的肝细胞损伤。而cla给药16周,小鼠血清的alt 和ast水平均显著降低,且其均值恢复到正常或近于正常的范围,说明cla治疗对受损肝功能具有显著的保护作用。结果见表1。
[0126]
表1树豆内酯a对ovx所致肥胖小鼠血清转氨酶水平(iu/l)的影响
[0127][0128]
注:与sham组相比,
***
p《0.001;与ovx组相比,
#
p《0.05,
##
p《0.01,
###
p《0.001。
[0129]
4.4树豆内酯a对ovx所致肥胖小鼠腹膜后脂肪组织的影响
[0130]
与sham组相比,ovx组小鼠腹膜后脂肪组织重量明显增加,脂肪细胞明显肥大、平均直径和面积显著增加,差异具有统计学意义。cla干预16周的小鼠腹膜后脂肪组织重量、脂肪细胞的直径和面积均显著减少,与去卵巢组相比,差异具有统计学意义,结果见图10。
[0131]
4.5树豆内酯a对ovx所致肥胖小鼠肝脏的影响
[0132]
如图11所示,ovx组小鼠肝脏出现明显的脂肪变性,而sham组小鼠肝组织未观察到异常;cla干预16周的小鼠肝细胞中脂肪沉积明显减少,说明cla对肝组织的脂肪沉积具有明显的保护作用。结果见图11。
[0133]
4.6树豆内酯a对卵巢摘除致肥胖小鼠卵巢的影响
[0134]
在双侧卵巢摘除致雌激素缺乏肥胖小鼠模型实验中,口服给药戊酸雌二醇,在减少肥胖小鼠体重、内脏脂肪的同时,观察到对已经萎缩子宫结构显著恢复的效果。但口服给药树豆内酯a(cla),在减少肥胖小鼠体重、内脏脂肪时并不改变该种模型动物因雌激素缺乏所引起的卵巢萎缩。说明cla的减肥及脂代谢调节相关作用的机制不同于阳性药物,即不属于雌激素替代作用。结果见图12。
[0135]
综上,发明人在c57bl/6j小鼠模型上的研究显示:在基础饲料饲养条件下,卵巢摘除(ovx) 小鼠相较于假手术组(sham)小鼠,其体脂率、皮下脂肪和内脏脂肪率随饲养时间延长而明显升高;腹膜后脂肪细胞明显肥大,肝部脂肪变性且肝功能明显异常。基于该模型我们观察到了cla口服给药干预16周的结果:cla能有效抑制去卵巢雌性小鼠的体重、体脂率、皮下脂肪率和内脏脂肪率上升,改善肝组织的脂肪沉积。显示了作为治疗雌激素缺乏(如绝经、手术摘除卵巢)引起的肥胖制剂的前景。