1.本发明涉及兽用生物制品领域，特别涉及一种鸭肠炎沙门氏菌病灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
2.沙门氏菌感染可以引起人和动物的伤寒、副伤寒、胃肠炎和败血症等疾病。禽沙门氏菌主要包括鸡白痢、禽伤寒、禽副伤寒，主要发生在幼禽，不但会导致畜禽大批死亡，还会因生长迟缓、产量下降等造成重大的经济损失，养殖业带来严重的危害。耐过畜禽终身带菌，带菌肉和带菌蛋，不仅造成严重的经济损失，对公共卫生更有严重的危害。
3.鸭沙门氏菌病，又名鸭副伤寒，是由沙门氏菌属的细菌引起的鸭的急性或慢性传染病。雏鸭感染发病时常出现大批死亡，而成年种鸭经常成为带菌者。引起鸭感染发病的沙门氏菌血清型比较复杂，主要有鼠伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌和肠炎沙门氏菌，其中以鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌最为常见。
4.鸭沙门氏菌病在近些年的鸭养殖过程中，常呈散发。2021年肉鸭养殖过程中出现大批急性死亡，呈爆发性，临床症状及剖检呈鸭浆膜炎病症，经病原分离鉴定及动物回归实验，多为鸭肠炎沙门氏菌病导致，给养殖造成了巨大的损失。
5.目前尚无鸭的沙门氏菌疫苗使用，通过药敏试验显示本次流行的沙门氏菌多对常用的氟苯尼考、头孢等抗生素有较强的耐药性，这也是本次流行沙门氏菌病药治疗没有效果的重要原因。因此研制一种能够预防鸭肠炎沙门氏菌的疫苗显得尤为紧迫。本研究通过大量的流行病学调查及大量的试验，研制出鸭肠炎沙门氏菌灭活疫苗，结果证实该疫苗保护效果良好。
技术实现要素：
6.本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种制备工艺简单、安全性好的鸭肠炎沙门氏菌病灭活疫苗及其制备方法。
7.本发明是通过如下技术方案实现的：一种鸭肠炎沙门氏菌病灭活疫苗，其特征在于：包括抗原和佐剂，其中，抗原为鸭肠炎沙门氏菌灭活菌液，佐剂为白油佐剂。
8.本发明的疫苗能够有效控制鸭肠炎沙门氏菌病，降低死亡，控制带菌，特别适合当前鸭肠炎沙门氏菌发病严重且抗生素使用受限的养殖形势。
9.上述鸭肠炎沙门氏菌病灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：（1）将鸭肠炎沙门氏菌按照常规方法进行增殖培养，得到鸭肠炎沙门氏菌菌液；（2）向制备好的菌液中加入占其质量0.5-1%的甲醛溶液，37℃下灭活56-72h，期间每隔6h摇晃一次；（3）将菌液离心，以灭菌生理盐水重悬菌泥，控制菌液活菌在2
×
10
10
cfu/ml，得到灭活抗原；
（4）将灭菌生理盐水、灭活抗原、吐温80混合配制水相，将注射用白油、司盘-80、硬脂酸铝混合配制油相，按照2:1-3:1的油水比，将水相缓慢加入油相中，高速剪切，制成均匀乳液，即为鸭肠炎沙门氏菌病灭活疫苗，2-8℃保存。
10.本发明的方法简单且易于放大生产，该方法的进一步技术如下：步骤（1）中，将冻干的肠炎沙门氏菌接种于麦康凯培养基，37℃培养12h，挑取生长良好的菌落接种tsa斜面培养基若干支，在37℃培养12h，经纯粹检查合格后，作为一级种子；以1-2ml tsb液体培养基浸泡一级种子斜面，无菌收集菌液接种于tsb液体培养基，37℃，100-120rpm摇床震荡培养5-8h，取样作纯粹检查合格后，作为二级种子；在10l发酵罐进行发酵，制备6l tsb培养基，121℃灭菌20min，温度降至37℃后，按照发酵体积的1-2%接种鸭肠炎沙门氏菌m370菌株发酵种子，37℃，100rpm，溶氧控制30-60%，ph控制在7.2
±
0.1进行发酵培养6h，收获菌液。
11.步骤（2）中，向制备好的菌液中加入占其质量0.5-0.8%的甲醛溶液灭活；步骤（3）中，于10000rpm条件下离心菌液。
12.步骤（4）中，水相按照灭菌生理盐水76份、灭活抗原20份、吐温80 4份的质量比配制而成，油相按照注射用白油95份、司盘-80 6份、硬脂酸铝1份的质量比配制而成。
13.进一步优选的，水相缓慢倒入油相中，12-18m/s线速度高速剪切成均一乳液。
14.本发明能够快速对2021年出现的鸭肠炎沙门氏菌病做出快速的病原分离鉴定，采用简单的工艺制备灭活疫苗，安全性良好，保护率达到90%以上，对当前的鸭肠炎沙门氏菌病有效防控。
附图说明
15.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
16.图1为鸭肠炎沙门氏菌在麦康凯培养基和bs琼脂培养基上的示意图；图2为鸭肠炎沙门氏菌油镜下的状态图；图3为鸭肠炎沙门氏菌pcr鉴定结果示意图；图4为鸭肠炎沙门氏菌病理变化示意图。
17.图3中，m为marker，1-4泳道分别为分离沙门氏菌样品，5泳道为阴性对照，6泳道为阳性对照（肠炎沙门氏菌cvcc3374）。
具体实施方式
18.为了本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的实施例。结合实施对本发明作进一步的描述和论证。
19.本发明涉及的疫苗菌株为鸭肠炎沙门氏菌，该菌株可在中国兽医药品监督检查所购买得到，也可以自行分离得到。
20.实施例1：病原的分离鉴定从山东菏泽单县某肉鸭养殖场送检的有包心、包肝、脾脏大理石样变的死亡鸭的脑、肝、脾脏中分离到一致的鸭肠炎沙门氏菌。
21.具体的分离方法为：接种环蘸取无菌采集病死鸭的脑、肝、脾，划线tsa鲜血（5%兔
血）平皿，37℃培养12-16h，挑取直径0.1-1.0mm灰白色、不透明、光滑、圆形菌落，接种麦康凯培养基和ss培养基。37℃培养12-16h，在麦康凯平皿上呈橘黄色（见附图1），在bs培养基上呈现黑色（见附图1），光学显微镜观察，革兰氏染色呈革兰氏阴性、短杆状（见附图2）。
22.以沙门氏菌特异性引物（参考专利《鉴别肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌的多重pcr方法》）进行pcr鉴定（表1），鉴定为肠炎沙门氏菌。
23.表1 沙门氏菌鉴定引物动物回归，培养菌液经pbs洗涤后，感染21日龄健康肉鸭，感染后10天，鸭10/10死亡，剖检呈现明显的包心、包肝、气囊炎病理变化，病变组织进行细菌分离，分离到与感染菌液一致的肠炎沙门氏菌。
24.实施例2：鸭肠炎沙门氏菌灭活抗原的制备（1）生产用种子的制备a)一级种子制备将冻干的肠炎沙门氏菌接种于麦康凯培养基，37℃培养12h，挑取生长良好的菌落接种tsa斜面培养基若干支，在37℃培养12h，经纯粹检查合格后，作为一级种子，在2-8℃保存，不超过10天。
25.b)二级种子制备以1-2ml tsb液体培养基浸泡一级种子斜面，无菌收集菌液接种于tsb液体培养基，37℃，100-120rpm摇床震荡培养5-8h，取样作纯粹检查合格后，作为二级种子，2-8℃保存，不超过2天。
26.（2）发酵抗原的制备a)发酵在10l发酵罐进行发酵，制备6l tsb培养基，121℃灭菌20min，温度降至37℃后，按照发酵体积的1-2%接种鸭肠炎沙门氏菌m370菌株发酵种子，37℃，100rpm，溶氧控制30-60%，ph控制在7.2
±
0.1进行发酵培养。培养6小时，收获菌液进行活菌计数。
27.b)灭活浓缩0.5-0.8%甲醛灭活56-72h，10000rpm离心灭活菌液，根据活菌计数结果以无菌生理盐水重悬菌泥至2
×
10
10 cfu/ml菌液，即为制苗用抗原。
28.实施例3：疫苗制备（1）油相制备注射用白油95份、司盘-80 6份、硬脂酸铝1份，先加少量油将硬脂酸铝加热融化
后，再加入司盘-80，充分溶解后，121℃灭菌30min。
29.（2）水相制备按照灭菌生理盐水76份，灭活抗原20份，吐温804份进行水相配制，充分搅拌至吐温80完全溶解。
30.（3）按照疫苗乳化按照油水比3:1的比例，将水相缓慢倒入油相中，12-18m/s线速度高速剪切成均一乳液。制备3批疫苗，定量分装后，保存至2-8℃。
31.实施例4：疫苗检验（1）无菌检验按照现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。
32.（2）性状检验取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，第一滴分散，以后各滴均不扩散。
33.取疫苗10ml装于试管内，以3000r/min离心15min，无水相析出。
34.（3）安全性检验a)方案选择5-7日龄健康樱桃谷肉鸭30只，10只/组，分别颈部皮下免疫鸭肠炎沙门氏菌灭活疫苗0.5ml/羽、1.0ml/羽，剩余10只作为空白对照。免疫后24h内观察鸭的采食、饮水、排便、精神状态，免疫后14天进行体重测定，免疫后21天进行剖检，观察注射部位的疫苗吸收及各脏器的变化。
35.b)结果0.5ml/羽、1ml/羽免疫试验组与对照组相比，采食、饮水、排便、精神状态均正常，免疫后14天体重增长两免疫组与对照组相比均无显著性差异（p＞0.05）具体结果表2。免疫后21天剖检，除个别鸭存在少许疫苗残留外，注射部位均无糜烂或增生，各组织脏器均正常。
36.表2疫苗免疫对增重的影响结果（4）有效性检验a)方案选择5-7日龄健康樱桃谷肉鸭30只，10只/组，免疫组颈部皮下免疫鸭肠炎沙门氏菌灭活疫苗0.25ml/羽，0.5ml/羽，剩余10只作为空白对照。免疫后14天，注射1个致死剂量的鸭肠炎沙门氏菌强毒菌液m370，连续观察7天，记录试验鸭的死亡情况。
37.b)结果以1个致死剂量（4.5
×
109cfu）腿部肌肉注射鸭肠炎沙门氏菌强毒菌液，0.25ml/羽与0.5ml/羽免疫组均能够提供100%的保护，对照组在7天内全部死亡，显示疫苗具有较好
的保护效果。具体结果见表3。
38.表3疫苗攻毒保护结果以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改，等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围内。