1.本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗。
背景技术：
2.鸡滑液囊支原体(mycoplasma synoviae，ms)主要引起家禽上呼吸道疾病，气囊炎，滑囊炎、跛行、瘫痪等。虽然致死率很低，但其一旦在鸡群中感染就很难根除，长期导致鸡群生长发育迟缓和产蛋量下降。而且ms可以垂直传播，给ms的扑灭带来很大困难。目前ms在全世界鸡场中都广泛存在，并且ms容易与其他病原体发生交叉感染，加剧其他病原体致病力，给养鸡业造成巨大的经济损失。
3.目前预防和控制ms的危害主要措施为使用鸡场净化、抗生素治疗和预防接种这三种。鸡场净化主要是通过各种检测方法，淘汰患病鸡群，培育无ms感染的种鸡群，但由于中国养禽场的规模和管理级别的不同，加之鸡场净化的成本高昂，很难建立和维护无ms感染的种鸡群，因此这种方法基本没有采用。而抗生素的频繁使用，不仅容易导致菌株产生耐药性，而且存在药物残留影响食品安全的风险。因此疫苗接种成为了防控ms的最佳选择。
4.现今市场上存在两种预防ms的减毒活疫苗，分别是对温度敏感的弱毒ms-h疫苗株和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)独立ms1疫苗株。1998年澳大利亚成功研制出ms-h疫苗株，它是通过用n-甲基-n9-硝基-n-亚硝基胍诱变澳大利亚田间分离株而获得的，并通过实验数据确定了ms-h疫苗株的安全性和有效性，这种疫苗目前已在全世界广泛使用，有效的控制了ms感染，降低了鸡群死亡率，延长产蛋期，提高了鸡群产蛋量和饲料转化率。但是，ms弱毒疫苗存在一些缺点。它只能应用于无ms感染的鸡场，这在很大程度上限制了其应用。此外，ms弱毒疫苗具有水平传播的风险，并可能在同一鸡场的圈舍中相互传播，导致未接种疫苗的禽感染ms。相比之下，灭活疫苗不仅可以克服此类限制，而且因为它们是非传染性的，不存在对其他种群造成交叉感染或毒力反强的风险。
5.因此研发有效的灭活疫苗对于我国ms的防控有着重要的意义。
技术实现要素：
6.有鉴于此，本发明的目的在于提出一种实施可靠、制备方便且可用于鸡滑液囊支原体病免疫预防的鸡滑液囊支原体灭活疫苗。
7.为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：
8.一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗，其包括抗原和疫苗佐剂，其中，所述抗原为经灭活的滑液囊支原体ms-fj01；该滑液囊支原体的拉丁名为mycoplasma synoviae，该滑液囊支原体ms-fj01保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为cctcc no:m 2021210，保藏日期为2021年3月8日。
9.作为一种可能的实施方式，进一步，所述滑液囊支原体ms-fj01采用0.2％的甲醛进行灭活。
10.作为一种可能的实施方式，进一步，所述滑液囊支原体ms-fj01通过鸡滑液囊支原
体培养基进行培养，所述鸡滑液囊支原体培养基的制备方法包括：
11.将酵母浸出粉5.6g、脑心浸出液肉汤21g、50mg/ml的精氨酸溶液8ml、50mg/ml的l-半胱氨酸溶液2ml、1wt％的酚红溶液2ml和250mg/ml的辅酶i溶液0.4ml，使用去离子水溶解并将其定容至900ml，之后加入80万单位/l的青霉素及灭活的胎牛血清100ml，ph调整到7.6～7.8，使用0.22μm过滤器过滤至无菌的容器中完成制备。
12.基于上述疫苗方案，本发明还提供一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备方法，其包括如下步骤：
13.1)将滑液囊支原体ms-fj01以1:10的比例加入ph值为7.6～7.8的鸡滑液囊支原体培养基中，在振荡速度180r/min下，37℃恒温培养至对数生长期，使菌液由红色变为黄色，然后收集菌液作为种子液，并在4℃环境下保存；
14.2)使用高速离心机离心步骤1)制得的菌液，将菌液进行50倍的浓缩，浓缩后即刻灭活；
15.3)菌液灭活：在步骤2)浓缩后的菌液中加入10％的甲醛溶液，使甲醛终浓度为0.2％，充分混匀，在振荡速度180r/min下，37℃恒温灭活24小时；
16.4)将经过步骤3)灭活的滑液囊支原体ms-fj01菌液以1:2.81的比例加入到疫苗佐剂中，制得混合物，然后使用剪切式分散乳化机(hr-500)对混合物进行乳化，速度逐渐由3000rpm/min提至15000rpm/min，持续乳化30min，完成疫苗的制备。
17.优选的，步骤4)制得的疫苗菌体抗原含量不低于1
×
10
12
ccu/ml。
18.基于上述疫苗方案，本发明还提供一种禽类灭活疫苗，其包括上述所述的鸡滑液囊支原体灭活疫苗。
19.采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，其具有的有益效果为：
20.1、本发明方案的疫苗能够刺激鸡群产生较高的抗体水平且持续期长，免疫后鸡滑液囊支原体的发病率明显减少，能够有效预防鸡滑液囊支原体的流行。
21.2、本发明方案的滑液囊支原体ms-fj01毒株制备出的鸡滑液囊支原体灭活疫苗可以有效的防控该病，同时也能提高该品类市销疫苗的丰富性和提供可选方案。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为将滑液囊支原体ms-fj01攻毒至spf鸡后出现的临床症状。
具体实施方式
24.下面结合附图和实施例，对本发明作进一步的详细描述。特别指出的是，以下实施例仅用于说明本发明，但不对本发明的范围进行限定。同样的，以下实施例仅为本发明的部分实施例而非全部实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
25.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；同时，下述实施例
中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
26.实施例1鸡滑液囊支原体的分离鉴定
27.1鸡滑液囊支原体的分离
28.采集福州鸡场疑似感染鸡滑液囊支原体的病鸡肿胀跗关节腔内容物，在无菌操作条件下，接种于改良frey氏液体培养基中，置37℃培养箱中恒温振荡培养48h，待菌液由红色变成黄色时，用0.45μm过滤器过滤，将滤液以1:10的比例接种到改良frey氏液体培养基中培养，取第2代菌液用于病原菌的鉴定。
29.2 鸡滑液囊支原体的鉴定
30.2.1 菌体形态鉴定
31.取第2代菌液涂片，经吉姆萨染色后镜检观察，菌体形态特征为球形或球杆型。
32.2.2菌落形态观察
33.取过滤后的菌液接种于改良frey氏固体培养基上，并置于37℃、5％的co2培养箱中培养7d，于低倍镜下观察可见细小、光滑、致密的小菌落，表现为“煎蛋样”，半凹陷于培养基内。
34.2.3菌体l型鉴定
35.取分离的第2代菌液接种在不含青霉素和醋酸铊的改良frey氏液体培养基中，连续传代培养10次后接种于改良frey氏固体培养基，37℃恒温培养后观察菌落形态并进行涂片镜检。结果表明分离菌为菌体l型阴性。
36.2.4鸡红细胞吸附试验
37.加入5ml 1wt％鸡红细胞悬液于已培养好分离菌的改良frey氏固体培养基表面,室温孵育20min，弃悬液，用pbs洗涤3次，于低倍显微镜下可观察到菌落表面有红细胞吸附。
38.2.5生化鉴定
39.使用2.1g的脑心浸出液肉汤(环凯微生物)，10vol％的猪血清，1.12g的酵母浸出粉，1wt％的酚红配制成90ml的基础培养基；将葡萄糖，乳糖，精氨酸，尿素分别制成10wt％溶液，分别取10ml上述溶液加入基础培养基中；葡萄糖分解用培养基ph调整至7.6，精氨酸和尿素分解试验用培养基ph调整至7.0。去除基础培养基中的酚红，加入2wt％的氯化三苯四氮唑，制成四氮唑还原试验培养基，然后过滤除菌。将分离的第2代菌液加入10vol％猪血清的心浸液肉汤中培养24h，取1ml培养物接种于检测培养基中。结果显示该菌株能分解葡萄糖、乳糖；还原四氮唑；不分解精氨酸、尿素。
40.2.6人工感染鉴定
41.取分离的第2代菌液0.5ml，经滴鼻点眼及脚垫注射接种3～5日龄spf鸡，25d后感染鸡出现精神沉郁、跛行、瘫痪、膝关节发炎肿大、龙骨和气囊内有干酪样沉积物等明显的临床症状(见图1)。
42.2.7 16s rrna基因的进化树分析
43.扩增鸡滑液囊支原体毒株16s rrna基因并进行测序，与其他已知的几种鸡滑液囊支原体毒株进行进化树拓扑结构分析。结果显示该鸡滑液囊支原体毒株与亚洲鸡滑液囊支原体毒株具有较高的同源性。
44.2.8分子生物学鉴定
45.根据genbank中登录的鸡滑液囊支原体基因全序列，使用primer 5软件设计合成
一对特异性引物，分别为
46.ms-jd506-1：5
’‑
cttctatgcttaaactttcc-3’；
47.ms-jd506-2：5
’‑
taaagatattac-aacgacat-3’；
48.预期由两条引物扩增的目的片段大小为506bp，并根据吴移谋主编的《支原体学》第二版合成目的片段大小为208bp的一对引物，
49.ms-208-f：5
’‑
gaagcaaaatagtgatatca-3’；
50.ms-208-r：5
’‑
gtcgtctccgaagttaacaa-3’。
51.用鸡滑液囊支原体特异性引物pcr扩增此分离株，能扩增出约506bp和208bp的特异性片段。
52.通过以上各项鉴定结果表明，所分离的鸡滑液囊支原体毒株均符合鸡滑液囊支原体特性。
53.3鸡滑液囊支原体的保藏
54.将鸡滑液囊支原体培养至对数生长期(菌液由红色变为黄色)，收集60～100ml菌液，使用超高速离心机离心收集菌体沉淀物，送往中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏。所述的鸡滑液囊支原体其分类命名为：滑液囊支原体ms-fj01，拉丁文名为：mycoplasma synoviae，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址为中国武汉，保藏编号为cctcc no:m 2021210，保藏日期为2021年3月8号。
55.本实施例中，所述的改良frey氏液体培养基和改良frey氏固体培养基均为市销常规产品，便不再对其赘述。
56.实施例2、鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备
57.2.1生产用种子液制备
58.按照1:10的比例将滑液囊支原体ms-fj01加入到鸡滑液囊支原体培养基中，在振荡速度180r/min下，37℃恒温培养至对数生长期(菌液由红色变为黄色)，收集菌液作种子液，4℃保存。
59.其中，鸡滑液囊支原体培养基的制备方法为：将酵母浸出粉5.6g、脑心浸出液肉汤21g、50mg/ml的精氨酸溶液8ml、50mg/ml的l-半胱氨酸溶液2ml、1wt％的酚红溶液2ml和250mg/ml的辅酶i溶液0.4ml，使用去离子水溶解并将其定容至900ml，之后加入80万单位/l的青霉素及灭活的胎牛血清100ml，ph调整到7.6～7.8，使用0.22μm过滤器过滤至无菌的容器中完成制备。
60.2.2制苗菌液的扩增培养
61.按照1:10的比例将种子液加入到鸡滑液囊支原体培养基中，在振荡速度180r/min下，37℃恒温培养至对数生长期(菌液由红色变为黄色)，收集菌液。通过ccu计算支原体活性，方法如下：将收集的对数生长期的鸡滑液囊支原体菌液进行10倍系列倍比稀释至10-24
，共计24管，做6组重复实验。在振荡速度180r/min下，37℃恒温培养7日，观察活菌计数管的颜色变化，记录培养基由红色变为黄色的最大稀释度(即如果第7管发生颜色改变为最后一管，此ccu为107/ml)，最终ms-fj01株活菌量大于10
12
ccu/ml。
62.2.3制苗菌液的浓缩及灭活
63.通过高速离心的方法(15000g离心30min)用pbs重悬菌体沉淀，将制苗菌液做50倍浓缩，在浓缩后的菌液中加入10％的甲醛溶液，使甲醛终浓度为0.2％，充分混匀，在振荡速
度180r/min下，37℃恒温灭活24小时。
64.2.4灭活检验
65.按照1:10的比例将灭活菌液加入到鸡滑液囊支原体培养基中，观察14天，观察培养基是否有颜色的变化。结果显示灭活的菌液在培养14天后没有生长，培养基的颜色没有从红色变为黄色，表明甲醛终浓度为0.2％，振荡速度180r/min，37℃恒温24小时可以是菌体充分灭活。
66.2.5疫苗制备
67.将灭活的鸡滑液囊支原体菌液以1:2.81的比例加入到疫苗佐剂中，使用剪切式分散乳化机(hr-500)对灭活疫苗进行乳化，速度逐渐由3000rpm/min提至15000rpm/min，持续乳化30min，完成疫苗的制备(菌体抗原含量大于1
×
10
12
ccu/ml)。
68.其中，疫苗佐剂为montanide isa 71vg来源自seppic赛彼科(上海)特殊化学品有限公司，但可以不限于此。
69.3成品检验
70.3.1外观：取5ml成品疫苗放入清洁玻璃管中，可观察到疫苗无杂质，无颜色变化等。
71.3.2剂型：吸取成品疫苗滴加到冷水表面，观察疫苗没有出现扩散的情况。
72.3.3稳定性：取成品疫苗至离心管中，3000rpm/min离心15min，观察疫苗没有出现分层的情况。
73.3.4无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，无细菌生长。
74.3.5纯粹检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。
75.3.6甲醛残留量测定：按现行《中国兽药典》附录进行测定，结果符合兽用生物制品通则的规定。
76.3.7安全检验：将本发明成品疫苗通过颈部皮下注射14日龄spf鸡10只，0.5ml/只，观察14天，免疫的spf鸡没有出现因注射疫苗而引起的局部或全身不良反应，饮水、采食和精神状况均未出现异常。
77.3.8效力检验：将14日龄spf鸡随机分成2组，第1组10只，第2组20只。第1组颈部皮下注射制备疫苗，第2组不免疫(对照组)。免疫后每间隔一周对所有spf鸡进行采血，并分离血清，共采集到免疫后4周的血清。在免疫4周后，通过滴鼻点眼的方式对第1组spf鸡和第2组随机选取10只spf鸡接种鸡滑液囊支原体培养物0.5ml(菌体含量在1
×
10
12
ccu/ml)，其中第2组剩下10只为空白对照。攻毒后分别于3天和5天采集鸡的咽拭子进行pcr检测，观察30天，包括鸡的生长状态及临床表现。通过elisa方法测定鸡滑液囊支原体抗体效价，计算s/p值。结果显示免疫后鸡的抗体水平呈增长趋势，结果显示如表1。
78.表1疫苗免疫后效力检验结果
[0079][0080]
以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效装置或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。