1.本发明属于生物信息处理技术领域，具体涉及基于光学成像的皮肤血管和血流量化评价系统及方法。


背景技术：

2.皮肤微循环血管网络具有三维构筑特征，最表层的呈发卡状的毛细血管襻位于真皮皮乳头内，每个皮乳头有一个或多个襻不等，在其下方为毛细血管动静脉移行处，整体上呈刺猬皮样外观；在真皮乳头层与网状层交界处的乳头下有一层以多角形网格为特征的多角形毛细血管网络，丰富的血管网为周围的神经，毛囊，腺体等提供充足营养，具有十分重要的意义。
3.目前对于真皮层血管的形态以及血流灌注量的观测仍具有局限性，一方面，单一的方法无法评价结果较为片面，准确度欠佳，尚未构建血管血流全面评价体系；另一方面，大多的毛细血管观测手段停留在xy轴层次，也就是横截面的层次，并且限于真皮层的乳头环层次深度，血管立体评价不完整，因此，需要构建更为全面、完整的真皮层血管血流量化评价体系。


技术实现要素：

4.本发明公开了基于光学成像的皮肤血管和血流量化评价系统及方法，从xy 轴及z轴进行进行多个角度的观测评价，进而使得真皮层血管血流指标的量化更加全面细致。
5.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.基于光学成像的皮肤血管和血流量化评价系统，包括激光散斑血流成像单元、双光子成像单元、毛细血管探测单元和免疫荧光染色单元；
7.激光散斑血流成像单元用于血管及血流灌注量的宏观观测；
8.双光子成像单元用于血管走形与形态的微观观测；
9.毛细血管探测单元用于毛细血管网络的观测；
10.免疫荧光染色单元用于不同探测深度下横行及纵行血管计数。
11.激光散斑血流成像优势在于宏观上统计不同部位的血流灌注量，可大致统计血管直径和角度，但其对皮肤透光性要求较高，在涂抹透明剂之后，也只能看到血管的大概走行，并且探测深度有限，局限于真皮浅层，不适于精准测量，尤其是小于2μm的微血管的测量；而设置双光子成像单元，优势在于可以获得微观血管走行以及形态，尤其是直径小于2μm的微血管的测量以及血管分支的精准角度测量，并且可以看到由血管包绕的毛囊；其弥补了激光散斑血流成像的不足，使得血管血流的指标量化更为全面准确。毛细血管探测单元优势在于宏观观测真皮乳头层与网状层交界处的乳头下的多角形毛细血管网络，以及包绕的毛囊，并且能够通过软件计算得到毛细血管网个数和节点数，以此来表征毛细血管密度。而在纵切面上，由于微循环网络中血管的走行不定，免疫荧光染色单元可在真皮浅层与深层分别区别横行与纵行血管进行计数，并且用于各层不同形态类别血管的数目统计。综合
各单元的观测结果，即可形成更为全面完整的血管血流评价体系。
12.优选地，上述系统还包括信息处理单元；
13.信息处理单元用于综合分析激光散斑血流成像单元、双光子成像单元、毛细血管探测单元、免疫荧光染色单元获得的图像信息。
14.进一步地，激光散斑血流成像单元观测的血管直径大于2μm。
15.基于光学成像的皮肤血管和血流量化评价方法，使用上述任一系统进行皮肤血管和血流量化评价。
16.基于光学成像的皮肤血管和血流量化评价方法：
17.通过激光散斑血流成像单元进行血管及血流灌注量的宏观观测；
18.通过双光子成像单元进行血管走形与形态的微观观测；
19.通过毛细血管探测单元进行毛细血管网络的观测；
20.通过免疫荧光染色单元进行不同探测深度下横行及纵行血管的观测；
21.综合各单元图像信息，对皮肤血管和血流指标进行量化。
22.综上所述，本发明利用多种光学成像单元从xy轴与z轴层次分别进行观测及统计，其中，激光散斑血流成像单元、毛细血管探测单元、免疫荧光染色单元用于宏观观测，双光子成像单元用于微观形态观测，综合各单元观测结果，实现真皮层血管和血流量化评价体系的建立，为血管血流微循环系统的研究提供了有力保障。
附图说明
23.图1所示为观测位置选取过程散斑仪观测结果；
24.其中：a.大鼠背部脱毛后实景图，黑线为划分的六块区域；
25.b.大鼠背部血流灌注图(方框区域为后期选择观测区)；
26.c.背部六块区域血流灌注量统计图。
27.图2所示为观测位置选取过程毛细管探测仪观测结果及oct观测结果；
28.其中：a-f为毛细血管探测仪对大鼠背部观测图像：
29.a.上左部图像；b.上右部图像；c.中左部图像；d.中右部图像；e.下左部图像； f.下右部图像；
30.g-l为oct对大鼠背部观测图像：
31.g.上左部图像；h.上右部图像；i.中左部图像；j.中右部图像；k.下左部图像； l.下右部图像。
32.图3所示为xy轴层次观测结果；
33.其中，a.散斑仪下背部血管成像(线段所示为血管直径)；
34.b.散斑仪下背部血管成像(圆圈所示为所在区域血流灌注量统计)；
35.c.散斑仪下背部血管成像(线段角度为血管分支角度)；
36.d.图3a血管直径统计图；
37.e.图3b血流灌注量统计图。
38.f.双光子血管成像(线段角度为血管分支角度；线段所示为血管直径)；
39.g.毛细血管成像仪背部血管图像(白色箭头所指为毛囊)；
40.h.手动勾勒毛细血管走行；
41.i.imagej自动提取血管网图像；
42.j.imagej自动分析血管网结点；
43.k.imagej自动提取血管网节点。
44.图4所示为z轴层次观测结果；
45.其中，a.真皮表皮交界处横向血管免疫荧光图像；
46.c.图4a的血管计数图(圆点为横向血管所在处；黄色箭头所指处虚线为典型横向血管横截面；
47.d.真皮表皮交界处纵向血管免疫荧光图像；
48.f.图4d的血管计数图(深色圆点为纵向血管所在处；深色箭头所指处虚线为典型纵向血管横截面；白色圆点为横向血管所在处；白色箭头所指处虚线为典型横向血管横截面；
49.g.真皮较深层横向血管免疫荧光图像；
50.i.图4g的血管计数图(圆点为横向血管所在处；深色箭头所指虚线表示典型横向血管横截面；白色箭头所指虚线为较深层大血管横截面；较深层大血管横截面内箭头所指虚线表示大血管内红细胞；
51.j.真皮较深层纵向血管免疫荧光图像；
52.l.图4j的血管计数图(圆点为纵向血管所在处；白色箭头所指虚线为分支血管走行；
53.b、e、h、k为血管免疫荧光、细胞核蓝染、组织自发荧光叠加图，图中标记意义分别与图c、f、i、l对应相同。
具体实施方式
54.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
55.实施例1
56.基于光学成像的皮肤血管和血流量化评价系统，包括激光散斑血流成像单元、双光子成像单元、毛细血管探测单元和免疫荧光染色单元；
57.激光散斑血流成像单元选用激光散斑血流成像仪(型号：simbfihrpro)，用于血管及血流灌注量的宏观观测。
58.双光子成像单元包括双光子共聚焦扫描显微镜(olympusfv1000)和maitaideepsee激光器(120fs，80mhz)，用于血管走形与形态的微观观测；
59.毛细血管探测单元选用毛细血管探测仪(型号：cam1cvf)，用于毛细血管网络的观测；
60.免疫荧光染色单元包括切片制备材料、免疫荧光反应材料以及荧光观测设备，用于不同探测深度下横行及纵行血管计数。
61.进一步地，还可包括信息处理单元，选用图像处理软件，用于综合分析激光散斑血流成像单元、双光子成像单元、毛细血管探测单元、免疫荧光染色单元获得的图像信息，包
括毛细血管密度，直径，网状节点数目，血流灌注量等指标。
62.实施例2
63.利用实施例1系统进行皮肤血管和血流量化评价。
64.1.观测位置选取
65.(1)散斑仪观测
66.选用3只雄性wistar大鼠，体重190
±
20g。
67.将大鼠用异氟烷麻醉，先用剃毛器剃除背部大部分毛发，再用脱毛膏对剩余毛发进行清理，最后用温热的生理盐水进行擦拭。使大鼠处于持续麻醉的状态，将其放于激光散斑血流成像仪大体显微镜下，观测其背部皮肤，然后连接电脑图像，进行实时定位校准，同时采集实时图像和血流图像，当两者都相对清晰时，进行图像采集，采集时间为100s。
68.将其背部划分为六个区域，分别为上中下区域，每个区域中均匀划分为左右两边，观察对比各个区域血流灌注量的区别，进行统计，以此来筛选最佳观测部位。
69.结果如图1所示，由图1c可以得知，从数据分析统计中，大鼠背部上中下的血流灌注量大多特点为右边的血流灌注量明显优于左边，考虑是由于大鼠运动习惯而导致的个体差异，图中显示，中间部分的血流灌注量明显高于上部和下部的，并且下部的血流灌注量最低。并且由图1b可以观测到，中间部分的红色区域占比最多，并且分布均匀，同样可以直观看到背部中间区域的高血流灌注区占比高。综上所述，中间部分的血流灌注最密集，最适宜作为血流观测的部位。
70.(2)毛细血管探测仪观测
71.将大鼠用异氟烷麻醉，清理背部毛发，充分暴露背部皮肤，用毛细血管探测仪在大鼠背部采集图像信息，在皮肤表面涂抹白光油，对准测量区域开启激光，调整焦距，直到视野清晰，采集图像，用capiscope处理单元上记录图像文件。针对于上述划分的六个区域分别进行图像记录。
72.结果如图2所示，由图2a、2b、2c、2d、2e、2f可以观测到大鼠背部的毛细血管呈网状分布，上部以及下部的血管网较少，而中部的血管网较多，尤其是中右部(图2d)的血管网明显丰富于其他部位的，于散斑仪观测的结果相符，中右部的血管网丰富，相应的血流灌注也密集。
73.(3)oct(光学相干断层扫描仪)观测
74.将大鼠用异氟烷麻醉，清理背部毛发，充分暴露背部皮肤，用oct(光学相干断层扫描仪)，选择方式为线扫，线长为10mm，调节镜头高度和方向，使得线扫区域对准背部观测区域，直到所收集到的信号保持在一个较高水平，并且图像基本呈水平状态，采集图像。针对于上述划分的六个区域分别进行图像记录。
75.结果如图2所示，由图2g、2h、2i、2j、2k、2l总体观测可以得到，上部的皮肤表层较薄，并且不平整，组织的光穿透性较差，导致信号较弱，而中下部的表层较厚，并且质地较均匀，表面较平整，光穿透性较好，信号较强。
76.综上所述，散斑仪观测结果为背部中间区域血流灌注量最高，并且与毛细血管探测仪的结果相对应，血流灌注量高的区域相应的毛细血管网也丰富，oct 观测结果为中下部的透光性都较好，并且信号反射都较强；因此，基于对透光性与血流灌注量的考量，最终选择区域为大鼠背部中间区域为观测区域。
77.2.xy轴层次观测血管
78.(1)散斑仪观测及统计
79.将大鼠用异氟烷麻醉，清理背部毛发，充分暴露背部皮肤，对背部中间区域进行图像信号采集，具体采集方式同上。并且利用散斑仪自带分析软件对于毛细血管直径以及血流灌注量进行统计。
80.如图3a、3d所示，在散斑仪观测下，正常皮肤的血管走行呈较高的血流灌注量颜色标记区域(黄绿色区域)，并且从主血管进行分支到小血管，可看到较清楚的血管走行并且统计其血管直径，主干血管直径为4.328μm(左四线段)，血管近分支处直径为3.213μm(左三线段)，分支血管直径为2.245μm(左二线段)，左一线段标记处推测血管过细导致测量值极其不稳定，而无法测量其直径。并且在图3d中可以观测到主干血管有两次由于血流灌注增加，其直径增加，并且次级血管处的血流也增加，直径也同样增加，但再次级的小血管直径变化不明显。表明主干、次级血管的血流是相互影响的，并且越靠近主干，受到的影响越明显。
81.如图3b、3e所示，较粗的主血管分支处的血流灌注量分别为41.8(上右圆圈)，43.6(下右圆圈)，次级血管分支血流灌注量为40.8(下中圆圈)，末端血管血流灌注量为39.6(上左圆圈)，37.5(下左圆圈)；从图3e中可以观察到，血流灌注量会随着大鼠的呼吸运动而产生波动，并且主次血管之间的血流灌注量互相影响，变化规律相同。图3c可以统计血管分支的角度，分别为黑色线段组成的夹角：147
°
、104
°
、112
°
。
82.因此，一方面可得主次级血管的血流灌注量会随着大鼠呼吸而波动，并且影响血管的直径大小，主次血管之间变化趋势相同。另一方面，从主血管到次级血管到末端血管的血流灌注量，血管直径依次递减。
83.(2)双光子观测及统计
84.将大鼠用异氟烷麻醉，清理背部毛发，充分暴露背部皮肤，尾静脉注射罗丹明右旋糖苷溶液(8ml/ml)，注射剂量为0.4ml/100g。利用双光子荧光成像单元从背向收集信号。开始信号采集，双光子荧光激发波长为860nm，激发光由物镜聚焦到观测部位，产生的荧光信号由同一个物镜25倍数值孔径为1.05的水浸显微镜物镜来收集，双光子荧光通道使用高通滤波片，波长为860nm；组织做全层z轴扫描，步进1μm，图像采集速度10μm/pixel，将得到的图像进行z 轴叠加。
85.结果如图3f所示，可通过标尺计算血管直径，较粗的主干血管为6.8μm，分支血管为4.83μm，更细血管直径可达到1.63μm，在散斑仪下无法观测到如此清晰的血管走行，并且也无法统计到小于2μm的微血管直径。用imagej软件可计算血管分支角度，分别为78.82
°
、65.51
°
。在此图像下血管的形态更加明显，可以统计到直径小于2μm的微血管。
86.(3)毛细血管探测仪观测及统计
87.将大鼠用异氟烷麻醉，清理背部毛发，充分暴露背部皮肤，对背部中间区域进行图像信号采集，具体采集方式同上。之后导出图像，手动勾勒出毛细血血管的走行之后，用imagej软件对其毛细血管网，节点数目进行统计。
88.由图3g可得，在毛细血管探测仪镜下，背部血管呈网状，并且血管网中间有毛囊分布(白色箭头)，图3i显示了16个闭合血管网和9个未闭合血管网，总共可见血管网为25个，图3k显示了血管网节点统计，共有64个节点。血管网以及血管网节点的数目都可以表示血
管的分布密度。
89.3.z轴层次观测血管
90.采集完所有的活体数据之后，取下大鼠背部中间的皮肤，放入4％的多聚甲醛中浸泡一周，之后对组织进行脱水，包埋，做成石蜡切片。将石蜡切片脱蜡复水，0.01m pbs冲洗，5min
×
3次；正常山羊血清封闭，37
°
，30min；倾去多余血清，滴加一抗(abcam，anti-cd31抗体[epr17259](ab182981)，稀释倍数： 1:500)，4
°
过夜，0.01m pbs冲洗，5min
×
3次，滴加荧光二抗(alexa fluor 594 标记山羊抗兔igg(h+l)，稀释倍数1：500)，室温避光孵育1h，0.1m pbs冲洗，5min
×
3次,用防淬灭封片剂(碧云天，产品编号：p0131，抗荧光淬灭封片液(含dapi))封片，4
°
避光保存。在双光子显微镜下观察真皮层血管形态以及分布情况，同时观测其自发荧光，对血管荧光、自发荧光、细胞核蓝染图像进行叠加，后续对于不同的血管形态进行分类统计。
[0091]
如图4b、4e、4h、4k叠加图对应4a、4d、4g、4j可以更加清晰地观察到血管所在位置以及形态，在图4b、4e、4h、4k中表现为圆形或者长条形，通过与之对比，用imagej软件进行血管计数得到了图4c、4f、4j、4l。
[0092]
可得结论：
[0093]
(1)对比图4i、4l和4c、4f，可知真皮深层血管(包括横行和纵行血管)，数目均多于与表皮交界处的真皮层血管，并且真皮深层有粗大血管分布(图4i 白色虚线)；
[0094]
(2)对比图4c、4f可知，表皮下较浅真皮层有横行、纵行两种血管，图4c 统中有25个横行血管(圆点)，图4f中有9个横行血管(白色圆点)和9个纵行血管(深色圆点)，表明横行与纵行血管相互交错，需要根据形态分开统计；
[0095]
(3)对比图4i、4l可得，较深真皮层也有纵行、横行两种血管，以及粗大血管，需要分开进行统计，横行血管63个(图4圆点)，粗大血管2个(图4i 白色虚线)，纵行血管17个(图4l圆点)，并且可见血管分支(图4l白色虚线)。
[0096]
综合以上x轴层次、z轴层次观测及统计结果，可对毛细血管走向、数目、密度、直径、分支角度、网状节点数目、血流灌注量等指标进行全面、细致的表征，进而为血管血流微循环系统的研究奠定基础。
[0097]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0098]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。