1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有免疫调节和改善肠道菌群的组合物及其制备方法。


背景技术：

2.黄精作为一种使用极为广泛的药食同源植物，最早记录于《神农本草经》，其味甘、平，归脾、肺、肾经，具有“补气养阴、健脾、润肺、益肾”之功效。在抗衰老、调节机体免疫、调血脂、血糖、改善记忆力、抗肿瘤、及抗菌等方面均显示出了潜在的药用价值。近年来黄精在营养保健、老年疾病预防等方面的应用越来越多，由此大大促进了黄精产业的发展。由于黄精为药食同源植物，产业进入门槛低，导致产品技术含量低、规模小、分散到千家万户，市场上主要为鲜品、生晒、蒸晒等初加工产品，单味配方的加工产品如黄精茶、黄精粉、黄精丸、黄精酒等产品最为多见，精深加工产品的市场占有率很少。
3.免疫系统在维持机体自身稳定、抵抗病原菌感染、人工疫苗免疫应答等方面均有重要作用，机体免疫力低下会增加多种病原菌感染风险、无法产生有效的免疫应答。免疫增强剂可调节机体免疫力、增强机体的抗肿瘤、抗感染能力，纠正免疫缺陷，激活一种或多种免疫活性细胞，增强机体特异性和非特异性免疫功能，使低下的免疫功能恢复正常，或具有佐剂作用，增强与之合用的抗原的免疫原性，加速诱导免疫应答反应。因此，开发高效、安全的中药类免疫调节剂对于保障畜禽养殖业的健康发展具有重要意义。尽管目前报道的中药类免疫增强剂种类甚多，但多由于药效不明确、作用机制不明确、存在毒副作用或安全隐患等缺陷而在实际应用中应用较少，远远不能满足当前形势对免疫增强剂的需要。同时，现代研究表明肠道菌群与机体免疫力之间存在显著的相关性。
4.随着科学研究的不断发展，科学家们发现中医脾胃理论与现代免疫学说之间有着密不可分的联系。传统中医学理论认为脾主运化，胃主受纳，分工合作才能运化水谷精微于五脏六腑和四肢百骸，化生营养物质以供给全身各组织的需要。免疫系统中的免疫器官、免疫细胞、免疫因子等构成成分亦都来自脾胃所运化的精微物质。现代医学研究认为，传统中医学的“脾”应该包括现代医学的脾脏、造血系统和淋巴器官等。因此，本发明以黄精为实验材料，从中分离、精制能够增强机体免疫力、调节肠道菌群的有效部位，为改善人类健康，促进黄精产业发展，均具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明提出了一种具有免疫调节和改善肠道菌群的组合物，所述组合物包括黄精pse75组分或者黄精pse30；其中，所述黄精pse75组分和黄精pse30的制备方法如下：
6.将黄精与75％的乙醇溶液混合提取后得到黄精提取液，并将其以3～5bv/h的速度通过ab-8弱极性大孔吸附树脂柱，依次采用水，30％，75％和95％乙醇洗脱，分别收集30％，75％乙醇洗脱液，减压蒸干后分别得pse30和pse75，pse75组分为所述黄精pse75，pse30组分为所述黄精pse30。
7.进一步，所述组合物为黄精pse75组分脂质体或者黄精pse30脂质体。
8.进一步，所述组合物还包括卡拉胶、抗坏血酸、抗性淀粉、硬脂酸镁、滑石粉。
9.进一步，所述组合物的配方为：黄精pse75组分或黄精pse30组分30～80％、卡拉胶5～10％、抗坏血酸5～10％、抗性淀粉8～20％、硬脂酸镁1～3％、滑石粉1～7％。
10.同时，本发明还提供了上述具有免疫调节和改善肠道菌群的组合物的制备方法，包括如下步骤：
11.取干燥的黄精药材，用75％的乙醇溶液提取，提取完成后经减压浓缩至无醇，得到黄精提取液；
12.将黄精提取液通过大孔吸附树脂柱，分别以水、30％、75％乙醇进行梯度洗脱，分别收集30％和75％乙醇洗脱液，减压蒸干后分别得pse30，pse75，pse75组分为黄精pse75，pse30组分即为黄精pse30。
13.其中，所述大孔吸附树脂柱包括ab-8、d101、ads21型号大孔吸附树脂柱。
14.本发明还提供一种所述的具有免疫调节和改善肠道菌群的组合物的制备方法，所述组合物的制备方法还包括如下步骤：
15.将所述黄精pse75组分溶解到ph＝7.2～7.4的磷酸盐缓冲液中，配制成质量体积浓度为5～15％黄精pse75组分溶液，将卵磷脂和胆固醇溶解在甲醇、乙醇和正丁醇的混合溶剂中，将黄精pse75组分磷酸盐缓冲液注射到上述混合溶剂中。磁力搅拌，去除混合溶剂，加入ph7.2～7.4的磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，得到黄精pse75组分脂质体；
16.将所述黄精pse30溶解到ph＝7.2～7.4的磷酸盐缓冲液中，配制成质量体积浓度为5～15％黄精pse30组分溶液，将卵磷脂和胆固醇溶解在甲醇、乙醇和正丁醇的混合溶剂中，将黄精pse30组分磷酸盐缓冲液注射到上述混合溶剂中。磁力搅拌，去除混合溶剂，加入ph 7.2～7.4的磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，得到黄精pse30脂质体；
17.其中，所述甲醇、乙醇和正丁醇的混合溶剂中，所述甲醇∶乙醇∶正丁醇＝50∶49∶1。
18.其中，所述再在40～50℃，0.1～0.15mp的条件下去除混合溶剂。
19.其中，所述用75％的乙醇溶液提取黄精时，其料液质量体积比在1∶8～1∶12之间。
20.有益效果
21.本发明制备的pse30、pse75组分脂质体均可显著增强ctx致免疫抑制小鼠的颗粒细胞、白细胞和淋巴细胞数量(图3)；模型组血清igg、igm抗体含量较pbs组显著降低，表明免疫抑制模型造模成功，pse30、黄精混合组分组均可显著增强ctx致免疫抑制小鼠血清igg、igm抗体含量(图4)；增强免疫小鼠脾细胞对k562细胞的杀伤活性(图5)；可上调ctx免疫抑制小鼠脾细胞转录因子和细胞因子的mrna表达水平(图6)；同时能够促进ctx导致的小鼠脾脏组织形态改变的恢复(图7)。同时根据上述结果可看出黄精pse75组分对ctx免疫抑制小鼠的免疫调节作用更强。上述结果说明黄精pse75组分脂质体能促进免疫小鼠对的体液免疫和细胞免疫应答，是一种理想的候选免疫增强剂。
22.黄精pse75和pse30的脂质体具有显著的免疫增强作用，可有效上调免疫抑制小鼠血液白细胞、淋巴细胞和颗粒细胞百分比，可有效增加免疫抑制小鼠血清igg和igm抗体含量。同时可增强免疫抑制小鼠脾细胞nk杀伤活性，促进脾脏组织结构的恢复，且能改善受损的肠道菌群，从而增强机体免疫力。因此，本发明所述的黄精pse75和pse30的脂质体是一种较好的候选免疫增强剂。此外，其制备工艺简单、方法简便、质量容易控制、使用方便、可冰
冻保存。所以，本发明的黄精有效部位有望开发成免疫增强剂。
23.实验表明：本发明提供的黄精pse75或者黄精pse30具有显著的提高机体免疫力作用，且能调节肠道菌群结构，可用于制备免疫调节药物和保健品，相对于现有技术，本发明首次分离出了黄精的有效改善肠道菌群结构的组分及提高免疫力的组分，对研究开发具有临床应用价值的黄精药物制剂具有重要意义。
附图说明
24.图1是本发明组合物的分离纯化流程。
25.图2是本发明组合物的lc-ms色谱图。
26.图3是本发明组合物对环磷酰胺致免疫抑制小鼠血清igg和igm抗体水平的影响。
27.图4是本发明组合物对环磷酰胺免疫抑制小鼠血常规的影响
28.图5是本发明组合物对环磷酰胺致免疫抑制小鼠nk细胞活性的影响。
29.图6是本发明组合物对环磷酰胺致免疫抑制小鼠脾细胞转录因子和细胞因子mrna表达水平的影响。ap＜0.05、bp＜0.01和cp＜0.001vs ctx对照组。
30.图7是本发明组合物对环磷酰胺免疫抑制小鼠脾组织形态的影响。
31.图8是本发明组合物对环磷酰胺免疫抑制小鼠肠道菌群结构的影响。
具体实施方式
32.下面结合具体实施例子进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域的技术人员对本发明各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所规定的范围。
33.实施例1
34.本实施例提供一种通过黄精制备的一种组合物，所述组合物的制备方法如下：
35.准确称取新鲜干燥的黄精药材1.0kg，粉碎至40～100目后置于圆底烧瓶内，按照料液比1∶8加入75％的乙醇，加热回流提取2次，每次2h，提取液过滤，合并滤液，在45℃减压浓缩至无醇味，得黄精提取液。本实施例得到黄精提取液1200ml，经过测定，其热出密度为1.14g/ml，生药浓度约合0.83g/ml。
36.黄精分离纯化：采用ab-8弱极性大孔吸附树脂经预处理后，装柱，取上述黄精提取液650ml的提取液上柱，流速4bv/h，依次采用水，30％，75％和95％乙醇溶液洗脱，分别收集30％，75％乙醇洗脱液，50℃减压浓缩至干分别得pse30和pse75，具体得率如下，分别为3.62％，1.68％。如图1所示。
37.通过对黄精混合组分的特性的进一步研究发现，其溶解性欠佳，为进一步提高黄精组分的生物利用度，因此，为了解决黄精有效部位不稳定的技术问题，又提出了一种以黄精混合组分为主要成分的组合物，制备方法如下：
38.将黄精混合组分溶解到ph＝7.2的磷酸盐缓冲液，配制成质量体积浓度为5％黄精混合组分溶液，称取1.0g卵磷脂和2.0g胆固醇于圆底烧瓶中，将其完全溶解在混合溶剂(甲醇∶乙醇∶正丁醇＝50∶49∶1)中，用注射器将30ml黄精混合组分磷酸盐缓冲液注射到混合溶剂中。磁力搅拌20min，再在40～50℃，0.1～0.15mp的条件下去除混合溶剂，最后加入ph 7.2磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，得到黄精pse75组分脂质体。
39.同理，制备pse30为主要成分的pse30脂质体。
40.pse30脂质体和黄精pse75组分功效的检测方法：45只清洁级雌性icr小鼠随机分为9组，每组5只，pbs对照组：每只灌胃磷酸盐缓冲液(pbs)0.2ml/10g；模型组第1-13天按0.2ml/10g灌胃pbs，第13-15天腹腔注射60g/kg的环磷酰胺(ctx)；阳性对照组第1-13天按0.2ml/10g灌胃玉屏风颗粒，第13-15天腹腔注射60g/kg的环磷酰胺(ctx)；pse30低剂量组在第1-13天按30mg/kg剂量灌胃pse30，第13-15天腹腔注射60g/kg的环磷酰胺(ctx)；pse30中剂量组在第1-13天按60mg/kg剂量灌胃pse30(以有效当量计)，第13-15天腹腔注射60g/kg的环磷酰胺(ctx)；pse30高剂量组在第1-13天按120mg/kg剂量灌胃pse30(以有效当量计)，第13-15天腹腔注射60g/kg的环磷酰胺(ctx)；黄精混合组分低剂量组在第1-13天按15mg/kg剂量灌胃黄精混合组分(以有效当量计)，第13-15天腹腔注射60g/kg的环磷酰胺(ctx)；黄精混合组分中剂量组在第1-13天按30mg/kg剂量灌胃黄精混合组分，第13-15天腹腔注射60g/kg的环磷酰胺(ctx)；黄精混合组分高剂量组在第1-13天按60mg/kg剂量灌胃黄精混合组分(以有效当量计)，第13-15天腹腔注射60g/kg的环磷酰胺(ctx)。在第16天，采抗凝血检测白细胞、淋巴细胞和颗粒细胞数；采集非抗凝血，分离血清，检测血清igg、igm抗体效价，将小鼠断颈处死，无菌条件下取脾，制备脾细胞悬液，进行脾细胞增殖反应和细胞活性分析。
41.结果表明：pse30、黄精混合组分脂质体均可显著增强ctx致免疫抑制小鼠的颗粒细胞、白细胞和淋巴细胞数量(图3)；模型组血清igg、igm抗体含量较pbs组显著降低，表明免疫抑制模型造模成功，pse30、黄精混合组分组均可显著增强ctx致免疫抑制小鼠血清igg、igm抗体含量(图4)；增强免疫小鼠脾细胞对k562细胞的杀伤活性(图5)；可上调ctx免疫抑制小鼠脾细胞转录因子和细胞因子的mrna表达水平(图6)；同时能够促进ctx导致的小鼠脾脏组织形态改变的恢复(图7)。同时根据上述结果可看出黄精混合组分对ctx免疫抑制小鼠的免疫调节作用更强。上述结果说明黄精混合组分脂质体能促进免疫小鼠对的体液免疫和细胞免疫应答，是一种理想的候选免疫增强剂。而单独喂养实验也证明了单独的pse50无法实现上述效果。
42.黄精有效部位对ctx免疫抑制小鼠肠道菌群的调节作用的验证方法：15只清洁级雌性icr小鼠随机分为3组，每组5只，pbs对照组：每只灌胃磷酸盐缓冲液(pbs)0.2ml/10g；模型组第1-13天按0.2ml/10g灌胃pbs，第13-15天腹腔注射60g/kg的环磷酰胺(ctx)；pse75组在第1-13天按30mg/kg剂量灌胃黄精混合组分(以有效当量计)，第13-15天腹腔注射60g/kg的环磷酰胺(ctx)。在第16天，将小鼠断颈处死，无菌条件下取小鼠盲肠内容物，液氮速冻，送样，通过16s rrna分析肠道菌群结构。
43.结果表明：ctx可使小鼠肠道菌群结构发生明显变化，而黄精pse75组分(以有效当量计)干预组可有效逆转ctx导致的小鼠肠道菌群变化。如模型组bacteroidales，lachnospiraceae菌群相对丰度显著高于对照组，pse75干预组的bacteroidales，lachnospiraceae菌群相对丰度显著低于模型组。模型组lactobacillus等菌群的相对丰度显著低于对照组，而pse75干预组lactobacillus菌群相对丰度显著高于模型组。
44.综上所述，黄精pse75组分和pse30的脂质体具有显著的免疫增强作用，可有效上调免疫抑制小鼠血液白细胞、淋巴细胞和颗粒细胞百分比，可有效增加免疫抑制小鼠血清igg和igm抗体含量。同时可增强免疫抑制小鼠脾细胞nk杀伤活性，促进脾脏组织结构的恢
复，且能改善受损的肠道菌群，从而增强机体免疫力。因此，本发明所述的黄精混合组分和pse30的脂质体是一种较好的候选免疫增强剂。此外，其制备工艺简单、方法简便、质量容易控制、使用方便、可冰冻保存。所以，本发明的黄精有效部位有望开发成免疫增强剂。
45.实施例2
46.本实施例提供一种通过黄精制备的一种黄精混合片剂，所述黄精混合片剂包括黄精混合组分、卡拉胶、抗坏血酸、抗性淀粉、硬脂酸镁、滑石粉的制备方法如下：
47.准确称取新鲜干燥的黄精药材1.0kg，粉碎至40～100目后置于圆底烧瓶内，按照料液比1∶12加入75％的乙醇，加热回流提取4h后得到提取液过滤，在40℃的条件下减压浓缩至无醇味，得黄精提取液。用d101弱极性大孔吸附树脂经预处理后，装柱，取黄精提取液650ml的提取液上柱，流速3bv/h，先用7～8倍柱体积的水洗脱，弃去洗脱液；再依次用3～6倍柱体积的30％乙醇水溶液洗脱、3-6倍柱体积的50％乙醇溶液洗脱、3-6倍柱体积的75％乙醇溶液洗脱、3-6倍柱体积的95％乙醇溶液洗脱，分别收集30％和75％乙醇洗脱液，分别收集30％，75％乙醇洗脱液，50℃减压浓缩至干分别得pse75组分。
48.将黄精pse75组分按照30％、卡拉胶10％、抗坏血酸10％、抗性淀粉20％、硬脂酸镁3％、滑石粉7％的比例混合，再经过压片机压制，得到黄精混合片剂。黄精混合片剂能促进免疫小鼠对的体液免疫和细胞免疫应答，是一种理想的候选免疫增强剂。
49.实施例3
50.本实施例提供一种通过黄精制备的一种黄精混合片剂，所述黄精混合片剂包括黄精pse30、卡拉胶、抗坏血酸、抗性淀粉、硬脂酸镁、滑石粉的制备方法如下：
51.准确称取新鲜干燥的黄精药材1.0kg，粉碎至40～100目后置于圆底烧瓶内，按照料液比1∶10加入75％的乙醇，加热回流提取4h后得到提取液过滤，在40℃的条件下减压浓缩至无醇味，得黄精提取液。用ads21弱极性大孔吸附树脂经预处理后，装柱，取黄精提取液650ml的提取液上柱，流速5bv/h，依次采用水，30％，75％和95％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，45℃减压浓缩至干得pse30。
52.将黄精混合组分按照80％、卡拉胶5％、抗坏血酸5％、抗性淀粉8％、硬脂酸镁1％、滑石粉1％的比例混合，再经过压片机压制，得到黄精混合片剂。黄精混合片剂能促进免疫小鼠对的体液免疫和细胞免疫应答，是一种理想的候选免疫增强剂。
53.实施例4
54.本实施例提供一种通过黄精制备的一种黄精混合片剂，所述黄精混合片剂包括黄精pse30、卡拉胶、抗坏血酸、抗性淀粉、硬脂酸镁、滑石粉的制备方法如下：
55.准确称取新鲜干燥的黄精药材1.0kg，粉碎至40～100目后置于圆底烧瓶内，按照料液比1∶9加入75％的乙醇，加热回流提取4h后得到提取液过滤，在40℃的条件下减压浓缩至无醇味，得黄精提取液。用ab-8弱极性大孔吸附树脂经预处理后，装柱，取黄精提取液650ml的提取液上柱，流速5bv/h，依次采用水，30％，75％和95％乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液，45℃减压浓缩至干得pse75。
56.将黄精pse75组分按照65％、卡拉胶7％、抗坏血酸3％、抗性淀粉19％、硬脂酸镁3％、滑石粉3％的比例混合，再经过压片机压制，得到黄精混合片剂。黄精混合片剂能促进免疫小鼠对的体液免疫和细胞免疫应答，是一种理想的候选免疫增强剂。
57.实施例5
58.本实施例提供一种黄精有效成分制备的脂质体，制备具体方法如下：将实施例1制备的黄精混合组分溶解到ph＝7.4的磷酸盐缓冲液，配制成质量体积浓度为15％黄精pse75组分溶液，称取1.0g卵磷脂和2.0g胆固醇于圆底烧瓶中，将其完全溶解在混合溶剂(甲醇∶乙醇∶正丁醇＝50∶49∶1)中，用注射器将20ml黄精pse75组分磷酸盐缓冲液注射到混合溶剂中。磁力搅拌20min，再在40～50℃，0.1～0.15mp的条件下去除混合溶剂，最后加入ph 7.2磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，得到黄精pse75组分脂质体。
59.同理，制备pse30为主要成分的pse30脂质体。
60.显然，本发明的制备的pse30、pse75组分可用于制备预防传染性疾病的免疫调节制剂。例如：稀释剂、赋形剂如水、生理盐水、葡萄糖、甘露醇、甘油、乙醇及其混合物等；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、海藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如吐温-80；润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅料如香味剂、甜味剂等。
61.本发明的制备的pse30、pse75组分组合物可以通过口服、鼻吸入、直肠、肠胃外或经皮给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂，同理还可以制备成粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、缓释微丸、固体分散体、包含物等，制成的液体制剂如混悬剂、乳剂、溶胶剂、糖浆剂、合剂、溶液剂等；用于肠胃外给药时，除了脂质体外，可将其制成水或油性混悬剂、乳剂、冻干粉、微囊、微球、纳米囊、纳米球等。优先的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、微丸、栓剂和注射剂。