irf1在调控间充质干细胞免疫调节作用及产品上的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及间充质干细胞免疫调节作用机制研究。


背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stem cell,msc)是一种中胚层来源的成体干细胞具有多向分化潜能，可以在不同微环境下受多种调节网络作用分化为成骨、软骨和脂肪细胞以及皮肤细胞等。其中间充质干细胞的低免疫原性和强大的免疫调节特性使其被广泛用于临床治疗自身免疫性疾病及损伤修复的重要原因。目前研究认为，移植到体内的msc可以抑制i型糖尿病，急性移植物抗宿主病，克罗恩病等自身免疫性疾病的炎症反应，促进损伤修复等从而治疗这些炎性疾病。
3.免疫抑制功能是msc独特的生物学特性，大量研究表明，msc通过分泌和表达一系列免疫抑制因子、细胞因子、生长因子和外泌体等调控炎症反应，包括il-6、tgfβ、pge2、ido1、inos、cd274、趋化因子和外泌体等，发挥免疫抑制作用。其中ido1，cd274，stat1和趋化因子cxcl9和cxcl10被认为是msc重要的免疫调节分子，这些分子共同作用构成复杂的调节网络，抑制包括巨噬细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、t细胞和b细胞等多种免疫细胞的功能；这些调节因子不仅可抑制t淋巴细胞增殖，同时还可抑制初始t细胞向th1和th17细胞亚群的分化，促进调节性t细胞(regulatory t cells,treg)的产生等，从而抑制机体的炎症反应，达到治疗炎性疾病的目的。
4.最新研究认为msc免疫调节作用依赖炎症微环境的赋能，即炎症微环境下使得msc高表达免疫抑制分子ido1等免疫抑制分子，从而发挥免疫抑制作用，而正常msc的这些免疫抑制分子表达很低，可能处于免疫调节静止期。也有研究发现gvhd病人血清及炎症因子ifn-γ和tnf-a预处理的msc免疫调节特性增强，有效减轻gvhd炎症反应，这种现象被称为msc免疫调节的可塑性，但这种可塑性机制仍不清楚。围产期胎盘来源的脐带、羊膜、胎盘间充质干细胞因其来源广泛，无伦理限制，体外与扩增等因素，成为目前研究和应用最多的msc。


技术实现要素：

5.基于此，有必要提供了irf1在调控间充质干细胞免疫调节作用上的应用。
6.为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
7.msc因其强大免疫调节作用被广泛应用于临床治疗炎性等疾病，但因其免疫调节可塑性机制不清，对指导临床应用有巨大挑战。本研究发现:1.单细胞测序和实验研究发现炎症因子预处理的脐带、胎盘、羊膜3种msc高表达irf1；2.炎症微环境下irf1可以调控免疫抑制分子ido1，cd274，stat1和趋化因子cxcl9、cxcl10表达；3.敲低irf1，msc抑制t细胞增殖能力降低，即irf1可以调控间充质干细胞免疫调控作用。
8.首先，本发明提供了irf1在调控间充质干细胞免疫调节作用上的应用，所述免疫调节作用为抑制t细胞增殖。
9.优选的，所述间充质干细胞为人胎盘、羊膜和脐带来源的间充质干细胞。
10.优选的，敲低所述irf1基因后，间充质干细胞抑制t细胞增殖作用降低。
11.优选的，所述irf1通过调节间充质干细胞的免疫抑制分子ido1、cd274、stat1及趋化因子cxcl9和cxcl10表达调控间充质干细胞抑制t细胞增殖作用。
12.优选的，所述irf1促进免疫抑制分子ido1、cd274、stat1及趋化因子cxcl9和cxcl10表达，从而抑制t细胞增殖。
13.优选的，炎症因子ifn-γ联合tnf-α刺激间充质干细胞可以高表达所述irf1基因。
14.进一步地，还提供了一种调控irf1基因表达的制剂，所述制剂中含有促进irf1基因表达的试剂，所述促进irf1基因表达的试剂中含有炎症因子ifn-γ和tnf-α。
15.进一步地，还提供了一种调控间充质干细胞抑制t细胞增殖作用的制剂，所述制剂含有调控irf1基因表达的制剂或免疫抑制分子ido1、cd274、stat1及趋化因子cxcl9和cxcl10抑制剂或免疫抑制分子ido1、cd274、stat1及趋化因子cxcl9和cxcl10促进剂，上调irf1基因表达的制剂抑制t细胞增殖，下调irf1基因表达的制剂促进t细胞增殖，所述免疫抑制分子ido1、cd274、stat1及趋化因子cxcl9和cxcl10抑制剂促进t细胞增殖，所述免疫抑制分子ido1、cd274、stat1及趋化因子cxcl9和cxcl10促进剂抑制t细胞增殖。
16.进一步地，还提供了一种调控间充质干细胞免疫调节作用的方法，所述方法是通过调控irf1基因的表达进而调节免疫抑制分子ido1、cd274、stat1及趋化因子cxcl9和cxcl10，从而调控抑制t细胞增殖作用。
17.进一步地，还提供了一种间充质干细胞细胞表达免疫抑制分子ido1、cd274、stat1及趋化因子cxcl9和cxcl10的调节剂，所述制剂含有调控irf1基因表达的制剂，上调irf1基因表达的制剂促进免疫抑制分子ido1、cd274、stat1及趋化因子cxcl9和cxcl10表达，下调irf1基因表达的制剂抑制免疫抑制分子ido1、cd274、stat1及趋化因子cxcl9和cxcl10表达。
18.基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
19.为解决上述问题，为临床治疗提供理论基础，我们基于单细胞测序研究发现转录因子irf1可以调控msc的免疫抑制分子ido1、cd274、stat1及趋化因子cxcl9和cxcl10表达，从而调控t细胞增殖。为此我们发现了msc免疫调节作用的重要转录因子irf1，补充了msc免疫可塑性的机制，为msc治疗炎性疾病治疗提供了重要理论基础和靶点。
附图说明
20.图1通过单细胞测序分析irf1在胎盘、脐带、羊膜msc和炎症因子刺激后的msc中的变化。
21.图2基于单细胞测序转录组文库分析转录因子irf1调控的靶基因网络。
22.图3qpcr检测炎症因子预处理敲低irf1的脐带msc中irf1，stat1，ido1，cd274及趋化因子cxcl9、cxcl10表达情况。
23.图4流式细胞术检测t细胞增殖比例。
具体实施方式
24.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例
中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
25.下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
26.下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
27.实施例1炎症因子ifn-γ联合tnf-α刺激msc高表达irf1
28.炎症因子ifn-γ联合tnf-α(20ng/ml)分别预处理分离培养的脐带(hu-msc)、胎盘(hp-msc)、羊膜(hm-msc)msc 12h，利用10x genomics平台建立单细胞转录组文库，在单细胞水平分析msc和s-msc(炎症因子刺激组)中irf1的mrna表达,结果显示炎症微环境下的脐带、胎盘、羊膜msc高表达irf1(图1)。
29.实施例2基于单细胞测序分析转录因子irf1调控的靶基因网络
30.基于脐带、胎盘、羊膜3种msc单细胞转录组文库，通过scenic软件可以识别转录因子(tfs)与潜在靶基因之间共表达的模块(regulon)以及每个细胞的regulon活性得分(regulon activity score,ras),结果显示irf1可以调控msc免疫抑制相关基因stat1，ido1，cd274及趋化因子cxcl9、cxcl10的表达，提示irf1可以影响msc免疫抑制特性(图2)。
31.实施例3分子水平验证irf1调控stat1,ido1,cd274及趋化因子cxcl9、cxcl10表达
32.脐带msc接种至6孔板(1
×
105/孔)，培养24h，细胞密度约为70％左右时，利用转染试剂jetprime(polyplus)瞬时转染sirna至脐带msc，用于敲低irf1表达。其中sir-irf1的序列见表1(北京生工)。共构建3种sir-irf1，挑选敲低效率最高的1110进行后续试验。转染体系为：buffer为120μl，jetprime 3μl，sir-irf1或nc 4μl加入1.88ml无血清a-mem培养基，使得sirna浓度为50μm，继续培养6-8h更换含10％fbs的完全培养基，继续培养24h。ifn-γ联合tnf-α(20ng/ml)预处理转染后的各组细胞12h，收集细胞，trizol提取总的rna，逆转录为cdna，实时荧光定量pcr(qpcr)检测irf1，stat1，ido1，cd274及趋化因子cxcl9、cxcl10表达,引物序列见表2。
33.表1.sir-irf1序列
[0034][0035]
表2.引物序列
[0036][0037][0038]
结果显示在炎症微环境下脐带msc的irf1敲低后,其调控免疫反应相关基因如stat1，ido1，cd274及趋化因子cxcl9、cxcl10表达显著降低,进一步证实irf1可以调控脐带msc免疫调节基因表达从而影响免疫抑制作用(图3)。
[0039]
实施例4敲低irf1的脐带msc与t细胞共培养
[0040]
利用免疫磁珠(pan t cell isolation kit,miltenyi biotec,130-096-535)分离人pbmc的总t细胞，实验过程参照试剂说明书。用pbs稀释的cfse(5μm)染料对分离的cd3t细胞染色，37℃孵育10min，加入1640完全培养基终止染色，计数，接种至长有msc的24孔板；
[0041]
接种cfse标记t细胞前6h，分别将脐带msc，转染nc和sir-irf1的msc接种至24孔板(1
×
105/孔)放入培养箱培养；将上述cfse染料标记的t细胞分别接种至各组msc细胞及单独培养，同时加入pha(10μg/ml)共培养72h，收集各组t细胞，流式细胞细胞术检测t细胞增殖。结果显示单独t细胞的增殖比例最高(30.1
±
5％)，敲低irf1的脐带msc组的t细胞增殖比例(11.6
±
1％)明显高于msc和nc组(4.15
±
0.6％，5.1
±
0.8％)，说明irf1敲低后脐带msc免疫抑制能力显著降低(图4)。综上所述结果说明irf1是msc调控t细胞增殖的重要转录因子，炎症因子使得高表达的irf1可以有效提高msc免疫抑制作用。
[0042]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。