1.本发明涉及生物活性肽技术领域，具体涉及一种牛骨肽组合物及其在制备调节肠道菌群及防治骨质疏松药物中的应用。


背景技术：

2.人体内除自身细胞之外，还存在数百万亿的微生物，其中约90％的微生物存在于人体肠道内，被称为肠道菌群。随着技术的不断发展，研究者发现，肠道菌群不仅与人的性格、衰老等生理状态相关，而且与人体多种疾病的发生发展密切相关，例如炎症性肠病、哮喘等自身免疫性疾病、骨质疏松，甚至帕金森等脑部疾病等等。也有研究者提出，通过调节肠道菌群或许是治疗疾病的一种有效途径，例如利用肠道菌群可以有效对抗糖尿病、帕金森病、酒精性脂肪肝等等。
3.骨质疏松是一种常见的骨代谢紊乱性疾病，主要临床表现是骨密度下降，骨微观结构受损、骨骼疼痛、易于骨折等等。骨质疏松致病因素复杂，主要涉及炎症、衰老、营养失调、氧化应激、激素代谢紊乱等等。目前，常用的骨质疏松治疗药物多以化学药物为主，例如雌激素调节剂、双膦酸盐、选择性组织蛋白酶k抑制剂等等。这些药物的使用，在一定程度上改善了骨健康，提高了患者生存率，但同时也在不同程度上增加了乳腺癌、静脉血管栓塞的罹患风险。近几年，越来越多的研究表明，骨质疏松与肠道菌群密切相关。肠道菌群可以通过“肠道-骨轴”影响骨代谢，是骨质疏松的重要诱因。更进一步的研究发现，肠道菌群会直接或间接影响机体对药物和营养物质的吸收与代谢，从而影响药物等对骨质疏松的治疗效果。因此，以肠道菌群为靶点的骨质疏松防治是极具应用前景的一种治疗策略。
4.骨胶原蛋白肽，简称骨肽，是一类由动物骨骼经酶解制备而成的生物活性多肽，广泛用于改善骨骼健康的食品和药品。牛骨肽是最常见的一类骨肽，主要包括黄牛骨肽、牦牛骨肽等等。研究显示，牛骨肽可以通过激活wnt/β-catenin、egfr等信号通路，促进骨形成，增强成骨细胞活力，抑制凋亡，减弱体内骨丢失，无论在体外细胞水平还是体内动物水平均表现明显的抗骨质疏松活性。尽管牛骨肽是预防和治疗骨质疏松药物的重要来源，但单用牛骨肽的临床治疗效果不显著。
5.中药因具有疗效显著、作用靶点多、毒副作用小、适合长期服用等特点，在骨质疏松防治中具有重要作用。杜仲和怀牛膝是我国常见药食两用中药材，在《神农本草经》中被列为上品，具有补肝肾、强筋骨等功效。基于现代药理学的研究发现，杜仲和怀牛膝可以通过调节rankl/rank/opg、wnt/β-catenin等信号传导途径来抑制骨骼炎症、促进成骨细胞增殖、抑制破骨细胞分化。目前尚未见任何关于杜仲和怀牛膝联合牛骨肽用于重塑肠道菌群防治骨质疏松的公开报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种可用于制备调节肠道菌群及防治骨质疏松的药物的牛
骨肽组合物。本发明提供的牛骨肽组合物通过重塑肠道菌群防治骨质疏松。
7.第一方面，本发明提供一种牛骨肽组合物，所述牛骨肽组合物由以下重量份计的原料制得：牛骨肽8-50份、杜仲10-30份和怀牛膝5-20份；所述牛骨肽为新鲜黄牛骨或牦牛骨经中性蛋白酶和复合蛋白酶消化处理得到等牛骨胶原蛋白肽。
8.优选地，本发明提供的牛骨肽组合物由以下重量份计的原料制得：牛骨肽30-50份、杜仲10-20份和怀牛膝5-10份。
9.所述杜仲为来源于杜仲科植物杜仲的干燥树皮；所述怀牛膝为来源于苋科植物牛膝的干燥根。
10.优选地，本发明提供的牛骨肽组合物由以下重量份计的原料制得：牛骨肽8-10份、杜仲20-30份和怀牛膝10-15份。
11.第二方面，本发明提供上述牛骨肽组合物的制备方法，将杜仲、怀牛膝与水混合，加热熬煮0.5-1h，加入牛骨肽，继续熬煮15-30min，过滤，去除药渣，即为牛骨肽组合物。
12.为了便于得到口服液体状态的牛骨肽组合物，上述牛骨肽组合物的制备方法，包括：
13.取杜仲和怀牛膝加水浸没，浸泡药材0.5-2h，煮沸后继续加热，加热熬煮至浸泡液为初始水含量的20-35％，除去药渣，煎煮液放置室温后，加入牛骨肽，使其充分溶解。
14.第三方面，在本发明提供的制备方法中，为了更好的与功能性食品或药学上可接受的辅料联合压片制成粉剂、片剂等固体制剂，在使用杜仲提取物、怀牛膝提取物进行牛骨肽组合物的制备时，杜仲提取物、怀牛膝提取物还可以通过以下方法获取：
15.首先，将杜仲、怀牛膝分别加水熬煮制备得到杜仲或怀牛膝提取物。然后将杜仲提取物、怀牛膝提取物及牛骨肽以重量比(2-1.5)：(1-2)：(6-8)进行混合，及得牛骨肽组合物。
16.优选地，将杜仲或怀牛膝分别加水熬煮至混合液体积为初始体积的45-55％，除去药渣，继续加热至混合液粘稠，放冷凝固后研磨成粉，得杜仲提取物或怀牛膝提取物；
17.本发明还要求保护，上述牛骨肽组合物或上述制备方法制备得到的牛骨肽组合物在与药学或功能性食品上可接受的辅料联合制成散剂、口服液、颗粒剂、片剂和/或胶囊剂中的应用。
18.以及，上述牛骨肽组合物或上述制备方法在制备防治骨质疏松药物中的应用。
19.本发明的有益效果至少在于：
20.(1)本发明提供的牛骨肽组合物可以显著改善骨质疏松大鼠的体重、体长等基本生长发育指标，促进股骨大小及重量的增长；有效改善因钙缺乏而导致的负钙平衡、骨代谢紊乱，调节骨吸收和骨形成之间的平衡。
21.(2)本发明提供的牛骨肽组合物可以显著改变骨质疏松大鼠的肠道菌群结构，显著增加了有益菌毛螺菌科的丰度，降低有害菌丹毒丝菌科的丰度，通过影响肠道菌群的分布，从而改善肠道代谢功能以及肠道健康，维持肠道免疫稳态。
22.(3)本发明提供的牛骨肽组合物组分简单，可用于制备调节肠道菌群及防治骨质疏松的药物中，还可添加在防治骨质疏松、调节肠道菌群的功能性食品中，开拓了牛骨肽组合物的药用新途径，具有实际的应用和推广价值。
附图说明
23.图1是本发明中不同物质对骨质疏松大鼠肠道菌群多样性的影响图；其中，m，骨质疏松模型组；cbp，黄牛骨肽组；ybp，牦牛骨肽组；tcm，杜仲/怀牛膝组；cbp_tcm，黄牛骨肽组合组；bp_tcm，牦牛骨肽组合组。
具体实施方式
24.以下结合实施例对本发明进行详细描述。本发明实施例中，所述牛骨肽是指由新鲜黄牛骨或新鲜牦牛骨，经中性蛋白酶与复合蛋白酶两步酶解法处理得到牛骨小分子生物活性肽。所述的杜仲来源于杜仲科植物杜仲的干燥树皮。所述的怀牛膝来源于苋科植物牛膝的干燥根。
25.实施例1牛骨肽、杜仲及怀牛膝制备的牛骨肽组合物
26.本实施例提供由牛骨肽、杜仲及怀牛膝制备得到的牛骨肽组合物。具体步骤如下：
27.将30g杜仲与15g怀牛膝加500ml水混合，加热熬煮1h，加入10g牦牛骨肽或黄牛骨肽，继续熬煮15min，过滤，除去药渣即得。
28.实施例2牛骨肽、杜仲及怀牛膝制备的口服液
29.本实施例提供由牛骨肽、杜仲及怀牛膝制备得到的口服液。具体步骤如下：
30.取50g杜仲和50g怀牛膝饮片加水600ml浸没，浸泡药材1h，煮沸后继续加热1h，加热熬煮至120ml，除去药渣，煎煮液放置室温后，加入20g牛骨肽，使其充分溶解，加入适当药学上可接受的辅料，制成口服液。
31.实施例3杜仲提取物、怀牛膝提取物及牛骨肽制备牛骨肽组合物
32.本实施例提供由杜仲提取物、怀牛膝提取物及牛骨肽制备得到的牛骨肽组合物。具体步骤如下：
33.分别将48g杜仲、24g怀牛膝与800ml水混合，加热熬煮至300ml，除去药渣，分别冷冻干燥成杜仲提取物粉末和怀牛膝提取物粉末，将杜仲提取物、怀牛膝提取物、牦牛骨肽按照重量比10：5：30混合均匀，即得。
34.实施例4杜仲提取物、怀牛膝提取物及牛骨肽制备得到的其他制剂
35.本实施例提供所述牛骨肽组合物的其他制剂。具体如下步骤：
36.可分别将杜仲、怀牛膝加水煎煮至体积减少一半，除去药渣，继续加热至溶液粘稠，放冷凝固，研磨成粉，按照重量比15:8:40将杜仲提取物、怀牛膝提取物、牛骨肽混合，加入适当功能性食品或药学上可接受的辅料，压片制成粉剂、片剂等固体制剂。
37.本发明制备的牛骨肽组合物经多次反复实验，具有良好技术效果，有关实验资料如下：
38.实验一：牛骨肽组合物对大鼠体重及股骨的影响
39.骨质疏松大鼠模型的建立：选用4周龄spf级sd大鼠(70
±
10g)，经正常适应性饲养一周后，通过饲喂低钙饲料构建骨质疏松大鼠模型。实验分为六组，分别为骨质疏松模型组、黄牛骨肽组、牦牛骨肽组、杜仲/怀牛膝组、黄牛骨肽组合组、以及牦牛骨肽组合组。每天灌胃给药1次，连续6周。饲喂期间测量并记录各组大鼠的体重。实验结束后处死各组大鼠，剥离各组大鼠双侧股骨，剔除骨表面肌肉与结缔组织，测定各组大鼠的股骨湿重、股骨中点直径。实验结果显示(表1)，不仅与骨质疏松模型组相比，而且与单独饲喂牛骨肽组和杜仲/
怀牛膝组相比，无论黄牛骨肽组合组还是牦牛骨肽组合组大鼠的体重、股骨湿重、股骨直径均有不同程度的增加。
40.表1牛骨肽组合物对大鼠体重及股骨的影响
41.分组平均体重/g股骨湿重/g股骨直径/cm骨质疏松模型组291.83
±
25.060.60
±
0.094.05
±
0.19黄牛骨肽组311.06
±
38.460.65
±
0.084.09
±
0.30牦牛骨肽组297.22
±
18.450.67
±
0.024.12
±
0.11杜仲/怀牛膝组298.30
±
18.740.67
±
0.044.17
±
0.15黄牛骨肽组合组324.72
±
16.210.68
±
0.084.25
±
0.35牦牛骨肽组合组302.86
±
24.800.72
±
0.094.24
±
0.24
42.实验二：牛骨肽组合物对骨质疏松大鼠血清生化指标的影响
43.腹主动脉取血后处死各组大鼠，所取血液于37℃静置2h，4℃过夜，取上层血清冻存于-80℃备用。严格按照相应试剂盒说明书检测各组大鼠血清中血钙含量，骨形成蛋白-2(bmp-2)及炎性因子白细胞介素-1β(il-1β)的含量。实验结果显示(表2)，与对照组相比，牛骨肽组合物可以显著提高血钙含量，促进骨形成标志物bmp-2的表达，抑制骨吸收标志物il-1β的分泌。实验结果表明，牛骨肽组合物在一定程度上纠正了负钙平衡，促进骨形成，抑制骨吸收。
44.表2牛骨肽组合物对骨质疏松大鼠血清生化指标的影响
[0045][0046][0047]
实验三：牛骨肽组合物对骨质疏松大鼠肠道菌群多样性的影响
[0048]
在无菌环境下收集各组大鼠粪便，于-80℃保存备用。分离粪便中的微生物并提取基因组dna，利用illumina miseq平台针对细菌16srdna进行微生物多样性分析。基于unweighted-unifrac距离算法，在otu水平上进行的nmds分析。实验结果显示(图1)，各组样本的分布相对离散。结果表明经牛骨肽组合物组处理后，大鼠肠道菌群结构发生了变化，各组间具有明显差异(stress＝0.159)。
[0049]
实验四：牛骨肽组合物对骨质疏松大鼠肠道细菌群落组成的影响
[0050]
基于科水平上对各组大鼠肠道菌群的物种丰度进行统计，结果显示(表3)，牛骨肽组合物可增加骨质疏松大鼠肠道有益菌乳杆菌科(lactobacillaceae)的丰度，同时减少有
害菌拟杆菌科(bacteroidaceae)的丰度。乳杆菌科作为维持肠道菌群稳态的有益菌，可提高钙的生物利用度，增加骨量，对骨骼健康具有保护作用。拟杆菌科是肠道条件致命菌，其丰度的增加常与机体免疫功能紊乱及肠道菌群失调密切相关。以上结果均表明牛骨肽组合物可调节骨质疏松大鼠的肠道菌群，通过调节肠道菌群稳态来达到调节骨质疏松的作用。
[0051]
表3各组大鼠肠道菌群在科水平上的相对丰度
[0052]
分组乳杆菌科拟杆菌科骨质疏松模型组4.39
±
1.9611.97
±
9.88黄牛骨肽组6.87
±
2.087.31
±
0.42牦牛骨肽组5.20
±
1.012.10
±
1.43杜仲/怀牛膝组6.58
±
2.167.93
±
5.34黄牛骨肽组合组9.76
±
8.521.75
±
0.71牦牛骨肽组合组6.15
±
1.373.43
±
0.51
[0053]
以上实验分别对本发明不同实施例制备的牛骨肽组合物进行了试验，均能取得相同或相近似的效果，故只做了总结性叙述，不再一一详述。
[0054]
综上可知，本发明所提供的牛骨肽组合物可以显著改善骨质疏松大鼠的体重、体长等基本生长发育指标，促进股骨大小及重量的增长；有效改善因钙缺乏而导致的负钙平衡、骨代谢紊乱，调节骨吸收和骨形成之间的平衡。同时，所述组合物可以显著改变骨质疏松大鼠的肠道菌群结构，显著增加了有益菌毛螺菌科的丰度，降低有害菌丹毒丝菌科的丰度，通过影响肠道菌群的分布，从而改善肠道代谢功能以及肠道健康，维持肠道免疫稳态，可有效用于制备调节肠道菌群及防治骨质疏松的药物中，还可用于功能性食品中防治骨质疏松、调节肠道菌群，开拓了牛骨肽组合物的药用新途径，具有实际的应用和推广价值。
[0055]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。