1.本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种治疗脊髓损伤的中药组合物及其应用、制备方法。
背景技术：
2.研究表明，脊髓损伤发生后，星形胶质被激活、少突胶质细胞前体以及神经干细胞开始增殖并向损伤区迁移，脊髓损伤后约14天，星形胶质细胞被激活并迁移到病变处，形成完全包围病变部位的屏障，形成明显的胶质瘢痕，同时，脊髓损伤后，少突胶质细胞直接坏死和凋亡，导致轴突脱髓鞘。损伤脊髓的胶质瘢痕的减少以及轴突的再生对脊髓损伤后的运动功能恢复至关重要，目前，普遍认为中药组合物具有资源丰富、作用全面、毒副作用小等诸多优点，因此，亟需提供一种治疗脊髓损伤的中药组合物。
技术实现要素：
3.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种治疗脊髓损伤的中药组合物及其应用、制备方法，所述中药组合物用以抑制脊髓损伤导致的反应性星形胶质细胞增殖以及治疗脊髓损伤导致的轴突脱髓鞘。
4.第一方面，本发明提供一种治疗脊髓损伤的中药组合物，所述中药组合物由下列中药组分制成：黄芪55-65份、巴戟天10-20份、仙茅10-20份、丹参10-20份、赤芍10-20份、当归10-20份、鸡血藤10-20份、川芎10-20份、熟附子10-20份。
5.所述中药组合物中的黄芪，巴戟天，仙茅为君药，其中，黄芪补气，归肺脾经，气为血之帅，气旺则血行，瘀去络通，巴戟天辛温补肾阳，具有祛风除湿，强筋壮骨之效，仙茅味辛性热，入肾经，能温肾壮阳，祛寒湿、强筋骨。所述中药组合物中的丹参，赤芍为臣药，其中，丹参为血分之要药，入心肝肾经，能破瘀通经，活血行血，内可化脏腑之瘀滞，外可通经脉而利关节，使瘀血通而痛自除；赤芍能清热凉血、散瘀止痛。所述中药组合物中的其余药味为佐药，其中，附子为熟附子大辛大热，归心脾经，既补命门之火，又兼逐风寒湿，为通痹之圣药，鸡血藤、川芎以及当归为常用的活血药，具有通络活血的作用。诸药相合，共奏活血通络，重塑血管网和补肾强筋之效。
6.在本发明的某些实施方式中，所述中药组合物由下列中药组分制成：黄芪60份、巴戟天15份、仙茅15份、丹参15份、赤芍15份、当归15份、鸡血藤15份、川芎15份、熟附子15份。
7.本发明进一步提供了所述中药组合物在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。
8.本发明进一步提供了所述中药组合物在制备抑制脊髓损伤导致的反应性星形胶质细胞增殖的药物中的应用。
9.本发明进一步提供了所述中药组合物在制备治疗脊髓损伤导致的轴突脱髓鞘的药物中的应用。
10.第二方面，本发明提供了上述治疗脊髓损伤的中药组合物的制备方法，包括下列步骤：称取黄芪、巴戟天、仙茅、丹参、赤芍、当归、鸡血藤、川芎以及熟附子，加清水将上述组
分浸泡；药物浸泡渗透且变软后，煎煮，过滤，滤液离心；取离心后上清液煎煮，浓缩，即得。
11.在本发明的其他实施例中，包括以下步骤：称取黄芪、巴戟天、仙茅、丹参、赤芍、当归、鸡血藤、川芎以及熟附子，加清水将上述组分浸泡；药物浸泡渗透且变软后，用武火煎煮，使得汤水沸腾，然后转为文火继续煎煮1小时，倒出汤水，得汤药一；向药物中继续加新的清水，液面没过药物，武火煎煮至汤水沸腾，然后转为文火煎煮40分钟，倒出汤水，得汤药二；将汤药一和汤药二合并，过滤，滤液离心；取离心后上清液用武火煎至沸腾，再用文火持续沸腾，浓缩，即得。
12.在本发明的某些实施方式中，所述中药组合物制备成但不限于口服液体制剂。
13.在本发明的某些实施例中，离心的转速为1500转/min，离心时长为5min。
14.在本发明的某些实施例中，浓缩后的药物组合物置于-20℃环境下保存备用。
15.与现有技术相比，本发明有以下优点：
16.本发明的中药组合物在干预脊髓损伤的治疗中可以抑制反应性星形胶质细胞增生，促进神经干细胞向损伤区迁移的能力，使小胶质细胞向m2样巨噬细胞转变，从而降低炎症反应，促进伤口愈合，减小胶质瘢痕面积，有利于再髓鞘化和轴突再生，促进神经分化与再生，因此，发挥了神经保护作用，并为功能恢复创造了有利条件。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为本发明实施例1干预改善脊髓损伤后的病理和运动功能示意图；
19.图2为本发明实施例1干预脊髓损伤治疗后脊髓组织的病理学改变示意图；
20.图3为本发明实施例1干预脊髓损伤治疗后gfap的表达图；
21.图4为本发明实施例1干预脊髓损伤治疗后免疫荧光检测nestin的表达图；
22.图5为本发明实施例1干预脊髓损伤治疗后免疫荧光染色分析神经丢失及损伤区轴突再生情况示意图；
23.图6为本发明实施例1干预脊髓损伤治疗促进损伤区再髓鞘化反应激活示意图；
24.图7为本发明实施例1干预脊髓损伤治疗促进小胶质细胞向m2表型极化及抑制炎症反应示意图；
25.图8为本发明实施例1干预nscs后促进细胞增值示意图；
26.图9为本发明实施例1干预nscs后促进其向神经元分化抑制其向胶质细胞分化示意图。
具体实施方式
27.下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。
28.一、实施例
29.实施例1
30.原料：黄芪60g、巴戟天15g、仙茅15g、丹参15g、赤芍15g、当归15g、鸡血藤15g、川芎15g、熟附子15g。
31.制备方法：
32.称取上述组分后，加清水浸泡2小时，保证液面高于药物2cm；药物浸泡渗透并且变软后，用武火煎药，使得汤水沸腾，然后转为文火继续煎制，开始计时，煎1小时，盖好锅盖，减少蒸发，煎好后小心倒出汤水，存放于1l烧杯中，得汤药一；向药物中继续加新的清水，液面没过药物2cm左右，武火再次沸腾，然后小火计时，煎40分钟，倒出汤水，得汤药二；将汤药二倒入汤药一的烧杯中，并用纱布覆盖杯口，倒出于另一个新的烧杯中，用以过滤药物沉渣；将过滤后的汤药依次倒入50ml的ep管中，放入离心机中离心，1500转/min，离心5min；将离心后的汤药置于干净的煎锅中，弃掉离心后的沉渣，武火将上清液沸腾，沸腾后小火持续沸腾，反复在量筒中测量药物体积，最后煎出76ml的汤药。
33.需要说明的是，对于76ml当量的设置，是因为正常成年人每天服用所述中药组合物195克，按照动物计量换算公式(中药成人口服195g*0.0026＝小鼠g/20g)，求出平均每只小鼠一天服用中药，即0.51g/20g(一只小鼠平均每天服用0.51g中药)。即每只小鼠一次灌胃200ul，即1ml中含有2.55g中药，每剂中药195g，当煎出76ml的汤剂，即为小鼠的剂量。
34.实施例2
35.原料：黄芪55g、巴戟天10g、仙茅10g、丹参10g、赤芍10g、当归10g、鸡血藤10g、川芎10g、熟附子10g。
36.制备方法同实施例1。
37.实施例3
38.原料：黄芪65g、巴戟天20g、仙茅20g、丹参20g、赤芍20g、当归20g、鸡血藤20g、川芎20g、熟附子20g。
39.制备方法同实施例1。
40.二、本发明中药组合物在治疗脊髓损伤的效果实验
41.1.关于allen’s损伤模型的建立
42.选择8周龄雄性c57bl/6小鼠60只，实验室饲养一周后，测其体重。将实验小鼠随机分为3组，每组20只，分别为sham组(假手术对照组)、sci组(无干预组)、bshx组(中药组合物干预组)。将小鼠称重后按照50mg/kg的标准，腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉；待小鼠肌肉松弛、角膜反应迟纯、皮肤捏夹反应消失后，将小鼠俯卧置于手术台上，分别固定头和四肢，剔除手术区周围毛发，以棘突高点及肋骨为标志定位t10棘突并作标记，碘伏消毒手术区域，上铺无菌手术单；以t10为中心，沿后正中线纵向切开小鼠背部皮肤及皮下组织，切口大小约1.5cm。紧贴骨面钝性分离竖棘肌并向两侧牵开，纱布止血，暴露t9-t11椎板；使用椎板钳仔细咬除t9-t11的棘突及椎板，充分显露t10段脊髓，操作过程注意避免挤压脊髓及破坏硬脊膜；使用pinpoint
tm
精密脊髓损伤撞击器(型号：pci3000-2)，设置相关参数后打击t10段脊髓。
43.其中，sci组建立成功的标志为小鼠身体发生一过性颤抖，双下肢迅速回缩并挥动，尾巴来回摆动。脊髓表面覆盖一层自体脂肪以减少粘连，检查无出血后逐层缝合肌肉、
皮下组织及皮肤，75％乙醇消毒皮肤；sham组在暴露脊髓后不进行打击，其余步骤同上。sci组术后常规抗感染治疗，以防术区、泌尿系感染等；术后排便困难则行膀胱按摩以助排便。小鼠分组及给药方法见表1所示。
44.表1
[0045][0046]
2.评估方法：
[0047]
a.h&e染色
[0048]
用4％多聚甲醛溶液固定。标本经脱水、石蜡包埋后以损伤区为中心连续切片厚5um做h&e染色。h&e染色步骤：二甲苯脱蜡10min
×
2次，无水乙醇5min
×
2次，95％乙醇5min，95％乙醇5min，80％乙醇5min，70％乙醇5min，苏木素5-10min，盐酸酒精2-5s，流水冲洗30min，70％乙酸5min，80％乙酸5min，伊红复染5-10min，95％乙酸5min
×
2次，二甲苯透明5min
×
3次。h&e染色后观察损伤区及其临近部位的切片，光镜下观察并拍照。
[0049]
b.bbb评分
[0050]
小鼠sci后1天、3天、1周及之后的每周分别进行一次bbb评分，直至第4周，以评价小鼠后肢运动功能恢复情况。评估方法：将小鼠放置于一宽敞的场地中，自由活动4min。两名观察者按照bbb评分标准评分，各自观察小鼠的髋、膝、踝关节，以及四肢、躯干运动及其协调情况并进行评分，取平均值。统计学分析：每周每组的bbb分值，行均值t检验，p《0.05。
[0051]
c.足迹测试
[0052]
术后14天，对小鼠进行足迹印记实验。将普通墨水涂抹在小鼠后爪上，使其通过一个长1m、宽10cm的足迹实验通道，在通道白纸上留下其足迹。
[0053]
d.尼氏染色
[0054]
(1)将已烘干的石蜡切片，常规脱蜡至水(二甲苯i、二甲苯ii各15min，然后梯度酒精脱水：100％i、100％ii、95％、90％、80％、70％、50％各5min)，蒸馏水冲洗2min；
[0055]
(2)织切片入0.5％甲苯胺蓝染液中2-5min，水洗，0.1％的冰醋酸稍分化，自来水洗终止反应，显微镜下控制分化程度，自来水洗后，将切片置于烤箱烤干。
[0056]
(3)透明封片：切片入干净的二甲苯透明10min，中性树胶封片；
[0057]
(4)显微镜观察损伤区及临近部位，光镜下观察并拍照。
[0058]
e.蛋白质印迹法
[0059]
(1)组织匀浆:加入裂解液，进行匀浆，4℃12000转离心15min，取其上清液；
[0060]
(2)按bca法测定蛋白浓度，计算上样量，于100℃10min进行蛋白变性；
[0061]
(3)制胶
‑‑‑‑‑
根据目的蛋白分子量的大小，配制相应浓度的分离胶；
[0062]
(4)电泳：先设定为恒压80v，待溴酚蓝到达分离胶形成一条直线后，将电压调为120v，观察溴酚蓝接近分离胶底部时，停止电泳；
[0063]
(5)电转：切下所需泳道的凝胶，剪取与胶相同大小的pvdf膜(pvdf膜预先在甲醇中浸泡5min)，于电转液中300ma,90min进行电转；
[0064]
(6)封闭：将膜置于用tbst稀释的5％脱脂奶粉封闭液中，室温封闭1h。弃封闭液，tbst洗膜10minx3次；
[0065]
(7)敷一抗：加入相应浓度的一抗，4℃摇床过夜。去一抗，tbst洗膜10minx3次；
[0066]
(8)敷二抗：加入适当浓度的二抗，室温摇床上孵育1h。弃二抗，tbst洗膜10minx3次；
[0067]
(9)显色：进行ecl显色，保持膜蛋白面朝上，滴加发光液后，用多功能成像仪成像；
[0068]
(10)进行条带整合灰度比例测定及结果统计。
[0069]
f.脊髓组织石蜡切片免疫荧光染色
[0070]
(1)在49℃的烤箱中加热玻片20分钟(确保玻片干燥后再进行下一步)；
[0071]
(2)常规脱蜡至水，二甲苯脱蜡5min
×
3次，用乙醇逐渐水合物(100％、95％、80％、70％、自来水)(确保二甲苯中无液滴)；
[0072]
(3)pbs洗片5min
×
3次；
[0073]
(4)用沸水柠檬酸缓冲液(ph6.0)在微波炉中进行抗原修复20分钟(3.82g柠檬酸+2.412g柠檬酸钠+1l水，10n naoh调节ph至6.0)；
[0074]
(5)慢慢冷却到室温；
[0075]
(6)用pbsx3洗涤，每次5min；
[0076]
(7)用pap笔圈出组织部分；
[0077]
(8)含有10％血清1％triton x-100封闭液室温下封闭1小时(20℃-30℃)；
[0078]
(9)用封闭液稀释两种不同种属来源的一抗，4℃孵育过夜；
[0079]
(10)pbs洗片5min
×
3次；
[0080]
(11)alexa fluo 555(1:300)、alexa fluo 488(1:100)连接的二抗在常温下(20℃-30℃)孵育1小时；
[0081]
(12)pbs 5min x3次；
[0082]
(13)采用含有dapi的封片液进行封片。封片液:pbs和甘油(4:1)(包含1.5μg/ml dapi)；
[0083]
(14)荧光显微镜下观察。
[0084]
g.统计分析
[0085]
所有统计结果以均数
±
标准差表示。使用graphpad prism 8软件(graphpad software inc.)对两组以上进行比较，使用单因素方差分析进行统计分析，或使用未配对学生t检验对两组进行比较。以p《0.05为差异有统计学意义(以*p《0.05或**p《0.01表示)。
[0086]
三、结果分析：
[0087]
参阅图1所示，图1中的a图为不同组的足迹分析图，b图为不同组的bbb运动得分图，中药组合物干预可以促进小鼠后肢功能的恢复，c图为损伤后14天纵切面h&e染色图，用以详细描述损伤脊髓的组织学形态，参阅c图，sci组与sham组比较，脊髓损伤后第14天损伤部位出现明显的畸形和空洞，而在bshx组中病变面积明显减少且组织损伤较小，d图为对各
组中存活神经元进行尼氏染色，经所述中药组合物干预后的bshx组的损伤区神经元数量明显增加，说明本发明所述中药组合物干预可以减轻组织损伤，保护损伤区神经元，促进小鼠运动功能恢复。但是关于所述中药组合物干预修复脊髓损伤的相关机理并不清楚。
[0088]
图2显示了h&e染色后的损伤脊髓的组织学形态，从图2可以看出，脊髓损伤3天后，sci组的h&e染色显示损伤区出现组织缺损以及损伤半影区出现空洞，而bshx组位于损伤半影区的组织结构与sci组相比相对完整，空洞明显减少，同时在干预7天后，bshx组损伤区域明显减小，且位于损伤中心位置的细胞明显增多，说明本发明所述中药组合物干预可以促进伤口的愈合。
[0089]
脊髓损伤发生后，星形胶质被激活，少突胶质细胞前体和神经干细胞开始增殖并向损伤区迁移，星形胶质细胞是胶质瘢痕胶质部分的主要组成细胞。参阅图3所示，图中，gfap是星形胶质细胞的标志物，从图中可见，sci组中gfap表达相对sham组显著升高，而bshx组的损伤区和半影区中gfap表达显著降低，表明所述中药组合物干预后星形胶质细胞减少，可见，本发明所述中药组合物干预能够抑制脊髓损伤引起的反应性星形胶质细胞增殖，有利于胶质瘢痕面积的缩小。
[0090]
参阅图4所示，图中，nestin是神经干细胞的标志物，从图中可见，sci组3天后，在损伤中心未检测到nestin的表达，损伤半影区检测到少量nestin的表达，7天后，损伤中心位置检测到nestin的微量表达；而bshx组3天后，在bshx组损伤中心位置可以检测到nestin的表达，7天后损伤中心位置nestin阳性细胞增多，说明所述中药组合物能够促进神经干细胞向损伤区迁移，这有利于伤口愈合并减小瘢痕面积。
[0091]
同时，损伤脊髓的胶质瘢痕的形成和轴突的生成对脊髓损伤后的运动功能恢复至关重要，因此，本发明还采用免疫荧光检测法研究了损伤脊髓的胶质瘢痕和轴突的再生，参阅图5所示，图中，fs是胶质瘢痕的纤维部分(fibrotic scar)，gfap是星形胶质细胞的标志物，map2是成熟神经元树突标志物，从图5中的a图可以看出，sci组14天后，map2免疫荧光显示神经发生丢失，并形成由星形胶质细胞构成的胶质瘢痕和胶质瘢痕包围的纤维瘢痕，而bshx组的神经丢失区域明显减小，且由星形胶质包围的纤维部分瘢痕面积缩小。
[0092]
参阅图5所示，图中，gap43是新生轴突的标志物，其与神经再生密切相关，在引导轴突生长和调节轴突新连接的形成中起着关键作用，从图5中的b图可以看出，sci组14天后，在gfap标记的胶质瘢痕区域很少检测到gap43阳性轴突，而bshx组的gap43阳性轴突增多，说明本发明中药组合物干预后促进损伤区轴突再生。
[0093]
结合图5中a图和b图，经本发明所述中药组合物干预的bshx组与sci组相比，bshx组的神经丢失的脊髓距离明显缩短，而sci组可见明显周围星形胶质细胞活化的胶质瘢痕，病变部位未见map2阳性轴突；与sci组比较，bshx组胶质瘢痕面积明显减少，胶质瘢痕边缘被激活的星形胶质细胞包围，不像sci组那样明显，表明所述中药组合物干预可抑制反应性星形胶质细胞增生，用以防止星形胶质细胞在病变半暗区形成密集排列和粘连的重叠壁。
[0094]
参阅图6所示，图中的cd68是m1样小胶质细胞激活标志物，mbp是神经系统中少突胶质细胞和雪旺细胞髓鞘的主要成分，结果显示，sci组14天后，位于损伤区的小胶质细胞被激活，且由星形胶质细胞包围的纤维化瘢痕中很少见mbp阳性轴突，，而bshx组的损伤区内激活的小胶质细胞细胞明显减少，且mbp表达升高，表明所述中药组合物干预可抑制小胶质细胞的激活，并激活再髓鞘化。
[0095]
同时，脊髓损伤后，少突胶质细胞直接坏死和凋亡，导致轴突脱髓鞘，因此，髓鞘再生对脊髓损伤后轴突功能恢复具有重要意义，m1样巨噬细胞在损伤早期占主导地位并引发继发性损伤，m1样和m2样巨噬细胞之间的转变影响脊髓损伤后的髓鞘再生。参阅图7所示，图7中的a图和b图显示了脊髓损伤14天后脊髓病变部位iba-1/cd163或cd68/cd163的免疫荧光染色。结合图7可以看出，在sci组中脊髓病变部位小胶质细胞数量增多，被激活，m1巨噬细胞数量增多，少量m2样巨噬细胞而在bshx组中，脊髓病变部位m1样巨噬细胞的数量和分布明显减少且m2样巨噬细胞数量增多，表明所述中药组合物干预促进小胶质细胞向m2样巨噬细胞转变。
[0096]
体内实验，我们证明所述中药组合物干预促进nscs增殖并向损伤部位迁移，通过体外实验验证中药组合物干预对nscs的影响。参阅图8所示，图8中的brdu标记增值的nscs，通过检测brdu标记便能准确地反映细胞的增殖情况。结果显示不同浓度(1、10、100ug/ml)bshx可不同程度促进nscs的增值，且成浓度梯度。b图为增值的nscs的百分比。说明本发明中药组合物干预后促进nscs的增值。
[0097]
参阅图9所示，图中gfap是星型胶质细胞的标志物，neun是神经元的标记物，图9中的a图和c图显示了gfap或者neun的免疫荧光染色，b图和d图为a图和c图的统计图。结合a图-d图可以看出，不同浓度(1、10、100ug/ml)bshx可不同程度促进nscs向神经元方向分化，抑制nscs向星型胶质细胞方向分化。
[0098]
综上所述，本发明的中药组合物(由黄芪、巴戟天、仙茅、丹参、赤芍、当归、鸡血藤、川芎、熟附子组成)干预治疗脊髓损伤后具有抑制反应性星形胶质细胞增生，促进神经干细胞向损伤区迁移的能力，使小胶质细胞向m2样巨噬细胞转变，从而降低炎症反应，促进伤口愈合，减小胶质瘢痕面积，有利于再髓鞘化和轴突再生，促进神经分化与再生，因此，发挥了神经保护作用，并为功能恢复创造了有利条件。
[0099]
以上借助具体实施例对本发明做了进一步描述，但是应该理解的是，这里具体的描述，不应理解为对本发明的实质和范围的限定，本领域内的普通技术人员在阅读本说明书后对上述实施例做出的各种修改，都属于本发明所保护的范围。