1.本发明属于多肽衍生物合成技术领域，具体涉及一种用于皮肤复新的肌肽衍生物及其用途。
背景技术：
2.在自然衰老或光致衰老期间，皮肤尤其是真皮会受到许多变异和各种类型的损害，在皮肤上发生许多的不利变化。这些不利变化是由皮肤的内稳态功能紊乱造成的，特别是成纤维细胞的新陈代谢功能紊乱。在细胞水平上，真皮的主要细胞类型特别是成纤维细胞、以及表皮的主要细胞类型例如角化细胞的生理机能或新陈代谢的不利变化会导致衰老。在组织水平上，衰老通过表皮的构架、血液输送和神经支配系统的破坏以及各种类型新陈代谢例如涉及屏障功能平衡的新陈代谢过程的减缓表现出来。皮肤细胞尤其是成纤维细胞新陈代谢的这种反常能够通过微形貌中的不利变化、皱纹和细线的出现、紧实度和弹性的下降等皮肤力学性能的不利变化、皮肤色泽的不利变化和皮肤的表面年龄反映出来。
3.因而研发出能够有效作用于皮肤细胞尤其是成纤维细胞的可利用产品，限制皮肤不利的变化，预防、减小和/或延缓皮肤衰老的迹象，便显得尤为重要。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种用于皮肤复新的肌肽衍生物及其用途，该肌肽衍生物具有更加优异的抗氧化活性，进一步增加胶原蛋白的合成，改善皮肤弹性；且具有更好的抗老化作用，直接清除老化皮肤细胞，刺激皮肤细胞的再生，可广泛应用于功能性化妆品的原材料。
5.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：式i所示的化合物：i；其为式ii所示的肌肽与甘西鼠尾草酸甲的衍生物，
ii。
6.本发明制得的式i所示化合物是经过化学修饰的肌肽衍生物，其中肌肽的氨基端（-nh2）与甘西鼠尾草酸甲结构中的羧基发生酰胺化反应，得到n-取代酰胺类肌肽衍生物，这种氨基端改变提供了显著不同的化学特性、代谢稳定性以及生物学特性，能够获得比肌肽更高的功效。本发明制得的肌肽衍生物具有更高的抗氧化活性；能够更有效地刺激细胞外基质组分的形成，促进前胶原c内肽酶增强子的表达，通过增进胶原蛋白的合成显著改善皮肤皱纹和弹力。同时，有效地引起成纤维细胞的收缩，进而增强真皮的致密化，预防或减少皮肤皱纹的产生，降低皮肤紧实度的损失，从而刺激皮肤的更新，有效对抗皮肤衰老；且本发明制得的肌肽衍生物既能增强巨噬细胞对老化细胞的监督功能，又可直接清除老化的皮肤细胞，同时还可有效抑制sasp因子的表达，具有更加优异的抗衰老作用。本发明制得的肌肽衍生物可广泛用作功能性化妆品的原材料，有利于预防或改善与皮肤衰老相关的功能失调，无论是时间生物学相关的皮肤衰老还是光生物学相关的衰老；且能够改善皮肤或粘膜的状态，使皮肤复新，治疗受损的皮肤或粘膜，修复萎缩的组织。
7.式i所示化合物的制备方法，包括：上述化合物的衍生作用通过肌肽的氨基基团与甘西鼠尾草酸甲的羧酸基团之间形成酰胺键实现。
8.更进一步地，式i所示肌肽衍生物的制备方法为公开的现有技术，以甘西鼠尾草酸甲和肌肽为原料，经羧基活化、成酰胺两步“一锅法”合成，反应产物经甲醇/二氯甲烷柱层析纯化得到肌肽衍生物。
9.作为优选，cdi作为羧基活化试剂。
10.作为优选，甘西鼠尾草酸甲和肌肽的摩尔比为1∶0.9~1.2；甘西鼠尾草酸甲与羧基活化试剂的摩尔比为1∶1.2~1.5。
11.化妆品组合物，其包括式i所示化合物或其美容上可接受的盐或赋形剂或佐剂。
12.作为优选，上述化妆品组合物还包括香兰素。
13.作为优选，上述化妆品组合物中式i所示化合物与香兰素的质量比为1∶0.6~1.2。
14.作为优选，上述组合物包括如下功效：-抗氧化；-促胶原蛋白合成活性；-抗衰老活性。
15.作为优选，组合物通过外部局部途径用于刺激、修复或调节皮肤细胞及半粘膜细胞的新陈代谢。
16.作为优选，含有式i所示的肌肽衍生物的皮肤外用组合物的制造方法并不限定于上述制造方法，只要是具有本发明所属技术领域的通常知识的人员都可以通过对上述制造方法做出部分变形，制造出含有上述肌肽衍生物的皮肤外用组合物。
17.本发明的又一目的在于，提供了式i所示化合物和香兰素在制备能够刺激皮肤或粘膜中一种或多种细胞外基质成分形成的化妆品中的用途。本发明采用香兰素与肌肽衍生物复配使用，可有效增强本发明制得的肌肽衍生物的功效，进一步促进肌肽衍生物的抗氧化活性、抗衰老活性以及皮肤复新活性，更好地发挥其皮肤修复功能。
18.本发明还公开了香兰素在增强式i所示化合物的皮肤修复功效中的用途。
19.作为优选，香兰素由式iii所示化合物替代，iii。
20.本发明采用虫草素对香兰素进行化学修饰得到香兰素衍生物，可有效增强其生物活性，进一步增强其对酪氨酸酶的抑制，减少黑色素的形成，对皮肤具有更加优异的美白功效；同时对sasp因子的表达也具有一定的抑制活性，能够预防或改善皮肤衰老现象。将其与本发明制得的肌肽衍生物复配使用，具有更加优异的皮肤修复、抗衰老效果。
21.更进一步地，式iii所示香兰素衍生物的制备方法，包括：将虫草素溶于乙醇/水（v/v，1∶0.6~1）中，加入香兰素，加热回流搅拌反应8~12 h；反应结束后，减压过滤、乙醇洗涤滤饼，干燥后得到中间体m；接着将其溶于甲醇中，室温下加入硼氢化钠，搅拌反应1.5~3 h；反应结束后，减压脱溶，加水溶解残余物，然后使用0.1 m盐酸调节ph值至3~3.5，之后加入乙酸乙酯分液萃取，无水硫酸钠干燥、硅胶柱层析分离纯化得到香兰素衍生物。
22.作为优选，虫草素与香兰素的摩尔比为1∶0.92~1.10；中间体m与硼氢化钠的摩尔比为1∶2~3。
23.作为优选，i所示化合物和式iii所示化合物用于对抗干枯的、松弛的、凹陷的和/或消瘦的皮肤，和/或增强和/或修复皮肤的弹性或紧实度。
24.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：本发明采用甘西鼠尾草酸甲修饰肌肽，得到n-取代酰胺类肌肽衍生物，具有更高的抗氧化活性；能够更有效地刺激细胞外基质组分的形成，促进前胶原c内肽酶增强子的表达，通过增加胶原蛋白合成，显著改善皮肤皱纹和弹力；有效地引起成纤维细胞的收缩，进而增强真皮的致密化，从而刺激皮肤的再生，有效对抗皮肤衰老；且本发明制得的肌肽衍生物可直接清除老化的皮肤细胞，同时还可有效抑制sasp因子的表达，具有更加优异的抗衰老作用。此外，本发明采用虫草素对香兰素进行化学修饰得到香兰素衍生物，能够进一步增强对酪氨酸酶的抑制，减少黑色素的形成；同时对sasp因子的表达也具有一定的抑制活性，预防或改善皮肤衰老现象；将其与本发明制得的肌肽衍生物复配使用，具有更加优异的皮肤修复、抗衰老效果。本发明制得的肌肽衍生物可广泛应用于功能性化妆品的原材料。
25.因此，本发明提供了一种用于皮肤复新的肌肽衍生物及其用途，该肌肽衍生物具有更加优异的抗氧化活性，能进一步增强胶原蛋白的合成，改善皮肤弹性；且具有更好的抗老化作用，能够直接清除老化的皮肤细胞，刺激皮肤细胞的再生，可广泛用作功能性化妆品的原材料。
附图说明
26.图1为本发明实施例1中紫外吸收光谱的测试结果；图2为本发明实施例5中hacat细胞内sasp因子il-6和il-8的mrna表达水平；图3为本发明实施例5中hff-1细胞内sasp因子mmp-1和mmp-3的mrna表达水平；图4为本发明实施例6中前胶原c内肽酶增强子的mrna表达水平。
具体实施方式
27.以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：本发明实施例使用的人皮肤成纤维细胞系（hff-1）以及人单核细胞（thp-1）购自中国科学院细胞库；人表皮角质形成细胞系（hacat）购于美国sciencell公司。
28.本发明实施例所用肌肽衍生物的合成方法参照文献（sun, q.; burke, j. p.; phan, j.; burns, m. c.; olejniczak, e. t.; waterson, a. g.; lee, t.; rossanese, o. w.; fesik, s. w. angew. chem., int. ed. 2012, 51(25), 6140-6143）进行：以甘西鼠尾草酸甲和肌肽为原料，cdi作为羧基活化试剂，经羧基活化、成酰胺两步“一锅法”合成，反应产物经甲醇/二氯甲烷柱层析纯化得到肌肽衍生物；其中，甘西鼠尾草酸甲和肌肽的摩尔比为1∶0.96；甘西鼠尾草酸甲与羧基活化试剂的摩尔比为1∶1.36；产率为68.3%。
29.实施例1：本发明制得的肌肽衍生物的结构式如式i所示：i1h nmr (400 mhz, d2o), δ
ppm
: 8.91 (s, 1h, imi-h), 7.70 (s, 1h, imi-h), 8.16、6.44 (d, 2h, ch=ch), 6.80~6.86、6.95、8.07 (5h, ph-h), 5.71、4.69 (dd, 2h, ph-ch), 4.83 (dd, 1h, n-ch), 3.29、3.01 (m, 2h, imi-ch2), 3.55 (t, 2h, n-ch2), 2.61 (t, 2h, o=c-ch2)。hrms (esi): calcd for c
27h26
n4o
10
, m/z [m+h]
+
, 566.43。
[0030]
式i所示肌肽衍生物的紫外吸收光谱如图1所示，从图中可以看出本发明制得的肌肽衍生物在258 nm和312 nm处有紫外吸收峰。
[0031]
实施例2：式iii所示香兰素衍生物的制备：将虫草素溶于乙醇/水（v/v，1∶0.7）中，加入香兰素，加热回流搅拌反应10.5 h；反应结束后，减压过滤、乙醇洗涤滤饼，干燥后得到中间体m；接着将其溶于甲醇中，室温下加
入硼氢化钠，搅拌反应2.5 h；反应结束后，减压脱溶，加水溶解残余物，然后使用0.1 m盐酸调节ph值至3.4，之后加入乙酸乙酯分液萃取，无水硫酸钠干燥、硅胶柱层析分离纯化得到香兰素衍生物。其中，虫草素与香兰素的摩尔比为1∶1.05；中间体m与硼氢化钠的摩尔比为1∶2.4。产物的化学结构如下所示：iii1h nmr (400 mhz, dmso-d6), δ
ppm
: 8.41 (s, 1h, imi-h), 8.27 (s, 1h, pyr-h), 7.20 (d, 1h, ph-h), 6.94、6.89 (dd, 2h, ph-h), 6.19 (d, 1h, ep-h), 5.48、3.79、3.64 (s, 3h,
ꢀ‑
oh), 4.42 (s, 2h, ph-ch2), 4.09 (s, 1h, n-h), 3.97 (s, 3h, o-ch3), 3.92 (m, 1h, ep-h), 3.71 (m, 1h, ep-h), 3.86、3.61 (s, 2h, ep-ch2), 2.24、1.93 (m, 2h, ep-h)。hrms (esi): calcd for c
18h21
n5o5, m/z [m+h]+, 387.09。
[0032]
13
c nmr (150 mhz, dmso-d6), δ
ppm
: 157.6、155.1、152.5、150.2、148.7、142.3、136.9、125.0、122.1、117.4、111.5、101.6、83.3、76.1、64.2、58.7、45.0、36.9。
[0033]
实施例3：肌肽衍生物的细胞毒性测试将人角质形成细胞（hacat cell）以106/24 well的密度培养24 h，换成不含fbs的培养基继续进行24 h饥饿处理。添加终浓度为25 mm的生物活性物质，其中k1组添加实施例1得到的肌肽衍生物，k2组添加香兰素；k3组添加实施例1得到的肌肽衍生物+香兰素（两者质量比为1∶1）；k4组添加实施例2制得的香兰素衍生物；k5组添加实施例1得到的肌肽衍生物+实施例2制得的香兰素衍生物（两者质量比为1∶1）。药物处理24 h后除去培养基，每孔加入40 μl的5 mg/ml mtt溶液培养4 h，除去培养基，加入1 ml dmso（amresco，0231-500 ml）振荡12 min，每孔分别取200 μl用分光光度计测定540 nm处的吸光度，不含生物活性物质的溶剂作为对照组。按照下列公式计算细胞存活率：细胞存活率%=（药物处理组的吸光度/对照组的吸光度）
×
100%测试结果如表1所示：表1 衍生物的细胞毒性测试结果实验组细胞存活率/%k1组106k2组110k3组108k4组101k5组100从表1中数据可以看出，本发明制得的肌肽衍生物和香兰素衍生物均未对细胞产生毒性。
[0034]
实施例4：肌肽衍生物的抗氧化活性（对dpph稳定自由基的清除作用）实验组：在反应管中加入2 ml 0.2 mm dpph的乙醇溶液，终浓度为25 mm的生物活
性物质，混合均匀，室温避光反应40 min，在517 nm处读取吸光度。以2 ml dpph+2 ml pbs缓冲溶液混合后的吸光度为对照组，2 ml双蒸水+2 ml乙醇混合后的吸光度为正常组，按照下列公式计算清除率：清除率%=[1－(a
517实验组
－a
517正常组
)/a
517对照组
]
×
100%生物活性物质分组：k1组添加实施例1得到的肌肽衍生物，k2组添加香兰素；k3组添加实施例1得到的肌肽衍生物+香兰素（两者质量比为1∶1）；d1组添加肌肽。
[0035]
测试结果如表2所示：表2 衍生物的自由基清除率测试结果实验组清除率/%k1组56.8k2组19.7k3组81.4d1组24.5从表2中数据可以看出，k1组处理后的dpph自由基清除率明显高于d1组，表明本发明制得的肌肽衍生物具有更加优异的抗氧化作用。k3组的效果明显好于k2组和k1组，表明采用香兰素与肌肽衍生物复配使用，抗氧化效果更佳，香兰素的存在对肌肽衍生物抗氧化活性的发挥具有增效作用。
[0036]
实施例5：肌肽衍生物的抗衰老活性测试hacat细胞和hff-1细胞复苏、传代培养均为常规操作；巨噬细胞诱导分化：thp-1细胞以1
×
106个/ml接种于6孔板，加入终浓度为200 ng/ml的pma诱导6 h，弃掉培养基用pbs清洗，加入新鲜培养基，即得到巨噬细胞。
[0037]
实验组：k1组添加实施例1得到的肌肽衍生物，k2组添加香兰素；k3组添加实施例1得到的肌肽衍生物+香兰素（两者质量比为1∶1），k4组添加实施例2制得的香兰素衍生物，k5组添加实施例1得到的肌肽衍生物+实施例2制得的香兰素衍生物（两者质量比为1∶1）。对照组：d1组添加肌肽，d2组不添加任何活性物质。
[0038]
a. 巨噬细胞-hacat细胞共培养模型中对老化细胞的清除作用hacat细胞以4
×
104个/well接种于48孔板中，培养24 h后换成含250 μm t-bhp的无血清培养基孵育2 h诱导细胞老化，之后换成不含t-bhp的完全培养基培养12 h；按效靶比5∶1加入巨噬细胞，以及终浓度为25 mm的活性物质培养24 h，用spider-βgal标记sa-β-gal阳性的老化细胞（绿色荧光），用hoechst标记细胞核（蓝色荧光），于荧光倒置显微镜下观察带有绿色荧光的老化细胞数目。
[0039]
b. hacat细胞单独培养模型中对老化细胞的清除作用hacat细胞以4
×
104个/well接种于48孔板中，培养24 h后换成含250 μm t-bhp的无血清培养基孵育2 h诱导细胞老化，之后换成不含t-bhp的完全培养基培养12 h；加入终浓度为25 mm的活性物质培养24 h，用spider-βgal标记sa-β-gal阳性的老化细胞（绿色荧光），用hoechst标记细胞核（蓝色荧光），于荧光倒置显微镜下观察带有绿色荧光的老化细胞数目。
[0040]
c. 在巨噬细胞-hff-1细胞共培养模型上对老化细胞的清除作用hff-1细胞以4.5
×
103个/well接种于48孔板中，培养48 h后换成含300 μm t-bhp
的无血清培养基孵育2 h诱导细胞老化，之后换成不含t-bhp的完全培养基培养12 h；按效靶比5∶1加入巨噬细胞，以及终浓度为25 mm的活性物质培养24 h，用spider-βgal标记sa-β-gal阳性的老化细胞（绿色荧光），用hoechst标记细胞核（蓝色荧光），于荧光倒置显微镜下观察带有绿色荧光的老化细胞数目。
[0041]
d. 在hff-1细胞单独培养模型上对老化细胞的清除作用hff-1细胞以4.5
×
103个/well接种于48孔板中，培养48 h后换成含300 μm t-bhp的无血清培养基孵育2 h诱导细胞老化，之后换成不含t-bhp的完全培养基培养12 h；加入终浓度为25 mm的活性物质培养24 h，用spider-βgal标记sa-β-gal阳性的老化细胞（绿色荧光），用hoechst标记细胞核（蓝色荧光），于荧光倒置显微镜下观察带有绿色荧光的老化细胞数目。
[0042]
以上对老化细胞清除作用的测试结果显示，肌肽在巨噬细胞-hacat细胞或巨噬细胞-hff-1细胞共培养模型中具有极强的清除老化作用，但在hacat细胞或hff-1细胞单独培养模型中未能显示清除老化细胞的活性；而本发明制得的肌肽衍生物在巨噬细胞-hacat细胞或巨噬细胞-hff-1细胞的共培养模型中具有极强的清除老化细胞的作用，在hacat细胞或hff-1细胞单独培养模型中也显示出良好的清除老化细胞的活性，表明本发明制得的肌肽衍生物既能增强巨噬细胞的老化监督功能，又能直接清除老化的皮肤细胞。
[0043]
e. 肌肽衍生物对老化的hacat细胞/hff-1细胞内sasp因子表达水平的影响hacat细胞以3.5
×
105个/well接种于6孔板中，加入含250 μm t-bhp的无血清培养基孵育2 h以诱导细胞老化，之后换成不含t-bhp的完全培养基培养12 h；接着加入终浓度为25 mm的活性物质培养12 h，裂解细胞提取总rna，并采用qpcr法检测其中il-6和il-8的mrna表达水平。
[0044]
hff-1细胞以2
×
105个/well接种于6孔板中，加入含300 μm t-bhp的无血清培养基孵育2 h以诱导细胞老化，之后换成不含t-bhp的完全培养基培养12 h；接着加入终浓度为25 mm的活性物质培养12 h，裂解细胞提取总rna，并采用qpcr法检测其中的mmp-1和mmp-3的mrna表达水平。
[0045]
rna提取及定量检测：收集细胞，采用thermo k0731 rna抽提试剂盒提取rna；向多功能酶标仪的微孔板中加入2 μl ddh2o标定，再取2 μl 提取的rna加入微孔板中检测rna浓度及a260/a280比值。结果显示，所提取的rna样品的a260/a280比值均在1.9~2.1范围内，符合实验要求。
[0046]
反转录：按照primescript
tm
逆转录试剂盒说明书进行反转录反应，总体系为20 μl，其中5
×
primescript rt master mix 4 μl，rna样品 1 μg，rnase free ddh2o补齐至20 μl。反应条件为37℃、15 min；85℃、5 s；反应结束后4℃保存待用。
[0047]
qrcr扩增反应：反应体系如下所示。
[0048]
powerup
tm sybr
tm green master mix 5 μlforward primer（10 μm） 0.4 μlreverse primer（10 μm） 0.4 μlcdna模板 0.8 μlrnase free ddh2o 3.4 μltotal 10 μl
扩增程序为：50℃下udg活化55 s；95℃预变性2 min；pcr扩增循环40次：95℃、14 s，60℃、65 s；溶解曲线分析。
[0049]
结果分析：采用相对定量2-δδct
（rq值）表示实验组与空白组之间目的基因表达倍数的差异。其中，δct=ct
目的基因
－ct
内参基因
，δδct=δct
实验组
－δct
空白组
，空白组rq值为1。
[0050]
表3 qpcr所用的引物序列测试结果如图2和图3所示。
[0051]
图2为生物活性物质对老化的hacat细胞内sasp因子il-6和il-8的mrna表达水平的影响，从图中分析可知，k1组中本发明制得的肌肽衍生物能显著降低il-6和il-8的表达水平，k4组中的香兰素衍生物对il-6和il-8的表达水平也具有一定的下调作用，但k2组的香兰素和d1组的肌肽显然对老化hacat细胞内sasp因子的表达不产生影响，表明本发明制得的肌肽衍生物和香兰素衍生物均具有抑制老化hacat细胞内部分sasp因子表达的效果。此外，k3组的效果要好于k1组，表明将本发明制得的衍生物与香兰素复配使用，香兰素对肌肽衍生物起到增效的作用，可进一步增强对老化hacat细胞内部分sasp因子表达的抑制作用。k5组效果远好于其它组，表明肌肽衍生物与香兰素衍生物复配使用，对老化hacat细胞内部分sasp因子表达的抑制作用更佳，说明肌肽衍生物的存在对香兰素衍生物抑制sasp因子表达活性具有增效作用。
[0052]
图3为生物活性物质对老化的hff-1细胞内sasp因子mmp-1和mmp-3的mrna表达水平的影响，从图中分析可知，k1组中本发明制得的肌肽衍生物能显著降低mmp-1和mmp-3的表达水平，k4组中的香兰素衍生物对mmp-1和mmp-3的表达水平也具有一定的下调作用，但k2组的香兰素和d1组的肌肽显然对老化hff-1细胞内sasp因子的表达不产生影响，表明本发明制得的肌肽衍生物和香兰素衍生物均具有抑制老化hff-1细胞内部分sasp因子表达的效果。此外，k3组的效果要好于k1组，表明将本发明制得的衍生物与香兰素复配使用，香兰素对肌肽衍生物起到增效的作用，可进一步增强对老化hff-1细胞内部分sasp因子表达的抑制作用。k5组效果远好于其它组，表明肌肽衍生物与香兰素衍生物复配使用，对老化hff-1细胞内部分sasp因子表达的抑制作用更佳。
[0053]
综上所述，本发明制得的肌肽衍生物既能增强巨噬细胞的老化监督功能，又可直接清除老化的皮肤细胞，同时还可有效抑制sasp因子的表达，具有更加优异的抗衰老作用。且制备的香兰素衍生物也对sasp因子的表达具有一定的抑制活性。
[0054]
实施例6：肌肽衍生物对前胶原c内肽酶增强子（pcolce）表达的影响正常的第8代人皮肤成纤维细胞用杜尔贝科改良依格尔培养基dmem、10%胎牛血清、1%抗菌-抗真菌剂（antibiotic-antimycotic，gibco，cat.#15240-062）于37℃、5% co2条件下培养，人皮肤成纤维细胞覆盖率达到80%以上时换成无fbs的dmem培养基，以4
×
105个/well接种于96孔平板中，加入终浓度为25 mm的生物活性物质（对照不添加生物活性物质），继续培养6 h；收集细胞用pbs溶液洗涤，提取mrna用qpcr法分析标志物的表达。生物活性物质的处理分组及检测的具体操作等参照实施例3所述内容。
[0055]
测试结果如图4所示。从图中分析可知，k1组中本发明制得的肌肽衍生物同d1组的肌肽相比能显著提升pcolce的mrna表达水平，k4组中的香兰素衍生物同k2组的香兰素显然对pcolce的mrna表达基本不产生影响，表明本发明制得的肌肽衍生物可促进前胶原c内肽酶增强子的表达。此外，k3组的效果要好于k1组，表明将本发明制得的肌肽衍生物与香兰素复配使用，其中的香兰素能对肌肽衍生物起到增效的作用，进一步增强肌肽衍生物促进前胶原c内肽酶增强子表达的活性。k5组效果远好于其它组，表明肌肽衍生物与香兰素衍生物复配使用，对前胶原c内肽酶增强子表达的促进作用更佳。
[0056]
实施例7：肌肽衍生物对成纤维细胞收缩的影响真皮等同物模型：通过正常的人类成纤维细胞移植在胶原蛋白基质（i型胶原蛋白，市购溶液）中构建。
[0057]
从人体皮肤外植体上分离真皮成纤维细胞，在含10%胎牛血清、2 mm l-谷氨酰胺、50 u/ml青霉素和50 μg/ml链霉素的dmem培养基中培养至第8代使用。
[0058]
参考asselineau等在exp. cell. res., 1985, 159, 536-539描述的方法以及models in dermatology, 1987, vol. 3, 1-7描述的方法制备真皮等同物：mem培养基中加入1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸钠，1%两性霉素b和1%青霉素、10%胎牛血清和5% naoh，导入冰浴的50 ml离心管内，以3
×
105个细胞/ml加入成纤维细胞。将体积比为1/1000的胶原蛋白和醋酸的混合物沿管壁缓慢加入，观察到带白色的云状物出现；仔细混合，以2 ml/well的比例分装于12孔培养板中，得到6
×
104个细胞/well的真皮等同物。培养板于37℃、5% co2条件下培养以形成胶原蛋白聚合，3 d时将真皮等同物从支撑物上脱离，以便开始收缩，并拍摄图像测量其表面积。更换培养基，加入生物活性物质进行处理，培养5 d后拍摄图像。真皮等同物的表面积使用nis-elements软件（基本版3.10）进行测量，按照下列公式计算收缩的百分比：收缩%＝(sb－s
t
)/sb×
100式中，sb为培养板中培养孔的表面积，对应于真皮等同物收缩之前的总表面积；s
t
为收缩动力学的t时刻时真皮等同物的表面积。
[0059]
生物活性物质的处理：在mem培养基中添加终浓度为25 mm的生物活性物质（对照不添加生物活性物质），实验组：k1组添加实施例1得到的肌肽衍生物，k2组添加香兰素，k3组添加实施例1得到的肌肽衍生物+香兰素（两者质量比为1∶1），k4组添加实施例2制得的香兰素衍生物，k5组添加实施例1得到的肌肽衍生物+实施例2制得的香兰素衍生物（两者质量
比为1∶1）；对照组：d1组添加肌肽，d2组不添加活性物质。
[0060]
测试结果如表4所示：表4 衍生物相关收缩率测试结果实验组收缩/%k186.8k2100k378.4k4100k585.7d199.3d2100从表4中数据可以看出，k1组中本发明制得的肌肽衍生物处理后真皮等同物的收缩效果好于d1组，表明本发明制得的肌肽衍生物具有优异的促进真皮收缩的作用，且这种作用至少持续5 d以上；有效证明了肌肽衍生物在刺激、修复/调节皮肤老年细胞的新陈代谢以及预防/治疗衰老皮肤迹象中的活性。此外，k3组的效果要好于k1组，表明将本发明制得的肌肽衍生物与香兰素复配使用，香兰素对肌肽衍生物起到增效的作用，可进一步增强其促进真皮收缩的功效。
[0061]
实施例8：肌肽衍生物对酪氨酸酶的抑制作用称取4 g丙酮粉加入80 ml pbs缓冲液（ph=6.5）中，在-2℃下磁力搅拌匀浆45 min，-2℃、12500 r/min离心35 min，取上清液即得酪氨酸酶粗提液。酪氨酸酶以邻苯二酚为底物时最大吸收波长为425 nm。
[0062]
用pbs缓冲液（ph=6.5）分别配制25 mm的生物活性物质溶液，在比色杯中按顺序加入0.1 ml酪氨酸酶粗提液、0.1 ml生物活性物质溶液，再加入2.8 ml邻苯二酚（0.2 m），立即于425 nm处扫描od值（0.2 ml双蒸水加2.8 ml邻苯二酚（0.2 m）为对照）。按照下列公式计算酪氨酸酶的抑制率：抑制率%=(a-b)/a
×
100%式中，a为对照组于425 nm处的od值；b为生物活性物质处理组于425 nm处的od值。
[0063]
实验组：k1组配置的生物活性物质为实施例1得到的肌肽衍生物，k2组为香兰素；k3组为实施例1得到的肌肽衍生物+香兰素（两者质量比为1∶1），k4组为实施例2制得的香兰素衍生物，k5组为实施例1得到的肌肽衍生物+实施例2制得的香兰素衍生物（两者质量比为1∶1），k6组为虫草素；对照组：d1组为肌肽。
[0064]
测试结果如表5所示：表5 衍生物相关抑制率测试结果实验组抑制率/%k184.8k24.6k390.9k482.1k596.7
k660.5d184.3从表5中数据可以看出，k1组中本发明制得的肌肽衍生物对酪氨酸酶的抑制率与d1组无显著差异，表明本发明制得的肌肽衍生物对黑色素无显著的抑制增强效果。此外，k3组的效果要好于k1组，表明香兰素同肌肽衍生物复配使用能够起到增效的作用，增强肌肽衍生物对黑色素的抑制效果。k4组对酪氨酸酶的抑制率显著高于k2组和k6组，表明本发明制备的香兰素衍生物可有效增强其对黑色素的抑制活性。
[0065]
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
[0066]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。