一种基于纳米双醛淀粉载体的固定化calb制备方法
技术领域
1.本发明涉及一种纳米双醛淀粉作为载体的固定化酶制备方法，尤其涉及一种将calb固定到纳米双醛淀粉与fe3o4复合载体的方法。


背景技术：

2.calb因其具有高效催化、高选择性、反应条件温和、对环境友好等特点而被广泛应用于各种工业应用。但游离态的calb由于稳定性差、无法重复使用、参与反应后难以从反应体系中分离等缺点，其应用受到了限制。
3.酶的固定化技术可以有效地解决上述问题。在固定化技术中，载体材料的选取对于固定化酶是十分重要的。载体材料上的活性基团、微环境、载体的形状大小等因素，会影响载体与酶的亲和力，固定化酶活力、稳定性、重复使用性及应用效果。相较于其他纳米材料，磁性纳米材料在制备固定化酶方面更具优势。磁性纳米材料不仅具有纳米材料的优点，还具有超顺磁性和高磁化率等特性，可以通过改变磁场使固定化酶定向移动。在酶的固定化过程中，我们一般采取交联法。交联是利用双功能或多功能交联剂将酶与载体之间发生交联反应形成网状结构进而来固定酶的方法。戊二醛因其具有价格低廉、交联效果好的优点而在酶的固定化过程中被广泛应用作交联剂。但由于戊二醛除了作为交联剂，将酶与载体交联外。还会侵占酶的活性位点使其形成刚性的吡啶环，破坏酶的构像，使其失活。并且由于其具有毒性限制了其应用。选取一种无毒、对于酶没有消极影响的交联剂已经成为了一种趋势。利用将多糖材料改性的手法，赋予多糖材料醛基的方式可以有效地取代戊二醛作为交联剂应用于酶的固定化过程。双醛淀粉是一种由淀粉在高碘酸钠作用下将2-c，3-c上的羟基氧化成醛基的改性淀粉。双醛淀粉由于其无毒、含有多活性醛基的特点多应用于化妆品、医药行业中。因此，将双醛淀粉替代戊二醛可以有效减少calb的损失，提高固定化酶的使用效率，减少经济损失。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对现有方法的不足，提供一种纳米双醛淀粉作为载体的固定化酶制备方法，通过使用纳米双醛淀粉代替戊二醛作为交联剂，有效固定calb的同时，更多的保留calb的酶活力。
5.本发明采用纳米fe3o4作为载体核心，以纳米双醛淀粉作为交联剂，将calb固定到以fe3o4为核心的复合载体上。与其他固定化方法相比具有更高的酶活力保留率以及更高的重复使用性。
具体实施方式：
6.具体实施方式一：
7.制备纳米淀粉颗粒。反应前将蜡质玉米淀粉放置于30℃的真空干燥箱中2h。取出后称量10g烘干后的蜡质玉米淀粉，放置于400ml的去离子水中，并在500ml规格的烧杯中投
入规格为4cm的转子，并在杯口覆盖保鲜膜，防止水分损失。将混合物在95℃，转速为400rpm的磁力水浴锅中加热1h，使蜡质玉米淀粉完全糊化。待反应完成，将糊化的蜡质玉米淀粉悬浊液冷却至室温后，将悬浊液以2ml/min缓慢倒入2000ml无水乙醇中并在600rpm不断搅拌除去水分。待完全洗涤后，利用离心机转速为3000rpm将上清液分离出来，取出沉淀物，分置平铺于平面皿中，放入35℃的真空干燥箱干燥1h，干燥完成后仍放置于真空干燥箱中备用。
8.具体实施方式二：
9.纳米双醛淀粉颗粒的制备，取制备出的纳米淀粉颗粒8g加入装有100g水的烧瓶中，加入0.32g高钾酸钠，并加入规格为3cm的转子。用0.5m的硫酸调节悬浮液的ph至3.5，在黑暗环境下，30℃水浴，转速为160rpm反应4h。反应结束后，用去离子水和无水乙醇交替洗涤3次，洗涤完成后真空干燥箱30℃干燥1h备用，得到纳米双醛淀粉。
10.具体实施方式三：
11.采用共沉淀法将5.4g的fecl3·
6h2o固体与1.99g的fecl2·
4h2o以摩尔比为2：1溶于100ml超纯水中并持续通入氮气排出空气。加入规格为3cm转子，转速为160rpm，待溶液完全溶解后，在氮气环境下将反应溶液加热至70℃。然后在反应体系中加入20ml氨水，防止反应物飞溅将转速缓慢增大至270rpm，继续滴加氨水调节反应体系ph值≥10，升温至80℃反应1h，最后将溶液冷却至室温后，用永磁体将fe3o4纳米颗粒分离，用乙醇和去离子水交替洗涤3次至中性，放置于真空干燥箱55℃干燥2h，得到fe3o4纳米颗粒。
12.具体实施方式四：
13.将1.0g的纳米双醛淀粉(测定其醛基含量为25.1％)溶解于含有500ml超纯水的烧杯中，加入fe3o4磁性纳米粒子2.0g并超声处理使其均匀分散。待分散后向反应体系中加入0.2ml的环氧氯丙烷，并在烧杯口覆盖保鲜膜防止液体蒸发，在40℃的恒温振荡箱中振摇5h，速度为160rpm。反应结束后用无水乙醇和去离子水交替洗涤三次，放置于40℃的真空烘箱中干燥1h。得到以fe3o4磁性核心的纳米双醛淀粉包覆的载体。
14.具体实施方式五：
15.将制备得到的载体用0.1m ph 7.0磷酸缓冲液进行3次洗涤，并放置于磷酸缓冲溶液中浸泡1h备用。将1g双醛淀粉纳米颗粒加入0.1m ph 7.0 200ml磷酸盐缓冲液。再将50ml的6％含酶量calb酶液加入反应体系中。混合溶液在恒温振荡箱中以一定的温度振荡一段时间，振动箱转速为150rpm。反应结束后，磁分离法分离上清液，用0.1mph 7.0磷酸缓冲液反复洗涤磁颗粒，再用去离子水反复洗涤磁颗粒表面。洗涤后将得到的产物放置于40℃真空干燥箱中4h即得到一种基于纳米双醛淀粉载体的固定化calb。


技术特征：
1.一种基于纳米双醛淀粉载体的固定化calb制备方法，其特征在于利用纳米双醛淀粉取代戊二醛在固定化酶交联剂的作用，消除在交联过程中对于酶的破坏作用以及使固定后的calb更具有重复使用性并通过以下步骤实现：步骤一：制备纳米淀粉颗粒；反应前将蜡质玉米淀粉放置于30℃的真空干燥箱中2h；取出后称量10.0g烘干后的蜡质玉米淀粉，放置于400ml的去离子水中，并在500ml规格的烧杯中投入规格为4cm的转子，并在杯口覆盖保鲜膜，防止水分损失；将混合物在95℃，转速为400rpm的磁力水浴锅中加热1h，使蜡质玉米淀粉完全糊化；待反应完成，将糊化的蜡质玉米淀粉悬浊液冷却至室温后，将悬浊液以2ml/min缓慢倒入2000ml无水乙醇中并以600rpm不断搅拌除去水分；待完全洗涤后，利用离心机转速为3000rpm将上清液分离出来，取出沉淀物，分置平铺于平面皿中，放入35℃的真空干燥箱干燥1h，干燥完成后仍放置于真空干燥箱中备用；步骤二：纳米双醛淀粉颗粒的制备，取制备出的纳米淀粉颗粒8g加入装有100g水的烧瓶中，加入0.32g高钾酸钠，并加入规格为3cm的转子；用0.5m的硫酸调节悬浮液ph至3.5，在黑暗环境下，30℃水浴，转速为160rpm反应4h；反应结束后，用去离子水和无水乙醇交替洗涤3次，洗涤完成后真空干燥箱30℃干燥1h备用，得到纳米双醛淀粉；步骤三：采用共沉淀法将5.4g的fecl3·
6h2o固体与1.99g的fecl2·
4h2o以摩尔比为2:1溶于100ml超纯水中并持续通入氮气排出空气；加入转子规格为3cm，调节转速至160rpm，待溶液完全溶解后，在氮气环境下将反应溶液加热至70℃；然后在反应体系中加入20ml氨水，防止反应物飞溅将转速缓慢增大至270rpm，继续滴加氨水调节反应体系ph值≥10，升温至80℃反应1h；最后将溶液冷却至室温后，用永磁体将fe3o4纳米颗粒分离，用乙醇和去离子水交替洗涤3次至中性，放置于真空干燥箱55℃干燥2h，得到fe3o4纳米颗粒；步骤四：将1.0g醛基含量为25.1％的纳米双醛淀粉溶解于含有500ml超纯水的烧杯中，加入fe3o4磁性纳米粒子2.0g并超声处理使其均匀分散；待分散后向反应体系中加入0.2ml的环氧氯丙烷，并在烧杯口覆盖保鲜膜防止液体蒸发，在40℃的恒温振荡箱中振摇5h，速度为160rpm；反应结束后用无水乙醇和去离子水交替洗涤三次，放置于40℃的真空烘箱中干燥1h；得到以fe3o4磁性核心的纳米双醛淀粉包覆的载体；步骤五：将制备得到的载体用0.1m ph 7.0磷酸缓冲液进行3次洗涤，并放置于磷酸缓冲溶液中浸泡1h备用；将1g的双醛淀粉纳米颗粒加入200ml 0.1m,ph 7.0磷酸盐缓冲液；再将50ml的6％含酶量calb酶液加入反应体系中；混合溶液在恒温振荡箱中以一定的温度振荡一段时间，振动箱转速为150rpm；反应结束后，磁分离法分离上清液，用0.1m ph 7.0磷酸缓冲液反复洗涤磁颗粒，再用去离子水反复洗涤磁颗粒表面；洗涤后将得到的产物放置于40℃真空干燥箱中4h即得到一种基于纳米双醛淀粉载体的固定化calb。

技术总结
本发明涉及酶工程领域，公开了一种基于纳米双醛淀粉载体的固定化CALB制备方法。该固定化酶制备方法如下：首先以蜡质玉米淀粉通过预糊化法制备纳米淀粉颗粒，并通过真空干燥去除纳米淀粉颗粒的水分，再将干燥后的纳米淀粉颗粒通过高碘酸钠氧化，得到双醛淀粉纳米颗粒。然后，以共沉淀法制备纳米Fe3O4，将制备得到的双醛淀粉纳米颗粒与制备出的纳米Fe3O4结合得到复合载体。再将CALB通过交联法固定到制备出的复合载体上，得到一种基于纳米双醛淀粉载体的固定化CALB。且该方法具有较好的酶活力回收率和较高的重复使用性。率和较高的重复使用性。


技术研发人员：于殿宇 董天玉 杜春宇 曲佳瑶 李勋 潘明喆 王立琦 江连洲 刘天一
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：2021.11.23
技术公布日：2022/1/28