用于生物除臭的玫瑰考克氏菌及其应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一株用于生物除臭的玫瑰考克氏菌及其在制备生物除臭菌剂中的应用。
(二)

背景技术：

2.根据世界粮农组织的统计，每年世界生产的粮食中，近三分之一(约13亿吨)在食品供应链中丢失或浪费。餐厨垃圾因高含水率和高有机质含量，极易发生腐败，导致臭气散发，滋生虫蝇。
3.恶臭是一切刺激嗅觉器官引起人们不愉快及损害人类生活环境的气体总称。恶臭是世界公认的七大公害之一，仅次于噪音。恶臭会使人产生恶心，头晕，呕吐等反应，严重还会引起人类呼吸道，心血管等疾病。
4.目前除臭方法主要有三种：物理方法、化学方法和生物方法。物理方法和化学方法适用于臭气污染物浓度较大的场合，具有臭气处理效率高，处理停留时间短，启动快等优势；但同时，存在处理容易引起二次污染、设备耗资大、操作要求高等缺点。生物除臭方法与物理和化学方法相比，过程中不需要添加化学物质，可以在正常温度(10℃～40℃)和压力中进行，比物理方法和化学方法的成本更低，操作更加简单。而且微生物降解通常都是氧化反应的，臭气的最终产物为二氧化碳、水、硫酸盐和硝酸盐等，不会造成二次污染。垃圾填埋场、垃圾压缩站、垃圾压缩车等垃圾处理场所采用的微生物除臭方式与畜牧养殖场的除臭方式相似，以使用生物活菌喷雾为主。
5.专利文献cn 107058153 a公开了一种用于餐厨垃圾中异味去除的生物除臭复合菌剂，包括按质量份计算的假单胞杆菌属菌剂50～100份、芽孢杆菌属菌剂25～80份、绿色木霉属菌剂20～50份，链霉菌属菌剂20～30份。
6.专利文献cn 109609401 a公开了一种复合微生物除臭菌剂，包括蜡样芽孢杆菌2～2、曼氏毕赤酵母2～6和玉米乳杆菌2～20，这三个菌株混合可以显著提升去除nh3和h2s的效果。
7.自然界的微生物种类繁多，开发出更多的高效除臭菌剂是本领域技术人员需要解决的技术问题。
(三)

技术实现要素：

8.本发明的目的提供一种高效的用于生物除臭的菌株——玫瑰考克氏菌(分类命名：kocuria rosea w17)，及其在制备生物除臭菌剂中的应用，以拓宽除臭菌剂的选择范围。
9.本发明采用的技术方案是：
10.用于生物除臭的玫瑰考克氏菌，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：cctcc no:m 2020192，分类命名为：kocuria rosea w17，保藏日期2020年6月10日。
11.该菌株为从浙江工业大学的食堂餐厨垃圾中分离筛选得到一个具有高效除臭能力的菌株，经鉴定认为该菌属于玫瑰考克氏菌(kocuria rosea)，16s rdna序列如seq id no.1所示。
12.本发明还涉及所述的玫瑰考克氏菌在制备生物除臭菌剂中的应用。
13.具体的，所述生物除臭菌剂用于去除餐厨垃圾异味。
14.所述生物除臭菌剂中玫瑰考克氏菌的活菌数大于108cfu/ml。采用合适的菌剂使用量比例，达到除臭目的同时可以节省成本。
15.优选的，所述生物除臭菌剂还包括载体，菌体和载体混合，有助于提高菌体稳定性，提升除臭效果。所述载体可为硅藻土、小麦秸秆或玉米芯，玫瑰考克氏菌菌体与载体以质量比为1:0.8～1.2。具体地，先将小麦秸秆或玉米芯原材料粉碎成80-100目的粉末，再清洗后烘干。作为优选，收集的湿菌体与载体以质量比1:1混合，再置于37℃恒温干燥，即可制得所述生物除臭菌剂。
16.本发明还涉及所述的玫瑰考克氏菌在生物除臭中的应用。
17.具体的，所述玫瑰考克氏菌用于降低餐厨垃圾臭气，将所述玫瑰考克氏菌与待处理餐厨垃圾进行混合，在温度28～37℃、ph≈6条件下进行处理。
18.本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的玫瑰考克氏菌除臭效率高，利用该玫瑰考克氏菌制成的生物除臭菌剂对餐厨垃圾产生的臭气有明显的降解作用，具有较好的应用潜力。
(四)附图说明
19.图1为实施例2中不同载体制备的菌剂对硫化氢降解的检测结果。
20.图2为实施例2中不同载体制备的菌剂对氨气降解的检测结果。
21.图3为实施例4开放性除臭测试中硫化氢的检测结果。
22.图4为实施例4开放性除臭测试中氨气的检测结果。
23.图5为实施例5不同ph下除臭测试中硫化氢的检测结果。
24.图6为实施例5不同ph下除臭测试中氨气的检测结果。
25.图7为实施例6不同温度下除臭测试中硫化氢的检测结果。
26.图8为实施例6不同温度下除臭测试中氨气的检测结果。
27.图9为对比例1中不同菌剂除臭效率比较结果。
(五)具体实施方式
28.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
29.实施例1：菌株筛选鉴定
30.1、将浙江工业大学毓秀食堂的餐厨垃圾中骨头、餐巾纸等物质挑出，然后用破碎机打碎剩余垃圾。
31.2、取1g搅碎后的餐厨垃圾用超纯水梯度稀释至1
×
10-6
、1
×
10-7
、1
×
10-8
，并取各200μl稀释液至固体mrs培养基，用涂布棒涂匀后放置28℃恒温培养箱培养48h～72h，挑取单菌落进行划线纯化培养；
32.mrs培养基配方为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，酵母粉5g，无水乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.25g，琼脂20g。
33.3、经多轮纯化筛选，将颜色亮黄，形态光滑，无褶皱的菌株挑选出来，挑取单菌落用fastdna spin kit for soil试剂盒提取基因组。
34.4、将提取的基因组作为模板进行pcr，pcr体系为：模板1μl，上下游引物各1μl，buffer 25μl，dna聚合酶1μl，dntp 1μl。pcr反应条件为：变性条件95℃，40s；退火条件55℃30s；延伸条件72℃2min。
35.5、将pcr产物送至测序公司测序，并将测序结果与ncbi核酸库进行比对。确定为玫瑰考克氏菌(kocuria rosea)，命名为kocuria roseaw17，于2020年6月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no:m 2020192，保藏地址：中国武汉、武汉大学，并于2020年6月25日检测为存活。
36.实施例2：生物除臭菌剂的制备
37.1、将实施例1筛得的玫瑰考克氏菌菌种接入mrs培养基上。
38.2、将活化好的菌种接种至mrs液体培养基中振荡培养(37℃，180r/min)12小时以上。
39.3、将培养好的菌液进行计数处理，调节菌株含量为108～109cfu/ml。
40.4、将菌液进行离心(12000r/min，10min)，离心后弃去上清液，收集菌体。
41.5、将菌体分别与硅藻土、小麦秸秆、玉米芯以1:1(w/w)进行混合，然后置于37℃恒温箱放置至干燥恒重，即为各类菌剂。硅藻土为市场购买的分子级产品；小麦秸秆和玉米芯经过前期预处理再与菌剂混合，预处理步骤为：先将小麦秸秆或玉米芯原材料粉碎成80-100目的粉末，清洗后50℃烘干。以硅藻土，小麦秸秆，玉米芯为载体的菌剂分别命名为dm w17，ws w17和cc w17。
42.将新鲜餐厨垃圾用搅拌机打碎并分装于500ml三角瓶中，每个摇瓶分装100g(湿重)新鲜餐厨垃圾，每组实验设置三个平行。然后将实施例中制备好的菌剂以10g/瓶的加量添加，同时以仅添加100g的新鲜餐厨垃圾作为空白对照。在28℃恒温下放置36h，期间每隔6h测定一次硫化氢和氨气的浓度。
43.硫化氢测定方法：用逸云天手提式复合气体分析仪ptm-600进行测定。
44.氨气测定方法：参照标准hj 533-2009中环境空气和废气氨的测定，纳氏试剂分光光度法测定。
45.结果如图1和图2所示，从检测结果可以发现dm w17组对于氨气和硫化氢的降解效果是最好的，所以将硅藻土确定为固定化载体。
46.实施例3：以餐厨垃圾为底物进行除臭测试
47.将新鲜餐厨垃圾用搅拌机打碎并分装于500ml三角瓶中，每个摇瓶分装100g(湿重)新鲜餐厨垃圾，每组实验设置三个平行。然后将实施例2制备好的菌剂以10g/瓶的加量添加，同时以仅添加100g的新鲜餐厨垃圾作为空白对照。然后用三层保鲜膜封口，再用橡皮筋扎紧瓶口。置于28℃恒温箱，24小时后测定氨气与硫化氢浓度。
48.经过三组平行试验得出接种生物除臭菌剂24小时后对于餐厨垃圾中硫化氢的降解率为66.21％，氨气降解率为25.76％。从以上实验结果可以看出，利用玫瑰考克氏菌制成的生物除臭菌剂对餐厨垃圾产生的臭气有明显的降解作用，具有较好的应用潜力。
49.实施例4：以餐厨垃圾为底物进行开放性除臭测试
50.将新鲜餐厨垃圾用搅拌机打碎并分装于500ml三角瓶中，每个三角瓶分装100g(湿重)新鲜餐厨垃圾，每组实验设置三个平行。然后将实施例2制备好的菌剂以10g/瓶的加量添加，同时以仅添加100g的新鲜餐厨垃圾作为空白对照。放置于28℃恒温箱中，测定48h内的硫化氢和氨气浓度变化，每隔8h测定一次气体浓度。检测结果如图3和图4所示。
51.从实施例4结果可以看出微生物菌剂对硫化氢有较好的抑制作用，显著降低了餐厨垃圾硫化氢浓度，另外对氨气有一定的抑制作用。
52.实施例5：以餐厨垃圾为底物在不同ph下对比臭气浓度
53.将新鲜餐厨垃圾用搅拌机打碎并分装于500ml三角瓶中，每个三角瓶分装100g(湿重)新鲜餐厨垃圾，设置三个实验组：调整ph至6.0，7.0，8.0，然后每瓶加入10g实施例2制备好的菌剂，每组实验设置三个平行。测定48h内的硫化氢和氨气浓度变化，每隔8h测定一次气体浓度，实验结果如图5和图6所示。
54.实施例6：以餐厨垃圾为底物在不同温度下对比臭气浓度
55.将新鲜餐厨垃圾用搅拌机打碎并分装于500ml三角瓶中，每个三角瓶分装100g(湿重)新鲜餐厨垃圾，将实施例2制备好的菌剂以10g/瓶的加量添加，设置三组实验：分别置于28℃，37℃，45℃恒温培养箱，每组实验设置三个平行。测定48h内的硫化氢和氨气浓度变化，每隔8h测定一次气体浓度，实验结果如图7和图8所示。
56.从实施例结果可以看出微生物菌剂在37℃时释放的硫化氢浓度较28℃时和45℃时更低。氨气浓度在28℃时浓度最低，并随着温度升高，氨气浓度也随之升高，这也符合了温度越高氨气释放量越大的氨气释放规律。
57.实施例7：不同接种量的菌剂对餐厨垃圾臭气浓度的影响
58.将新鲜餐厨垃圾用搅拌机打碎并分装于500ml三角瓶中，每个三角瓶分装100g(湿重)新鲜餐厨垃圾，设置三个实验组：添加1％，2％，5％和10％的菌剂(w/w)，每组实验设置三个平行。置于28℃恒温培养箱测定48h内的硫化氢和氨气浓度变化，每隔24h测定一次气体浓度，实验结果如表1和表2所示。
59.从实施例结果可以看出10％的接种量效果要优于其他实验组，对于臭气浓度有较好的抑制作用。
60.表1：48h内的硫化氢浓度变化(硫化氢浓度mg/m3)
[0061][0062]
注：逸云天手提式复合气体分析仪ptm-600的检测下限为0.01mg/m3。
[0063]
表2：48h内的氨气浓度变化(氨气浓度mg/m3)
[0064][0065]
对比例1：
[0066]
将实施例2制备的生物除臭菌剂与市面上购买的四种菌剂进行除臭效率比较。
[0067]
以500ml三角瓶作为反应容器，每个三角瓶装100g(湿重)搅碎的新鲜餐厨垃圾，设计五个实验组和一个对照组，五个实验组分别添加10g的自制生物除臭菌剂，em菌剂，万洁芬菌剂，绿陇菌剂，凯撒诺亚菌剂，对照组仅添加100g新鲜餐厨垃圾，不添加任何菌剂。然后用三层保鲜膜封口，再用橡皮筋扎紧瓶口。将三角瓶置于28℃房间24小时后测定氨气与硫化氢浓度。检测结果如表3和图9所示。
[0068]
表3：24小时后测定氨气与硫化氢降解率
[0069]
除臭剂名称氨气降解率硫化氢降解率自制生物除臭菌剂35.2％82.3％em4.3％43.9％万洁芬7.5％61.8％绿陇0％76.8％凯撒诺亚16.1％71.5％
[0070]
从以上实验结果可以看出，实施例2中制备的生物除臭菌剂除臭效果要优于市面上购买的菌剂。利用玫瑰考克氏菌制成的生物除臭菌剂对餐厨垃圾产生的臭气有明显的降解作用，具有较好的应用潜力。