1.本发明属于有机合成与分析化学技术领域，具体涉及一种用于检测铜离子的邻苯二甲酰亚胺类荧光探针及其制备方法、应用和铜离子的检测方法。


背景技术：

2.铜是人体中第三丰富的过渡金属元素，广泛分布于人体血液和组织中。 cu
2+
在能量产生、信号转导、细胞氧运输和活化等生理过程中起重要作用。人体内cu
2+
水平的异常会引起门克氏病、威尔逊病、阿尔茨海默病、帕金森病、冠心病、肌萎缩侧索硬化、脊髓病等一系列疾病。此外，由于在农业和工业生产中的广泛应用，cu
2+
已成为一种重要的环境污染物。美国环境保护署(epa)已将饮用水中cu
2+
的阈限值设定为20μm。因此，开发具有高灵敏度和选择性检测cu
2+
的方法对人类健康和环境安全非常重要。
3.目前检测cu
2+
的方法有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、电化学法等。但这些方法存在耗时、样品制备繁琐、仪器昂贵以及不适合实时分析等缺点。相比上述方法，荧光探针因具有成本低、操作简便、实时分析和无损生物成像等优点，近年来在重金属离子的检测中受到越来越多的关注。迄今为止，文献报道了许多cu
2+
荧光探针，但其中多数探针仍存在一些局限性，如选择性差，需要有机溶剂，合成步骤繁琐以及荧光淬灭等。因此，开发一种水溶性好、合成简单且性能优异的cu
2+
荧光探针具有重要的现实意义。


技术实现要素：

4.为解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测铜离子的邻苯二甲酰亚胺类荧光探针及其制备方法、应用和铜离子的检测方法。本发明所提供的荧光探针lxj-3具有合成步骤简单、stokes位移大和水溶性好等优点，是一种优异的荧光增强型探针，具有很好的应用前景。
5.本发明所提供的技术方案如下：
6.一种用于检测铜离子的邻苯二甲酰亚胺类荧光探针，所述荧光探针具有以下结构：
[0007][0008]
上述技术方案所提供的荧光探针lxj-3，是以吡啶-2-甲酸酯为识别受体的邻苯二
甲酰亚胺类化合物，为一种邻苯二甲酰亚胺衍生物。
[0009]
本发明还提供了用于检测铜离子的邻苯二甲酰亚胺类荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
1)将n-丁基-3-羟基邻苯二甲酰亚胺(bhio)、缚酸剂和催化剂4-二甲氨基吡啶(dmap)溶于二氯甲烷中，0～30℃进行反应；
[0011]
2)将吡啶-2-甲酰氯盐酸盐溶于二氯甲烷中并缓慢滴加至反应液中，反应结束后提纯，得到所述用于检测铜离子的邻苯二甲酰亚胺类荧光探针。
[0012]
上述技术方案以n-丁基-3-羟基邻苯二甲酰亚胺和吡啶-2-甲酰氯为原料，在碱及4-二甲氨基吡啶催化下经酰化反应制得荧光探针。该方法通过两步即可制备得到上述荧光探针lxj-3，合成工艺简单。
[0013]
具体的，将化合物bhio、缚酸剂和dmap溶于二氯甲烷中，将吡啶-2
‑ꢀ
甲酰氯盐酸盐溶于二氯甲烷中，于搅拌下用恒压滴液漏斗滴至反应液中，0～30℃进行反应，反应结束后提纯得到所述邻苯二甲酰亚胺类探针lxj-3。
[0014]
本发明所述的化合物bhio，是采用已经公开的方法(分析试验室,2020, 39(12):1430-1434)，将3-羟基邻苯二甲酸酐与正丁胺在乙酸中加热制备得到。
[0015]
化合物bhio的化学名称为n-丁基-3-羟基邻苯二甲酰亚胺，其结构式如下：
[0016][0017]
具体的，步骤2)中，反应的时间为4～10h。
[0018]
具体的，步骤1)中，所述缚酸剂选自n,n-二异丙基乙胺(dipea)、三乙胺或吡啶中的任意一种或多种。
[0019]
具体的，步骤2)中，将反应结束后得到的反应液减压蒸馏除去溶剂，得粗产品，然后过硅胶柱分离纯化，所用流动相为体积比为1:2的乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂。
[0020]
具体的，化合物n-丁基-3-羟基邻苯二甲酰亚胺与吡啶-2-甲酰氯盐酸盐的摩尔比为1:(1～2)；化合物n-丁基-3-羟基邻苯二甲酰亚胺与所述缚酸剂的摩尔比为1:(2～4)；化合物n-丁基-3-羟基邻苯二甲酰亚胺与所述催化剂的摩尔比为(5～20):1。
[0021]
本发明还提供了用于检测铜离子的邻苯二甲酰亚胺类荧光探针的应用，作为cu
2+
的荧光探针，定性或定量检测cu
2+
的浓度。
[0022]
上述技术方案利用cu
2+
在缓冲液中催化探针lxj-3发生水解反应，脱去吡啶-2-甲酰基并重新生成荧光母体bhio，使其esipt过程恢复，荧光显著增强。具体来说，在365nm紫外灯照射下，探针溶液本身荧光较弱，加cu
2+
后发出强绿色荧光，从而实现对cu
2+
的检测。在pbs缓冲溶液(10mm,ph 7.4，为便于其在生物方面的使用，可选择该生理条件ph 7.4)中，探针lxj-3 对cu
2+
具有专一的选择性、很强的抗干扰能力以及显著的荧光增强效应，其检测限为31nm。
[0023]
具体的，cu
2+
的检测方法包括以下步骤：
[0024]
1)建立铜离子浓度梯度变化与所述荧光探针溶液的荧光强度变化值的标准曲线；
[0025]
2)根据被测溶液的荧光强度，从标准曲线中获得待测溶液中cu
2+
离子的浓度。
[0026]
更具体的，包括以下步骤：
[0027]
1)将浓度呈梯度变化的铜离子溶液分别与特定浓度的探针lxj-3溶液混合后，测定其相应的荧光强度，随后以铜离子的浓度为横坐标，相应混合溶液的荧光强度为纵坐标作图，建立铜离子浓度梯度变化与探针lxj-3溶液荧光强度变化值标准曲线；
[0028]
2)根据荧光强度从标准曲线中获得待测溶液中铜离子的浓度。
[0029]
具体的，荧光检测条件为：激发波长344nm，最大荧光发射波长为515nm，狭缝宽度为5nm和5nm，在420～650nm进行荧光发射谱的检测。
[0030]
具体的，荧光检测采用的荧光探针储备液包括荧光探针、溶剂以及缓冲液，其中，荧光探针为邻苯二甲酰亚胺衍生物lxj-3。
[0031]
具体的，储备液中所述荧光探针的摩尔浓度为0.01～10mm；所述溶剂为甲醇、乙醇和二甲基亚砜中的至少一种；所述缓冲液为pbs缓冲液或 tris-hcl缓冲液，所述缓冲液的ph＝5～10。
[0032]
本发明与现有技术相比较具有以下优点：
[0033]
本发明所提供的邻苯二甲酰亚胺类荧光探针lxj-3结构简单，易于合成，收率较高。探针lxj-3基于n-丁基-3-羟基邻苯二甲酰亚胺的esipt过程来实现对铜离子的选择性识别，除具有stokes位移大，荧光量子产率高和光学稳定性强等优点外，还能在纯水相和较宽的ph范围内，灵敏、特异性的识别与检测cu
2+
，基本不受其他离子干扰，对铜离子的最低检测限为31nm，能很好满足复杂环境中或生物体内痕量铜离子的定量检测，具有重要的应用价值。
附图说明
[0034]
图1为实施例1所制备的探针lxj-3的1h-nmr谱图；
[0035]
图2为实施例1所制备的探针lxj-3的
13
c-nmr谱图；
[0036]
图3为实施例1所制备的探针lxj-3的高分辨质谱图；
[0037]
图4为实施例1所制备的探针lxj-3与铜离子反应的荧光强度随时间变化曲线；
[0038]
图5为实施例1所制备的探针lxj-3加入不同浓度铜离子的荧光光谱变化；
[0039]
图6为实施例1所制备的探针lxj-3加入不同浓度铜离子的荧光强度变化及其荧光强度与铜离子浓度的线性图；
[0040]
图7为实施例1所制备的探针lxj-3以及探针lxj-3与铜离子反应的荧光响应随ph的变化曲线；
[0041]
图8为实施例1所制备的探针lxj-3在pbs缓冲液体系中加入不同干扰离子的荧光光谱；
[0042]
图9为其他干扰离子对实施例1所制备的探针lxj-3加铜离子体系荧光强度的影响；
[0043]
图10为实施例1所制备的探针lxj-3对cu
2+
可能的识别机制；
[0044]
图11为存在和不存在cu
2+
(20μm)时实施例1所制备的探针lxj-3(10 μm)以及bhio(10μm)在pbs(10mm,ph 7.4)中的荧光光谱；
[0045]
图12为实施例1所制备的探针lxj-3与cu
2+
反应后溶液的高分辨质谱图。
具体实施方式
[0046]
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0047]
下述公开了多种不同的实施所述的主题技术方案的实施方式或实施例。为简化公开内容，下面描述了各特征存在的一个或多个排列的具体实施例，但所举实施例不作为对本发明的限定,在说明书中随后记载的第一特征与第二特征连接，即可以包括直接联系的实施方式，也可以包括形成附加特征的实施方式，进一步的，也包括采用一个或多个其他介入特征使第一特征和第二特征彼此间接连接或结合，从而第一特征和第二特征可以不直接联系。
[0048]
在本技术公开的实施例中提供了邻苯二甲酰亚胺衍生物，其结构式如下式所示：
[0049][0050]
本技术还公开了上述邻苯二甲酰亚胺衍生物的制备方法，其合成路线如下：
[0051][0052]
为了便于理解，本技术提供了以下几种具体的实施：
[0053]
实施例1
[0054]
上述邻苯二甲酰亚胺衍生物通过以下步骤制备，具体的包括：
[0055]
在100ml圆底烧瓶中加入bhio(0.1g,0.46mmol)、dipea(0.18g,1.38 mmol)、dmap(6mg,0.046mmol)以及15ml干燥的二氯甲烷，室温搅拌，将吡啶-2-甲酰氯盐酸盐(0.12g,0.69mmol)溶于5毫升干燥的二氯甲烷中、慢慢滴至反应液中，滴毕反应8小时后，tlc监测已反应完全，减压蒸馏除去溶剂，得粗品；过硅胶柱(流动相为石油醚：乙酸乙酯＝2:1，v:v)得白色固体产物0.13g，收率为85％。
[0056]
对得到的产物进行核磁分析，其结果如下：
[0057]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.84-8.86(m,1h),8.28-8.30(m,1h), 8.10-8.15(m,1h),7.95(t,1h,j＝7.5hz),7.84(d,1h,j＝7.4hz),7.75-7.80(m, 2h),3.50(t,2h，j＝7.0hz),1.48-1.55(m,2h),1.20-1.29(m,2h),0.85(t,3h, j＝7.4hz)；
13
c nmr(100mhz，dmso-d6)δ:167.02,165.53,162.54,150.21, 146.02,145.96,137.87,136.56,133.27,128.73,128.31,126.03,122.34,121.13, 37.20,29.85,19.46,13.43.
[0058]
esi-hrms(m/z)计算值:c
18h16
n2nao4[m+na]
+
:347.10023,实测值: 347.10040.
[0059]
实施例2
[0060]
在100ml圆底烧瓶中加入bhio(0.1g,0.46mmol)、dipea(0.24g, 1.84mmol)、dmap(12mg,0.092mmol)以及15ml干燥的二氯甲烷，室温搅拌，将吡啶-2-甲酰氯盐酸盐(0.16g,0.92mmol)溶于5毫升干燥的二氯甲烷中、慢慢滴至反应液中，滴毕反应4小时后，tlc监测已反应完全，减压蒸馏除去溶剂，得粗品；过硅胶柱(流动相为石油醚：乙酸乙酯＝2:1，v:v) 得白色固体产物0.13g，收率为88％。
[0061]
实施例3
[0062]
在100ml圆底烧瓶中加入bhio(0.1g,0.46mmol)、三乙胺(0.14g,1.38 mmol)、dmap(6mg,0.046mmol)以及15ml干燥的二氯甲烷，室温搅拌，将吡啶-2-甲酰氯盐酸盐(0.12g,0.69mmol)溶于5毫升干燥的二氯甲烷中、慢慢滴至反应液中，滴毕反应8小时后，tlc监测已反应完全，减压蒸馏除去溶剂，得粗品；过硅胶柱(流动相为石油醚：乙酸乙酯＝2:1，v:v)得白色固体产物0.12g，收率为80％。
[0063]
实施例4
[0064]
在100ml圆底烧瓶中加入bhio(0.1g,0.46mmol)、吡啶(0.11g,1.38 mmol)、dmap(6mg,0.046mmol)以及15ml干燥的二氯甲烷，室温搅拌，将吡啶-2-甲酰氯盐酸盐(0.123g,0.69mmol)溶于5毫升干燥的二氯甲烷中、慢慢滴至反应液中，滴毕反应8小时后，tlc监测已反应完全，减压蒸馏除去溶剂，得粗品；过硅胶柱(流动相为石油醚：乙酸乙酯＝2:1，v:v)得白色固体产物0.11g，收率为76％。
[0065]
本技术还公开了上述邻苯二甲酰亚胺衍生物作为荧光探针用于检测铜离子的几种实施例。
[0066]
实施例5
[0067]
光谱性质的测试方法
[0068]
将探针lxj-3溶于dmso配成5mm的储备液，低温保存；将金属阳离子(k
+
、na
+
、ag
+
、ca
2+
、mg
2+
、cu
2+
、zn
2+
、al
3+
、fe
3+
、fe
2+
、cd
2+
、cr
3+
、 co
2+
、hg
2+
、ni
2+
、pb
2+
、mn
2+
)经二次水溶解成浓度为10mm溶液。测定体系：将30μl探针lxj-3的储备液与30μl被测金属离子的溶液混合，用pbs 缓冲溶液定容至3ml，置于比色皿中，反应15min后，进行测定。测试条件：室温，荧光分光光度计测量时参数为λ
ex
＝344nm，λ
em
＝515nm，狭缝宽度为5nm和5nm，电压为700v，波长范围为420-650nm。
[0069]
实施例6
[0070]
探针lxj-3与cu
2+
的反应时间对荧光强度的影响
[0071]
在pbs缓冲溶液(10mm,ph 7.4)体系中，探lxj-3(10μm)溶液本身的荧光很弱；在探lxj-3溶液中加入2当量的cu
2+
后，每隔一定时间记录探针荧光强度，结果显示在515nm处的荧光强度迅速增强，随着反应的进行，荧光强度增加趋势逐渐变小，15min后荧光强度基本趋于稳定。因此，在随后的实验中均将反应时间控制在15min以内(图4)。
[0072]
实施例7
[0073]
cu
2+
的浓度对探针lxj-3荧光强度的影响
[0074]
如图5所示，在pbs缓冲液(10mm,ph 7.4)中，cu
2+
浓度为0～50μm的范围内，探针lxj-3(10μm)在515nm处的荧光强度随着cu
2+
浓度的递增明显增强。从图6可知，在cu
2+
浓度增至20μm时，探针lxj-3的荧光强度达到最大值，再继续增大cu
2+
的浓度，荧光强度基本保持
不变。在0～10μm浓度范围内，探针lxj-3荧光强度与cu
2+
的浓度有较好的线性关系，回归方程为 y＝532.9x+909.7(r2＝0.9938)。根据检测限(lod)计算公式：lod＝3σ/k (其中σ为未加入cu
2+
时探针lxj-3荧光光谱变化的标准偏差，k为直线的斜率)，计算得到探针lxj-3对cu
2+
的检测限为31nm，表明探针lxj-3对cu
2+
具有较好的检测灵敏度。
[0075]
实施例8
[0076]
ph对探针lxj-3检测性能的影响
[0077]
如图7所示，在pbs缓冲溶液(10mm,ph 7.4)体系中，探针lxj-3(10μm) 溶液的荧光强度在ph 3～11范围内变化不大，说明探针lxj-3在酸性和弱碱性条件下相对比较稳定。当加入2当量的cu
2+
后，在ph 3～4区间内探针lxj-3的荧光强度与未加cu
2+
时变化不大；而在ph 5～10的区间内，探针lxj-3与cu
2+
作用后的荧光强度增加非常明显，并在ph 7.4时荧光强度达到峰值。说明探针lxj-3可以在较宽的ph范围内检测铜离子。为便于其在生物方面的使用，选择生理条件ph 7.4的pbs缓冲溶液体系进行测试。
[0078]
实施例9
[0079]
探针lxj-3对其他金属离子的选择性和干扰性
[0080]
选取可能产生干扰的阳离子(k
+
、na
+
、ag
+
、ca
2+
、mg
2+
、zn
2+
、al
3+
、 fe
3+
、fe
2+
、cd
2+
、cr
3+
、co
2+
、hg
2+
、ni
2+
、pb
2+
、mn
2+
)来考察探针lxj-3 对cu
2+
的选择性。在pbs缓冲溶液(10mm,ph 7.4)体系中，向10μmol/l的探针lxj-3溶液中分别加入2当量的上述各种离子，室温反应15min后，测试探针lxj-3的荧光光谱变化。当加入可能有干扰的离子后，探针lxj-3的荧光均没有明显变化；而当加入2当量的cu
2+
后，荧光强度显著增强(图8)。由此可知，探针lxj-3对cu
2+
具有专一的选择性，可以用于cu
2+
的分析检测。
[0081]
为了进一步检验探针lxj-3在cu
2+
与其他竞争性离子共存时检测cu
2+
的能力，对探针lxj-3进行了抗干扰实验。在pbs缓冲溶液(10mm,ph 7.4)体系中，将10μm探针lxj-3和2当量cu
2+
混合后，再加入2当量的上述各种离子溶液，测定混合液的荧光强度变化。如图9所示，探针lxj-3的荧光强度与只有cu
2+
存在时基本相同。以上结果表明，其他竞争性物质的存在对探针lxj-3检测cu
2+
并没有产生明显的干扰。因此，探针lxj-3可用于复杂环境中cu
2+
的检测。
[0082]
实施例10
[0083]
探针lxj-3对cu
2+
的识别机理
[0084]
根据文献(sensor.actuat.b-chem.,2017,252,134.)报道吡啶-2-甲酰基识别cu
2+
的机制，我们提出了lxj-3对cu
2+
可能的响应机制(图10)。因为吡啶
ꢀ‑
2-甲酰基的存在，使bhio中基于酮-烯醇互变异构体的esipt过程被抑制，探针lxj-3本身呈现微弱荧光。而当探针与cu
2+
作用时，催化水解吡啶-2
‑ꢀ
甲酸酯，探针lxj-3脱去吡啶-2-甲酰基，释放出荧光母体bhio使其esipt 过程恢复，重新呈现强绿色荧光，从而实现cu
2+
的识别与检测。为了验证我们的推测，对lxj-3与cu
2+
反应后产物的荧光光谱和质谱进行了分析。荧光光谱实验发现，在344nm激发下，探针lxj-3自身荧光很弱，而当lxj-3 与cu
2+
反应后，在515nm处出现一个显著增强的荧光信号，这与荧光母体 bhio的荧光光谱一致(见图11)。lxj-3与cu
2+
反应后高分辨质谱图中出现了m/z 218.08215的离子峰(见图12)，这与荧光母体bhio去质子化的分子量[m-h]-218.08227相符。
[0085]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和
原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。