1.本发明涉及一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物及其应用，属于医药技术领域。


背景技术：

2.甲状腺结节，特别是甲状腺癌的发病率在全球范围内呈现显著的上升趋势。流行病学研究显示，在碘充足地区，有5％的女性和1％的男性存在可触及的甲状腺结节。在高发的老年和女性人群中，经高分辨率超声检查，19～67％的随机选择人群有甲状腺结节，其中5～15％的甲状腺结节为恶性，即甲状腺癌。良恶性甲状腺结节的临床处理方式不同，对患者生存质量的影响和涉及的医疗花费也有显著差异。面对如此庞大的患者群体，甲状腺结节的良恶性鉴别尤为重要。
3.高分辨率超声检查是评估甲状腺结节的首选方法，但是，甲状腺结节的超声像图表现复杂多样，良恶性判断困难。并且，高分辨率超声检查有赖于超声设备的性能，更与超声医师的临床经验密切相关，因此，使用其进行临床诊断的过程中仍存在大量可疑的甲状腺结节。
4.为了减少不必要的甲状腺结节手术，并帮助医生确定恰当的手术方案，提高甲状腺癌的确诊率十分关键。现阶段，临床上常使用细针穿刺(fine-needle aspiration biopsy，fnab)对经超声判断具有高恶性肿瘤风险的甲状腺结节进行进一步诊断以提高甲状腺癌的确诊率。fnab可将诊断甲状腺癌的阳性预测率提升至50～96％。但是，fnab也存在一定的局限性，例如，fnab尚不能区分甲状腺滤泡癌和甲状腺滤泡腺瘤。
5.随着分子病理诊断的日益发展，对穿刺样本进行某些甲状腺癌分子标志物的检测已被应用于临床实践，对经fnab仍不能确定良恶性的甲状腺结节进行了有效的补充，进一步提高了甲状腺癌的确诊率。目前，针对甲状腺结节良恶性的分子诊断方法大致可以分为两类：针对恶性甲状腺结节的“划入规则(rule in)”和针对良性甲状腺结节的“排除规则(rule out)”。
6.其中，针对恶性甲状腺结节的“划入规则(rule in)”已被广泛的研究，其中应用最为广泛的是ras和braf突变以及ret/ptc和pax8/pparγ重排，这些基因改变的联合检测对甲状腺癌诊断的特异性和阳性预测率分别可以达到97～100％和87～100％；而针对良性甲状腺结节的“排除规则(rule out)”则仍处于研究起步阶段，仅有spop(29/231，11.2％)、ezh1(24/231，9.3％)和znf148(14/231，5.4％)这几个确诊率较低的分子标志物。因此，良性甲状腺结节，尤其是腺瘤样结节，在临床细针穿刺检查中，如何明确地与恶性甲状腺结节区分开，还是一个临床确诊的重要难题。


技术实现要素：

7.为解决上述问题，本发明提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物，所述分子标志物为znf148蛋白突变体；所述znf148蛋白突变体与znf148蛋白相比，第540位
缬氨酸、第546位天冬氨酸、第554位甘氨酸、第555位谷氨酰胺或第579位脯氨酸中的至少一位发生了突变；
8.或者，所述分子标志物为znf148基因突变体；所述znf148基因突变体与znf148基因相比，第1619位胸腺嘧啶、第1636位鸟嘌呤、第1660位鸟嘌呤、第1664位腺嘌呤、第1728位腺嘌呤或第1736位胞嘧啶中的至少一位发生了突变。
9.在本发明的一种实施方式中，所述znf148蛋白突变体与znf148蛋白相比，第540位缬氨酸突变为了丙氨酸，第546位天冬氨酸突变为了组氨酸，第554位甘氨酸突变为了精氨酸，第555位谷氨酰胺突变为了亮氨酸，和/或，第579位脯氨酸突变为了亮氨酸。
10.在本发明的一种实施方式中，所述znf148基因突变体与znf148基因相比，第1619位胸腺嘧啶突变为了胞嘧啶，第1636位鸟嘌呤突变为了胞嘧啶，第1660位鸟嘌呤突变为了胞嘧啶，第1664位腺嘌呤突变为了胸腺嘧啶，第1728位腺嘌呤突变为了胸腺嘧啶，和/或，第1736位胞嘧啶突变为了胸腺嘧啶。
11.在本发明的一种实施方式中，所述znf148蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
12.在本发明的一种实施方式中，所述znf148基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
13.在本发明的一种实施方式中，所述诊断甲状腺结节良恶性包含区分甲状腺滤泡癌和甲状腺滤泡腺瘤。
14.本发明还提供了检测上述分子标志物的检测试剂在制备用于诊断甲状腺结节良恶性的产品中的应用。
15.在本发明的一种实施方式中，所述诊断甲状腺结节良恶性包含区分甲状腺滤泡癌和甲状腺滤泡腺瘤。
16.本发明还提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测试剂；所述检测试剂能够检测znf148蛋白的第540位突变、第546位突变、第554位突变、第555位突变或第579位突变中的至少一个；或者，所述检测试剂能够检测znf148基因的第1619位突变、第1636位突变、第1660位突变、第1664位突变、第1728位突变或第1736位突变中的至少一个。
17.在本发明的一种实施方式中，所述检测试剂包含能够与znf148蛋白中第540位v
→
a突变，第546位d
→
h突变，第554位g
→
r突变，第555位q
→
l突变，和/或，第579位p
→
l突变特异性结合的抗体；
18.或者，所述检测试剂包含能够与znf148基因中第1619位的t
→
c突变，第1636位的g
→
c突变，第1660位的g
→
c突变，第1664位的a
→
t突变，第1728位的a
→
t突变，和/或，第1736位的c
→
t突变特异性结合的引物、探针或芯片。
19.在本发明的一种实施方式中，所述znf148蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
20.在本发明的一种实施方式中，所述znf148基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
21.在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒还包含扩增试剂；所述扩增试剂能够特异性扩增znf148基因的第1402～1916位；或者，所述扩增试剂能够特异性扩增znf148基因中，含有第1402～1916位的片段。
22.在本发明的一种实施方式中，所述扩增试剂为核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示的引物对；或者，所述扩增试剂为核苷酸序列如seq id no.5和seq id no.6所示的引物对。
23.在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒用于良性甲状腺结节的辅助判断。
24.在本发明的一种实施方式中，所述辅助判断包含区分甲状腺滤泡癌和甲状腺滤泡腺瘤。
25.在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的使用对象为甲状腺结节细针穿刺样本。
26.本发明技术方案，具有如下优点：
27.1、本发明提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物，所述分子标志物为znf148蛋白突变体或znf148基因突变体，所述znf148蛋白突变体与znf148蛋白相比，第540位缬氨酸、第546位天冬氨酸、第554位甘氨酸、第555位谷氨酰胺或第579位脯氨酸中的至少一位发生了突变，所述znf148基因突变体与znf148基因相比，第1619位胸腺嘧啶、第1636位鸟嘌呤、第1660位鸟嘌呤、第1664位腺嘌呤、第1728位腺嘌呤或第1736位胞嘧啶中的至少一位发生了突变；所述分子标志物与良性甲状腺结节的发生有很强的相关性，因此，以所述分子标志物作为检测对象进行甲状腺结节良恶性的诊断，具有阴性预测率高(高达97.7％)的优势；并且，所述分子标志物在甲状腺滤泡腺瘤中的突变率很高(高达57.1％)，因此，所述分子标志物在区分甲状腺滤泡癌和甲状腺滤泡腺瘤中具有极高的应用前景。
28.2、本发明提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测试剂，所述检测试剂能够检测znf148蛋白的第540位突变、第546位突变、第554位突变、第555位突变或第579位突变中的至少一个，或者，所述检测试剂能够检测znf148基因的第1619位突变、第1636位突变、第1660位突变、第1664位突变、第1728位突变或第1736位突变中的至少一个；所述试剂盒的检测对象与良性甲状腺结节的发生有很强的相关性，因此，使用所述试剂盒进行甲状腺结节良恶性的诊断，具有阴性预测率高(高达97.7％)的优势；并且，所述试剂盒的检测对象在甲状腺滤泡腺瘤中的突变率很高(高达57.1％)，因此，所述试剂盒在区分甲状腺滤泡癌和甲状腺滤泡腺瘤中具有极高的应用前景。
附图说明
29.图1：znf148基因在481例甲状腺结节样本中出现的突变类型和频率信息。
30.图2：同时出现2个及以上znf148突变的样本测序信息。
31.图3：znf148突变核苷酸测序图(p583p)。
32.图4：znf148突变核苷酸测序图(v540a)。
33.图5：znf148突变核苷酸测序图(d546h)。
34.图6：znf148突变核苷酸测序图(g554r)。
35.图7：znf148突变核苷酸测序图(q555l)。
36.图8：znf148突变核苷酸测序图(s576s)。
37.图9：znf148突变核苷酸测序图(p579l)。
38.图10：znf148突变判断甲状腺结节良恶性工作流程图。
具体实施方式
39.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其
他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
40.下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
41.实验例1：分子标志物的获取
42.1、样本准备和dna提取
43.经江苏省原子医学研究所附属江原医院伦理委员会批准，并在患者知情同意后，从481位患者的手术标本中共获得481例甲状腺结节组织样本，其中包括313位甲状腺癌患者与168位良性结节患者，所有样本经组织病理确认(患者基本信息见表1)。所有患者在标本采集前均未接受治疗(放疗或化疗)。所有组织收集时迅速放入组织固定液中保存，并独立分析，以最大程度减少污染和干扰。经有经验的病理科医师检阅核对he染色切片后，使用dexpat reagent(takara)试剂盒对病理证实的区域提取dna(甲状腺乳头状癌组织的细胞密度＞80％)。
44.表1 481例甲状腺结节组织样本来源患者的基础临床病理学特征
[0045][0046][0047]
注：
a,b
部分临床信息缺失；结节大小和多灶性的分析在51个良性结节和307个恶性肿瘤中进行。
[0048]
2、使用pcr和sanger一代测序检测突变
[0049]
使用特异性引物(上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示、下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示)扩增znf148基因(核苷酸序列如seq id no.2所示)第10个外显子(znf148基因总共有10个外显子)的突变热点区域，pcr反应程序如下：95℃初始变性5min，
扩增采用95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，设置30个循环扩增，随后72℃最终延伸5min(applied biosystems veriti pcr仪)。所得pcr产物经琼脂糖核酸电泳并回收目的条带进行纯化。pcr产物由3730xl dna analyzer(applied biosystems)测序，并使用测序分析软件(snapgene 2.3.2)进行分析。所有阳性的突变均根据原始测序的文件通过人工核对进行确认(具体结果可见表2～4和图1～9)。
[0050]
表2 znf148基因及蛋白的突变情况
[0051]
核苷酸突变情况氨基酸突变情况基因编码区第1619位，t
→
c基因编码区v540a基因编码区第1636位，g
→
c基因编码区d546h基因编码区第1660位，g
→
c基因编码区g554r基因编码区第1664位，a
→
t基因编码区q555l基因编码区第1728位，a
→
t同义突变基因编码区第1736位，c
→
t基因编码区p579l基因编码区第1749位，g
→
a同义突变
[0052]
表3 481例甲状腺结节组织样本中测序发现的znf148基因突变分布情况
[0053][0054][0055]
注：heterozygote和homozygote是p583p的两个亚分类。
[0056]
表4 481例甲状腺结节样本中braf、znf148基因突变与病理诊断之间的比较
[0057]
基因型良性结节(n＝168)甲状腺癌(n＝313)braf v600e(n＝207)0(0％)207(66.1％)braf野生型(n＝274)
‑‑‑‑
znf148突变(n＝43)42(25％)1(0.3％)znf148野生(n＝231)126(75％)105(33.6％)
[0058]
表5 znf148的基因突变在甲状腺滤泡性腺瘤和甲状腺滤泡癌中的分布情况
[0059]
基因型滤泡性腺瘤(n＝7)滤泡癌(n＝10)znf148突变(n＝43)4(57.1％)0(0.0％)
znf148野生(n＝231)3(42.9％)10(100％)
[0060]
3、研究结果
[0061]
由表2～4和图1～9可知：
[0062]
在甲状腺结节中共发现了7个不同的znf148突变，其中发生率最高的突变为一个znf148的同义突变，即znf148 p583p，该突变在甲状腺良性结节以及甲状腺癌组织样本中普遍存在，没有组织特异性，且发生率较高，不考虑作为甲状腺结节良恶性鉴别的突变检测位点。
[0063]
此外，在481例甲状腺结节样本中还发现了6种全新的突变，分别为v540a(n＝4，0.8％)、d546h(n＝3，0.6％)、g554r(n＝31，6.4％)、q555l(n＝1，0.2％)、s576s(n＝1，0.2％)、p579l(n＝13，2.7％)。有9例甲状腺结节样本出现了2个及以上的znf148基因突变。共有42个(42/168，25％)甲状腺良性结节患者存在znf148的基因突变。而在甲状腺恶性结节中仅发现一例znf148的错义突变，即znf148 p579l突变，其发生率在甲状腺恶性结节中仅为0.3％。这一结果提示，znf148突变(g554r，或者，g554r和v540a、d546h、q555l、s576s或p579l中的一个或多个的组合)是可行的甲状腺良性结节的分子标志物。进一步地，在481个甲状腺结节样本中，测序发现43个样本出现了znf148的基因突变，通过与病理诊断比较，其中42个样本为甲状腺良性结节，1个样本为甲状腺癌，因此，znf148突变通过“排除法”对甲状腺良性结节鉴别的阴性预测率可达97.7％(42/43，97.7％)。
[0064]
并且，在481例甲状腺结节样本中，有10个滤泡癌和7个滤泡性腺瘤。10个滤泡癌没有znf148的基因突变，7个滤泡性腺瘤中有4个存在znf148的基因突变，突变率有57.1％，是一个很高的突变率。因此，znf148突变可有效区分超声、细针穿刺和分子诊断都较难区分的甲状腺滤泡癌和甲状腺滤泡腺瘤。
[0065]
综上，以本实验例的481例甲状腺结节组织样本为例，在临床诊断过程中，如果按照图10的工作流程，先检测braf v600e的突变状态，以纳入法可以确定甲状腺恶性结节的患者(207/481，43.0％)，然后对于braf阴性的患者(274/481，57.0％)，通过检测znf148的突变情况(g554r，或者，g554r和v540a、d546h、q555l、s576s或p579l中的一个或多个的组合)，以排除法进一步排除11.3(31/274)～15.3(42/274)％的甲状腺良性结节患者(尤其是甲状腺滤泡腺瘤患者)，预期可使得这部分人能够通过分子病理受益。
[0066]
实施例1-1：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物
[0067]
本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物，所述分子标志物为znf148蛋白突变体；所述znf148蛋白突变体与znf148蛋白(氨基酸序列如seq id no.1所示)相比，第554位甘氨酸突变为了精氨酸。
[0068]
实施例1-2：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物
[0069]
本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物，所述分子标志物为znf148基因突变体；所述znf148基因突变体与znf148基因(核苷酸序列如seq id no.2所示)相比，第1660位鸟嘌呤突变为了胞嘧啶。
[0070]
实施例1-3：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物
[0071]
本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物，所述分子标志物为znf148蛋白突变体；所述znf148蛋白突变体与znf148蛋白(氨基酸序列如seq id no.1所示)相比，第540位缬氨酸突变为了丙氨酸，第546位天冬氨酸突变为了组氨酸，第554位甘氨
酸突变为了精氨酸，第555位谷氨酰胺突变为了亮氨酸，以及，第579位脯氨酸突变为了亮氨酸。
[0072]
实施例1-4：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物
[0073]
本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物，所述分子标志物为znf148基因突变体；所述znf148基因突变体与znf148基因(核苷酸序列如seq id no.2所示)相比，第1619位胸腺嘧啶突变为了胞嘧啶，第1636位鸟嘌呤突变为了胞嘧啶，第1660位鸟嘌呤突变为了胞嘧啶，第1664位腺嘌呤突变为了胸腺嘧啶，第1728位腺嘌呤突变为了胸腺嘧啶，以及，第1736位胞嘧啶突变为了胸腺嘧啶。
[0074]
实施例2-1：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒
[0075]
本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测试剂；所述检测试剂包含能够与znf148蛋白(氨基酸序列如seq id no.1所示)中第554位g
→
r突变特异性结合的抗体。
[0076]
实施例2-2：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒
[0077]
本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测试剂和扩增试剂；
[0078]
所述检测试剂包含能够与znf148基因(核苷酸序列如seq id no.2所示)中第1660位的g
→
c突变特异性结合的引物、探针或芯片；
[0079]
所述扩增试剂为核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示的引物对。
[0080]
实施例2-3：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒
[0081]
本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测试剂；所述检测试剂包含能够与znf148蛋白(氨基酸序列如seq id no.1所示)中第540位v
→
a突变，第546位d
→
h突变，第554位g
→
r突变，第555位q
→
l突变，以及，第579位p
→
l突变特异性结合的抗体。
[0082]
实施例2-4：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒
[0083]
本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测试剂和扩增试剂；
[0084]
所述检测试剂包含能够与znf148基因(核苷酸序列如seq id no.2所示)中第1619位的t
→
c突变，第1636位的g
→
c突变，第1660位的g
→
c突变，第1664位的a
→
t突变，第1728位的a
→
t突变，以及，第1736位的c
→
t突变特异性结合的引物、探针或芯片；
[0085]
所述扩增试剂为核苷酸序列如seq id no.5和seq id no.6所示的引物对。
[0086]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。