一种核酸酶p1的制备方法
技术领域
1.本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种核酸酶p1的制备方法。


背景技术：

2.随着生物技术产业和制药工业的发展，核苷酸及其衍生物的研究和开发成为热点，并逐渐形成了继氨基酸之后的又一重大产业。核苷酸是一类具有高附加值的生化物质，用途十分广阔，支撑一些较大产业的发展，如高端乳业、医药行业等。在乳业中作为功能性添加剂，它的加入能使奶粉更接近于母乳，能够有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力，减少腹泻的发生；在医药领域，核苷酸作为医药中间体是许多核苷酸类衍生物的生产原料，用于合成如cdp、udp、gtp、cdp-胆碱、sam、cgmp、ctp、utp、camp、udp-乙酰葡糖胺、gdp-甘露糖、gdp-葡萄糖、udp-葡萄糖类等上百种化合物。核苷酸类药物在抗癌、抗病毒、治疗心血管疾病、糖尿病及干扰诱导等方面具有独特的疗效，有着良好的应用效果和巨大的应用市场。国内市场对核苷酸的需求以每年30％～50％以上的速度递增，全球市场也以10％～15％左右的速度递增，每年用量在2000吨以上。
3.核苷酸生产主要采取三种方法：化学合成法、微生物发酵法及酶解法。酶解法由于降解rna可以一次得到四种核苷酸的混合物，且酶反应收率较高，国内外工业化生产核苷酸均采用此法。在酶解法制备核苷酸中所需的酶是核酸酶pl，它是一种能够水解rna获得四种5'-核苷酸的磷酸二酯酶，其酶解产物杂质少后续分离工艺简单，国外一般采用该方法进行核苷酸的生产。
4.桔青霉属于不对称青霉组，绒状青霉亚组，桔青霉系，是核酸酶p1的重要生产菌种。国内外生产核酸酶p1主要通过桔青霉液体深层发酵，现有方法方法耗时较长酶活较低。如何高效的生产核酸酶p1，降低生产成本，已成为核苷酸生产的首要任务。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种核酸酶p1的制备方法。
6.为了解决上述技术问题，本发明公开了一种核酸酶p1的制备方法，在含发酵促进剂的发酵培养基中，利用桔青霉进行发酵，制备含核酸酶p1的发酵液。
7.其中，所述发酵促进剂的制备方法包括如下步骤：
8.s1.将核糖核酸酶解，得到酶解液；
9.s2.将步骤s1所得酶解液经超滤膜超滤，所得截留物即为发酵促进剂。
10.步骤s1中，ph4～6、2～6wt％的核糖核酸水溶液与核酸酶p1在50～90℃进行酶解；优选为，ph5、4wt％的核糖核酸水溶液与核酸酶p1在70℃进行酶解。
11.其中，所述ph为经naoh调节。
12.其中，所述核糖核酸水溶液调节ph后，升温至70℃，稳定30min后，再加入核酸酶p1。
13.其中，所述核酸酶p1的用量为80～120u/g核糖核酸，优选为100u/g核糖核酸。
14.其中，所述核酸酶p1的酶活为10万u/g；核酸酶p1酶活定义：将1.9ml的底物溶液(含有浓度为1％左右的rna；0.2m ph5.2的醋酸缓冲液以0.0005m的znso4)于70℃恒温水浴10min后，加入0.1ml经适当稀释的酶液，70℃保温15min后加入2.0ml核酸沉淀剂(0.25％钼酸铵-2.5过氯酸)，冰水浴20min后离心、取上清液用蒸馏水稀释一定倍数，测定其260nm处的吸光值为a260。以先加沉淀剂者作为对照，其它操作同前。在上述条件下，每分钟所生成的核苷酸量在260nm处的吸光值的差值为1.0时定义为1个酶活力单位。
15.步骤s2中，将步骤s1所得酶解液冷却至20℃经超滤膜超滤至原体积的1/8～1/12，得到第一截留物；向所得第一截留物加水至原来的体积，再超滤至原体积的1/8～1/12，得到第二截留物；向所得第二截留物加水至原来的体积，再超滤至原体积的1/8～1/12，得到第三截留物，所得第三截留物即为发酵促进剂；优选地，每次超滤至原体积的1/10。
16.步骤s2中，所述超滤为卷式聚砜超滤膜。
17.步骤s2中，所述超滤膜的分子量为3000～10000道尔顿，优选为4000～8000道尔顿，进一步优选为5000～7000道尔顿，更进一步优选为6000道尔顿。
18.其中，上述方法制备得到的发酵促进剂含有寡核苷酸、短链rna、酵母多糖、蛋白质及酵母内含物。
19.其中，所述发酵促进剂的用量为1～20g/l发酵培养基，优选为2～18g/l发酵培养基，进一步优选为5～15g/l发酵培养基，更进一步优选为8～13g/l发酵培养基，最优选为10g/l发酵培养基。
20.其中，所述发酵培养基除发酵促进剂外，还包括葡萄糖1～100g/l，蛋白胨0.1～10g/l，磷酸二氢钾0.02～10g/l，磷酸氢二钾0.02～10g/l，硫酸镁0.02～10g/l，氯化钙0.02～10g/l。
21.其中，所述发酵培养基的溶剂为水，ph为5～9。
22.其中，所述桔青霉的保藏编号为cgmcc no.2014，该菌株记载在中国专利cn101067116a中。
23.其中，所述发酵的温度为25～35℃，优选为30℃。
24.其中，所述发酵为半连续发酵，所述半连续发酵为桔青霉在发酵罐中发酵一段时间，开始周期性地放出部分含有产物的发酵液，然后再补加相同体积的新鲜培养基的发酵方法，具体方法：a，桔青酶在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵55小时后酶活稳定在7300-7800u/ml左右；b，放出发酵液体积85％，发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子，向发酵罐补加相同体积无菌发酵培养基继续培养，发酵18个小时左右酶活稳定在7300-8200u/ml左右；c，重复上述步骤b，如此循环补料5次，停止半连续发酵。
25.其中，单批发酵的时间为18h。
26.其中，所述含核酸酶p1的发酵液的酶活为6500～8500u/ml，优选为7300～8200u/ml，进一步优选为8100～8300u/ml，更进一步优选为8200u/ml。
27.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下技术优势：
28.本发明通过添加发酵促进剂进行发酵，单批发酵时间由55h缩短至18h，酶活由2500u/ml提高至7300-8200u/ml。该方法可以显著的缩短发酵工时，提高发酵酶活，所用的发酵促进剂添加量少，同时，本发明所用的发酵促进剂为生产核苷酸的过程废弃物，无成
本，操作简单，效果显著。
具体实施方式
29.下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
30.下述实施例中所述桔青霉的保藏编号为cgmcc no.2014。
31.下述实施例中所述核酸酶p1与核糖核酸的比为质量比。
32.实施例1：
33.核糖核酸粉末用去离子水溶解成4％浓度(质量比)，用naoh调节ph至5.0，温度升至70℃，稳定30min后，加入核酸酶p1粉末(核酸酶p1：核糖核酸＝1:100，核酸酶p1的酶活10万u/g)100转/分钟搅拌状态下进行酶解，3h后酶解结束。
34.酶解液冷却至20℃，用分子量为3000道尔顿的卷式聚砜超滤膜超滤酶解液至原体积的1/10，加水至原体积，再超滤至原体积的1/10，再重复一次加水和超滤。得到的超滤膜截留物即为发酵促进剂1。
35.实施例2：
36.核糖核酸粉末用去离子水溶解成4％浓度(质量比)，用naoh调节ph至5.0，温度升至70℃，稳定30min后，加入核酸酶p1粉末(核酸酶p1：核糖核酸＝1:100，核酸酶p1的酶活10万u/g)100转/分钟搅拌状态下进行酶解，3h后酶解结束。
37.酶解液冷却至20℃，用分子量为6000道尔顿的卷式聚砜超滤膜超滤酶解液至原体积的1/10，加水至原体积，再超滤至原体积的1/10，再重复一次加水和超滤。得到的超滤膜截留物即为发酵促进剂2。
38.实施例3：
39.核糖核酸粉末用去离子水溶解成4％浓度(质量比)，用naoh调节ph至5.0，温度升至70℃，稳定30min后，加入核酸酶p1粉末(核酸酶p1：核糖核酸＝1:100，核酸酶p1的酶活10万u/g)100转/分钟搅拌状态下进行酶解，3h后酶解结束。
40.酶解液冷却至20℃，用分子量为10000道尔顿的卷式聚砜超滤膜超滤酶解液至原体积的1/10，加水至原体积，再超滤至原体积的1/10，再重复一次加水和超滤。得到的超滤膜截留物即为发酵促进剂3。
41.实施例4：
42.发酵培养基的配制：葡萄糖25g/l，蛋白胨2g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸镁0.2g/l，氯化钙0.2g/l，发酵促进剂1 10g/l，ph6.5，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。
43.半连续发酵：10l搅拌罐中装入6l培养基，灭菌后按照10％的体积比接入经麦芽汁培养基培养的桔青霉菌种的种子液进行发酵培养，在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵55小时后酶活稳定在7300u/ml左右，放出发酵液体积5.1l，发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子，配制5.1l无菌发酵培养基打入发酵罐再次培养，18h后酶活稳定至7320u/ml，再次放出5.1l发酵液，同样方法补入5.1l新鲜培养基。如此循环补料5次，酶活均在7310u/ml左右，停止半连续发酵。
44.实施例5：
45.发酵培养基的配制：葡萄糖25g/l，蛋白胨2g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸镁0.2g/l，氯化钙0.2g/l，发酵促进剂2 10g/l，ph6.5，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。
46.半连续发酵：10l搅拌罐中装入6l培养基，灭菌后按照10％的体积比接入经麦芽汁培养基培养的桔青霉菌种的种子液进行发酵培养，在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵55小时后酶活稳定在7600u/ml左右，放出发酵液体积5.1l，发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子，配制5.1l无菌发酵培养基打入发酵罐再次培养，18h后酶活稳定至8180u/ml，再次放出5.1l发酵液，同样方法补入5.1l新鲜培养基。如此循环补料5次，酶活均在8200u/ml左右，停止半连续发酵。
47.实施例6：
48.发酵培养基的配制：葡萄糖25g/l，蛋白胨2g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸镁0.2g/l，氯化钙0.2g/l，发酵促进剂3 10g/l，ph6.5，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。
49.半连续发酵：10l搅拌罐中装入6l培养基，灭菌后按照10％的体积比接入经麦芽汁培养基培养的桔青霉菌种的种子液进行发酵培养，在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵55小时后酶活稳定在7500u/ml左右，放出发酵液体积5.1l，发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子，配制5.1l无菌发酵培养基打入发酵罐再次培养，18h后酶活稳定至7620u/ml，再次放出5.1l发酵液，同样方法补入5.1l新鲜培养基。如此循环补料5次，酶活均在7600u/ml左右，停止半连续发酵。
50.对比例1：
51.发酵培养基的配制：葡萄糖25g/l，蛋白胨2g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸镁0.2g/l，氯化钙0.2g/l，ph6.5，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。
52.半连续发酵：10l搅拌罐中装入6l培养基，灭菌后按照10％的体积比接入经麦芽汁培养基培养的桔青霉菌种的种子液进行发酵培养，在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵55小时后酶活稳定在2480u/ml左右，放出发酵液体积5.1l，发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子，配制5.1l无菌发酵培养基打入发酵罐再次培养，18h后酶活稳定至2420u/ml，再次放出5.1l发酵液，同样方法补入5.1l新鲜培养基。如此循环补料5次，酶活均在2500u/ml左右，停止半连续发酵。
53.实施例7：
54.发酵培养基的配制：葡萄糖25g/l，蛋白胨2g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸镁0.2g/l，氯化钙0.2g/l，发酵促进剂2 2g/l，ph6.5，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。
55.半连续发酵：10l搅拌罐中装入6l培养基，灭菌后按照10％的体积比接入经麦芽汁培养基培养的桔青霉菌种的种子液进行发酵培养，在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵55小时后酶活稳定在6200u/ml左右，放出发酵液体积5.1l，发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子，配制5.1l无菌发酵培养基打入发酵罐再次培养，18h后酶活稳定至6730u/ml，再次放出5.1l发酵液，同样方法补入5.1l新鲜培养基。如此循环补料5次，酶活均在6700u/ml左右，停止半连续发酵。
56.实施例8：
57.发酵培养基的配制：葡萄糖25g/l，蛋白胨2g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸镁0.2g/l，氯化钙0.2g/l，发酵促进剂2 18g/l，ph6.5，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。
58.半连续发酵：10l搅拌罐中装入6l培养基，灭菌后按照10％的体积比接入经麦芽汁培养基培养的桔青霉菌种的种子液进行发酵培养，在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵55小时后酶活稳定在7620u/ml左右，放出发酵液体积5.1l，发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子，配制5.1l无菌发酵培养基打入发酵罐再次培养，18h后酶活稳定至7660u/ml，再次放出5.1l发酵液，同样方法补入5.1l新鲜培养基。如此循环补料5次，酶活均在7700u/ml左右，停止半连续发酵。
59.本发明提供了一种核酸酶p1的制备方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。