1.本发明属于呼吸道疾病检测技术领域。更具体地，涉及新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株的检测组合物、检测方法及核酸检测试剂盒(pcr-荧光探针法)。


背景技术：

2.冠状病毒(coronaviruses，cov)属于冠状病毒科，正冠状病毒亚科的冠状病毒属。冠状病毒基因组为单股正链rna，大小27 000～32 000bp，是所有rna病毒基因组中最大的。基因组由5
′‑
端非编码区、非结构蛋白orf1a/b编码区、4种主要结构蛋白编码区以及3
′‑
端非编码区组成。结构蛋白编码区主要编码刺突蛋白(spike protein，s蛋白)、包膜蛋白(envelope protein，e蛋白)、膜蛋白(membrane protein，m蛋白)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，n蛋白)。s蛋白含有受体结合区域(receptor binding domain，rbd)，能特异性结合宿主细胞表面受体，介导病毒进入宿主细胞。
3.2019新型冠状病毒(2019-ncov)所引起的新型冠状病毒肺炎(covid-19)已形成全球大流行的趋势。covid-19临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。部分患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现，多在1周后恢复。多数患者预后良好，感染严重者可导致肺炎、严重畸形呼吸综合征、肾衰竭，更有甚者可导致死亡。
4.随着新型冠状病毒不断进化和变异，相继出现多种关切变异株。被科学家命名为德尔塔(delta)变异株的新型冠状病毒突变株，具有传播力强、感染潜伏期短、致病性强、发病进程快等特点，逐渐成为印度乃至全球主要的流行毒株，并导致多个国家和地区的疫情反弹。
5.因此，本领域技术需要能够快速、准确方便的检测德尔塔(delta)变异株的方法和试剂盒，以满足临床和公共卫生管理的需求。


技术实现要素：

6.本发明针对新型冠状病毒及其德尔塔(delta)变异株开发了检测的方法和试剂盒，以便能够高效率、高特异性、低成本的对核酸样本进行检测，并且需要保证检测结果的可靠性。
7.在本发明的第一方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒及其德尔塔(delta)变异株的引物对集，所述引物对集包括第一引物对组，所述第一引物对组包括第一引物对和第二引物对：
8.其中，所述第一引物对特异性扩增新型冠状病毒orf1ab基因，所述第一引物对包括：
9.如seq id no.10所示的正向引物；和，如seq id no.11所示的反向引物；
10.所述第二引物对特异性扩增新型冠状病毒德尔塔变异株s基因p681r位点，所述第二引物对包括：
11.如seq id no.7所示的正向引物；和，如seq id no.8所示的反向引物。
12.在另一优选例中，所述引物对集还包括第三引物对，所述第三引物对特异性扩增新型冠状病毒德尔塔变异株s基因l452r位点，所述第三引物对包括：
13.如seq id no.1所示的正向引物；和，如seq id no.2所示的反向引物。
14.在另一优选例中，所述引物对集还包括第四引物对，所述第四引物对特异性扩增新型冠状病毒德尔塔变异株s基因t478k位点，所述第四引物对包括：
15.如seq id no.4所示的正向引物；和，如seq id no.5所示的反向引物。
16.本发明的第二方面，提供了一种用于用于检测新型冠状病毒及其德尔塔变异株的探针集，所述探针集包括：
17.核苷酸序列如seq id no.12所示的第一探针；
18.核苷酸序列如seq id no.9所示的第二探针。
19.在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如seq id no.3所示的第三探针。
20.在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如seq id no.6所示的第四探针。
21.在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
22.在另一优选例中，所述第一探针和所述第二探针标记的荧光报告基团互不相同。
23.本发明的第三方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒及其德尔塔变异株的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。
24.在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。
25.在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多重成分：热启动taq酶、逆转录酶、udg酶(尿嘧啶-n-糖基化酶)、dntps。
26.在另一优选例中，所述试剂盒还包括阴性质控品。
27.在另一优选例中，所述试剂盒还包括阳性质控品。
28.在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含第一引物探针混合液，所述第一引物探针混合液包括：所述第一引物对、所述第二引物对、所述第一探针和所述第二探针标。
29.在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内包含第二引物探针混合液，所述第二引物探针混合液包括：所述第三引物对和所述第三探针标。
30.在另一优选例中，所述试剂盒包括第三容器，所述第三容器内包含第三引物探针混合液，所述第三引物探针混合液包括：所述第四引物对和所述第四探针标。
31.本发明的第四方面，提供了一种检测新型冠状病毒及其德尔塔变异株的方法，所述方法包括步骤：
32.(1)提供待检测对象的核酸样本；
33.(2)制备荧光定量pcr反应体系并进行荧光定量pcr检测：
34.其中，所述荧光定量pcr反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针集。
35.在另一优选例中，所述荧光定量pcr反应体系包括第一检测体系，所述第一检测体系包括：所述第一引物对、所述第二引物对、所述第一探针和所述第二探针标。
36.在另一优选例中，所述荧光定量pcr反应体系还包括第二检测体系，所述第二检测体系包括：所述第三引物对和所述第三探针标。
37.在另一优选例中，所述荧光定量pcr反应体系还包括第三检测体系，所述第三检测体系包括：所述第四引物对和所述第四探针标。
38.在另一优选例中，所述核酸样本可来自咽拭子样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、痰液样本、粪便样本或环境样本。
39.在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。
40.在另一优选例中，所述荧光定量pcr反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。
41.在另一优选例中，所述pcr反应体系还包括pcr反应酶系。
42.本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备pcr检测试剂盒，所述pcr检测试剂盒用于检测新型冠状病毒及其德尔塔变异株。
43.在另一优选例中，所述pcr为荧光定量pcr。
44.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
45.图1为l452r位点检测引物的灵敏度检测结果。
46.图2为t478k检测引物的灵敏度检测结果。
47.图3a为p681r/1ab(fam通道)检测引物的灵敏度检测结果。
48.图3b为p681r/1ab(vic通道)检测引物的灵敏度检测结果。
49.图4为l452r位点检测引物的精密度检测结果。
50.图5为t478k位点检测引物的精密度检测结果。
51.图6为p681r/orf1ab位点检测引物的精密度检测结果。
52.图7为l452r位点检测引物的特异性检测结果。
53.图8为t478k位点检测引物的特异性检测结果。
54.图9为p681r/orf1ab位点检测引物的特异性检测结果。
55.图10为实际临床样本的l452r位点体系检测结果。
56.图11为实际临床样本的t478k位点体系检测结果。
57.图12a为实际临床样本p681r/orf1ab位点(fam通道)检测结果。
58.图12b为实际临床样本p681r/orf1ab位点(vic通道)检测结果。
59.图13为l452r位点对照引物检测新型冠状病毒野生型毒株和德尔塔变异株的检测结果。
60.图14为t478k位点对照引物检测新型冠状病毒野生型毒株和德尔塔变异株的检测结果。
61.图15为p681r位点对照引物检测新型冠状病毒野生型毒株和德尔塔变异株的检测结果。
62.图16为对比例2orf1ab基因引物探针和l452r位点引物探针组合的检测结果。
63.图17为对比例2orf1ab基因引物探针和t478k位点引物探针组合的检测结果。
具体实施方式
64.本发明针对新型冠状病毒德尔塔变异株，选取野生型新型冠状病毒orf1ab基因和德尔塔变异株s基因中的l452r位点、t478k位点和p681r位点突变位点开发诊断试剂，目的在于提供一种新型冠状病毒及其德尔塔变异株的检测试剂盒，以便能够高效率、高特异性、高稳定性、低成本的对新型冠状病毒及其德尔塔变异株感染患者进行检测。
65.在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
66.除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
67.虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
68.实时荧光pcr是基于荧光共振能量转移(fret)原理的技术。其中，以taqman荧光标记探针为基础的实时荧光pcr技术利用热稳定dna聚合酶taq酶在具有5
’‑3’
方向的聚合酶活性的同时，还具有对聚合延伸过程中遇到的与靶序列结合的核苷酸序列的5
’‑3’
方向的核酸外切酶活性。taqman荧光探针在5’和3’端分别标记荧光发射基团和淬灭基团，探针的3’末端被磷酸化以防止探针在pcr扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用即被解除，荧光发射基团发射波长处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板dna发生杂交，延伸期taq酶随引物延伸沿dna模板移动，当移动至探针位置时，taq dna多聚酶的5
′
核酸外切酶活性能降解特异性荧光标记探针，荧光报告基团和淬灭基团分离，荧光发射出来。
69.多重pcr(multiplex pcr)，又称多重引物pcr或复合pcr，它是在同一pcr反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的pcr反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般pcr相同。
70.影响多重pcr反应的因素有很多，比如：
71.(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是dna聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
72.(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
73.(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行pcr反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
74.(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方dna介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
75.虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
76.本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种能够检测新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点的检测组合物、检测方法及检测试剂盒。
77.本发明的第一个目的是提供新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点的检测组合物.
78.本发明的第二个目的是提供新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点的检测方法。
79.本发明的第三个目的是提供新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点的核酸检测试剂盒。
80.在本发明一个优选地实施方式中，本发明提供的检测新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株的检测组合物，包含检测新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株的特异性引物，检测新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株s基因中l452r位点、t478k位点和p681r位点突变的上游引物分别为452-2f3、t478k-f2和681-f1，其序列分别如seq id no.1、seq id no.4、seq id no.7所示，下游引物分别为452-r1、t478k-r1和681-r1，其序列分别如seq id no.2、seq id no.5、seq id no.8所示，探针分别为452-p1、t478k-p1、681-p2，其序列如seq id no.3、seq id no.6、seq id no.9所示；检测新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株orf1ab基因的上游引物为orf1ab-2f1，其序列如seq id no.10所示，下游引物为orf1ab-2r1，其序列如seq id no.11所示，探针为orf1ab-2p，其序列如seq id no.12所示。
81.进一步地，681-p2的5’端荧光发射基团为fam，3’淬灭基团为bhq1；，452-p1和t478k-p1的5’端荧光发射基团为fam，3’淬灭基团为mgb；orf1ab-2p的5’端荧光发射基团为vic，3’淬灭基团为bhq1。
82.在本发明一个优选地实施方式中，本发明提供了新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株的检测方法，提取待测样本中的核酸作为模板，加入本发明所述检测组合物的反应体系中进行荧光pcr反应，通过荧光qpcr反应结果判断所测样本中是否存在新型冠状病毒或新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株，阳性检测结果的判断依据为
△
ct《7，其中
△
ct＝|突变ct值-orf1ab ct值|，orf1ab ct值是指p681r/orf1ab pcr反应管中vic通道的ct值，l452r、t478k和p681r检测结果均为突变，可判断为新型冠状病毒德尔塔变异株。
83.进一步地，新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株s基因的l452r位点的荧光定量pcr反应体系为：待检测核酸样本5μl，5
×
pcr buffer 5μl，452-2f3(100p)0.1μl，452-r1(100p)0.1μl，452-p1(100p)0.1μl，rnase-free dd h2o 11.7μl，酶系3μl。
84.进一步地，t478k位点的荧光定量pcr反应体系为：待检测核酸样本5μl，5
×
pcr buffer 5μl，t478k-f2(100p)0.1μl，t478k-r1(100p)0.1μl，t478k-p1(100p)0.1μl，rnase-free dd h2o 11.7μl，酶系3μl。
85.进一步地，orf1ab和p681r位点的荧光定量pcr反应体系为：待检测核酸样本5μl，5
×
pcr buffer 5μl，orf1ab-2f1(100p)0.1μl，orf1ab-2r1(100p)0.1μl，orf1ab-2p(100p)0.1μl，681-f1(100p)0.1μl，681-r1(100p)0.1μl，681-p2(50p)0.1μl，rnase-free dd h2o 11.7μl，酶系3μl。
86.进一步地，荧光定量pcr反应的反应条件为：50℃，15min，1个循环；95℃，15min，1个循环；94℃，15sec，55℃，45sec，45个循环。
87.进一步地，所述酶系中含有热启动taq酶、udg酶、c-mmlv酶。
88.进一步地，所述dntps中还含有2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐。
89.进一步地，引物452-2f3终浓度为10pmol，452-r1终浓度为10pmol，452-p1终浓度为10pmol，t478k-f2终浓度为10pmol，t478k-r1终浓度为10pmol，t478k-p1终浓度为10pmol，681-f1终浓度为10pmol，681-r1终浓度为10pmol，681-p2终浓度为5pmol，orf1ab-2f1终浓度为10pmol，orf1ab-2r1终浓度为10pmol，orf1ab-2p终浓度为10pmol。
90.在本发明一个优选地实施方式中，本发明提供了新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株的核酸检测试剂盒，含有本发明的检测组合物及荧光pcr反应所需试剂。
91.进一步地，所述试剂盒中还含有热启动taq酶、udg酶、c-mmlv酶和含2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐的dntps。
92.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
93.本发明分析了新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株的基因组信息与特性，选择orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点，并在这些区域中设计出针对orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点的特异性引物序列。通过大量筛选和优化，最终确定了一套灵敏度和特异性最优的引物组合序列。
94.本发明首先提供了新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点的检测组合物，其包含特异性引物序列；其中，检测s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点突变的上游引物分别为452-2f3、t478k-f2和681-f1，其序列分别如seq id no.1、seq id no.4、seq id no.7所示，下游引物分别为452-r1、t478k-r1和681-r1，其序列分别如seq id no.2、seq id no.5、seq id no.8所示，探针分别为452-p1、t478k-p1、681-p2，其序列如seq id no.3、seq id no.6、seq id no.9所示；检测新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株orf1ab基因的上游引物为orf1ab-2f1，其序列如seq id no.10所示，下游引物为orf1ab-2r1，其序列如seq id no.11所示，探针为orf1ab-2p，其序列如seq id no.12所示。
95.优选地，681-p2的5’端荧光发射基团为fam，3’淬灭基团为bhq1；，452-p1和t478k-p1的5’端荧光发射基团为fam，3’淬灭基团为mgb；orf1ab-2p的5’端荧光发射基团为vic，3’淬灭基团为bhq1，见实施例1。
96.本发明还提供了新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点的检测方法，首先提取待测样本中的核酸作为模板，分别加入含有seq id no.1～12所示检测组合物的反应体系中进行荧光pcr反应，通过结果判断所测样本中是否存在新型冠状病毒或新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株，阳性检测结果的判断依据为
△
ct《7，其中
△
ct＝|突变ct值-orf1ab ct值|，orf1ab ct值是指p681r/orf1ab pcr反应管中vic通道的ct值，l452r、t478k和p681r检测结果均为突变，可判断为新型冠状病毒德尔塔变异株。
97.其中，所述样本可为咽拭子/痰液。
98.l452r位点的荧光定量pcr反应体系为：待检测核酸样本5μl，5
×
pcr buffer 5μl，452-2f3(100p)0.1μl，452-r1(100p)0.1μl，452-p1(100p)0.1μl，rnase-free dd h2o 11.7
μl，酶系3μl；t478k位点的荧光定量pcr反应体系为：待检测核酸样本5μl，5
×
pcr buffer 5μl，t478k-f2(100p)0.1μl，t478k-r1(100p)0.1μl，t478k-p1(100p)0.1μl，rnase-free dd h2o 11.7μl，酶系3μl；p681r位点的荧光定量pcr反应体系为：待检测核酸样本5μl，5
×
pcr buffer 5μl，681-f1(100p)0.1μl，681-r1(100p)0.1μl，681-p2(50p)0.1μl，rnase-free dd h2o 11.7μl，酶系3μl；orf1ab的荧光定量pcr反应体系为：待检测核酸样本5μl，5
×
pcr buffer 5μl，orf1ab-2f1(100p)0.1μl，orf1ab-2r1(100p)0.1μl，orf1ab-2p(100p)0.1μl，rnase-free dd h2o 11.7μl，酶系3μl；见实施例2。
99.所述酶系中含有udg酶、热启动taq抗体酶、taq酶、dntp、rna常温酶系保存液；其中，所述dntps中含有2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐(dutp)。
100.优选地，荧光定量pcr反应的反应条件为：50℃，15min，1个循环；95℃，15min，1个循环；94℃，15sec，55℃，45sec，45个循环，见实施例2。
101.更优选地，引物452-2f3终浓度为10pmol，452-r1终浓度为10pmol，452-p1终浓度为10pmol，t478k-f2终浓度为10pmol，t478k-r1终浓度为10pmol，t478k-p1终浓度为10pmol，681-f1终浓度为10pmol，681-r1终浓度为10pmol，681-p2终浓度为5pmol，orf1ab-2f1终浓度为10pmol，orf1ab-2r1终浓度为10pmol，orf1ab-2p终浓度为10pmol，见实施例2。
102.本发明还提供新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株的核酸检测试剂盒，其含有seq id no.1～12所示引物及荧光定量pcr反应所需试剂。
103.优选地，所述荧光pcr反应所需试剂中的酶为热启动taq酶，见实施例2。
104.优选地，所述试剂盒中还含有尿嘧啶dna糖基化酶(udg酶)和含2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐(dutp)的dntps，见实施例2。
105.本发明的有益效果在于：
106.(1)本发明基于pcr-荧光探针法，以新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点为靶区域，通过设计筛选特异性引物探针，建立了可同时检测新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株orf1ab基因和s基因的检测方法及核酸检测试剂盒。
107.(2)本发明所述新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株的检测方法，具有特异性强，灵敏度高，操作简洁，检测快速、准确等优势，为新型冠状病毒变异株的研究提供快速、特异、可重复的检测手段，可用于实际样本中型冠状病毒德尔塔(delta)突变株的定性检测，用于新型冠状病毒的研究。
108.本发明适用于对新型冠状病毒的检测，为病毒鉴定分型和防控提供可靠的依据，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在疫情防控过程中，使用本发明的检测方法对环境中的病毒核酸进行检测，这些病毒核酸信息可以作为公众健康管理之需。
109.下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。例如，本发明实施例中涉及的热启动taq酶、udg酶、c-mmlv酶、rnasin可购自invitrogen公司。
110.实施例1引物的设计和筛选
111.1、引物和探针的设计
112.本发明分析了新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株orf1ab基因和s基因的基因信息特点，orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点作为靶区域，并设计了特异性引物。
113.本发明同时构建了orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点的目的片段的重组质粒，将合成的目的片段连接到构建好的puc57载体中并转化表达大肠埃希菌dh5α感受态细胞，经蓝白斑筛选获得带有重组质粒的细菌，提取重组质粒进行pcr扩增并测序鉴定。
114.2、引物和探针的筛选
115.(1)单通道引物探针ntc测试
116.为从上述设计的引物中选出最佳的引物，本发明分别进行了引物测试。
117.首先针对orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点分别进行了引物测试，将设计得到的引物分别配制成单一pcr反应液进行ntc测试，将构建的重组质粒依10倍稀释成4个浓度梯度，作为阳性模板进行检测，选择ntc无非特异性扩增且阳性模板扩增效率好的引物进行下一步实验。
118.(2)双通道引物探针测试
119.将(1)中选出的s基因中l452r位点、t478k位点和p681r位点的最佳引物探针分别与orf1ab基因的最佳引物探针组合配制成pcr反应体系进行ntc测试，将构建的重组质粒依10倍稀释成4个浓度梯度，作为阳性模板进行检测，检测结果发现在阳性模板的p681r/orf1ab的组合扩增效率最好。
120.故最终选择以此作为最佳引物探针组合。具体序列如表1所示：
121.表1引物及探针序列
122.序列名称序列452-2f3ctaaggttggtggtaattataattcccg(seq id no.1)452-r1accggcctgatagatttcagtt(seq id no.2)452-p1taggaagtctaatctcaaacc(seq id no.3)t478k-f2aaatctatcaggccggtaacga(seq id no.4)t478k-r1ttaggtccacaaacagttgctgg(seq id no.5)t478k-p1catatggtttccaacccac(seq id no.6)681-f1gctagttatcagactcagactaattttcg(seq id no.7)681-r1ctgaattttctgcaccaagtgac(seq id no.8)681-p2agtgtagctagtcaatccatcattgcctacac(seq id no.9)orf1ab-2f1gattacgtgctaagcactatgtg(seq id no.10)orf1ab-2r1ttagttagcaatgtgcgtggtg(seq id no.11)orf1ab-2ptacattggcgaccctgctcaattacctg(seq id no.12)
123.其中，检测s基因的l452r位点、t478k位点、p681r位点和orf1ab基因的上游引物分别为452-2f3、t478k-f2、681-f1、orf1ab-2f1，其序列依次如seq id no.1、seq id no.4、seq id no.7、seq id no.10所示，下游引物分别为452-r1、t478k-r1、681-r1、orf1ab-2r1，
其序列分别如seq id no.2、seq id no.5、seq id no.8、seq id no.11所示，探针分别为452-p1、t478k-p1、681-p2、orf1ab-2p，其序列分别如seq id no.3、seq id no.6、seq id no.9、seq id no.12所示；
124.681-p2的5’端荧光发射基团为fam，3’淬灭基团为bhq1；452-p1和t478k-p1的5’端荧光发射基团为fam，3’淬灭基团为mgb；orf1ab-2p的5’端荧光发射基团为vic，3’淬灭基团为bhq1。
125.实施例2检测方法及核酸检测试剂盒
126.为了确定引物和探针的检测体系，本发明还分别检测了不同终浓度的引物探针对荧光pcr反应的影响。
127.(1)引物和探针用量的优化
128.将实施例1中经筛选确认得到的引物探针配制成一定浓度的溶液，再调整引物探针的用量，组合配制成不同的pcr反应体系，将合成的重组质粒10倍稀释成4个浓度梯度作为阳性模板进行扩增，检测不同引物探针用量对检测效果的影响，选定合适的引物探针浓度及用量。
129.表2 l452r位点检测体系中引物探针用量的优化
[0130][0131][0132]
表3 t478k位点检测体系中引物探针用量的优化
[0133][0134]
表4 p681r/orf1ab位点检测体系中引物探针用量的优化
[0135][0136]
检测结果发现，当反应体系中引物452-2f3终浓度为10pmol，452-r1终浓度为10pmol，452-p1终浓度为10pmol，t478k-f2终浓度为10pmol，t478k-r1终浓度为10pmol，t478k-p1终浓度为10pmol，681-f1终浓度为10pmol，681-r1终浓度为10pmol，681-p2终浓度为5pmol，orf1ab-2f1终浓度为10pmol，orf1ab-2r1终浓度为10pmol，orf1ab-2p终浓度为10pmol时，扩增曲线及扩增效率最好。
[0137]
(2)优化udg酶的用量
[0138]
将经筛选确认得到的引物探针组合配制成pcr反应体系，采用不同量的udg酶(分别为0.25u、0.5u、0.75u)，配制成多个体系(体系4、体系5、体系6)，取数量级为103copies/ml的扩增产物作为污染源(待检样本)进行检测。
[0139]
表5 p681r/orf1abudg酶量的优化
[0140][0141][0142]
检测结果发现，当udg酶的酶量为0.4u、0.65u时扩增产物的检测结果均为阴性，最终确定udg酶的最佳反应浓度为0.4u/20μl体系。
[0143]
udg酶的作用为防止扩增产物的污染，其作用机理是选择性水解断裂含有dutp的
双链或者单链dna中的尿嘧啶糖苷键，形成有缺失碱基的dna链，使其在碱性介质以及高温下进一步水解断裂，从而被消除。
[0144]
荧光pcr反应在abi7500荧光pcr仪上进行，最终反应条件如表6所示：
[0145]
表6荧光pcr反应条件
[0146][0147]
检测时，以提取的待测样本中的核酸为模板，将表1所示检测orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点的qpcr引物分别按照筛选后的最佳配制反应体系进行反应，通过在对应的检测通道的pcr反应结果判断所测样本中是否存在新型冠状病毒或新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株，阳性检测结果的判断依据为
△
ct《7，其中
△
ct＝|突变ct值-orf1ab ct值|，orf1ab ct值是指p681r/orf1ab pcr反应管中vic通道的ct值，l452r、t478k和p681r检测结果均为突变，可判断为新型冠状病毒德尔塔变异株。。
[0148]
本发明还提供了检测新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点的核酸检测试剂盒，其包含seq id no.1～12所示引物及荧光pcr反应所需试剂。
[0149]
荧光pcr反应所需试剂中的酶系包含udg酶、热启动taq抗体酶、taq酶、dntp、rna常温酶系保存液。
[0150]
实施例3灵敏度检测
[0151]
将含新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点的目的基因的重组质粒混合后作为初始样本，并稀释至浓度为108copies/ml，再依次稀释至107、106、105、104、103和500copies/ml作为待检样本，检测引物探针的灵敏度，反应体系及条件同实施例2。
[0152]
为避免曲线相互重叠影响查看，本发明通过检测探针所对应的荧光通道对结果进行了观察。
[0153]
图1为l452r位点检测引物的灵敏度检测结果。
[0154]
图2为t478k检测引物的灵敏度检测结果。
[0155]
图3a.p681r/orf1ab(fam通道)检测引物的灵敏度检测结果。
[0156]
图3b.p681r/orf1ab(vic通道)检测引物的灵敏度检测结果。
[0157]
由图可知，l452r位点、t478k位点和p681r位点检测梯度稀释后的样本的检测结果的线性较好，灵敏度高，最低检测限为500copies/ml。
[0158]
实施例4精密度检测
[0159]
分别选取浓度为104copies/ml的含orf1ab基因和s基因的l452r位点、t478k位点和p681r位点的目的片段的重组质粒进行精密度检测，重复10次。
[0160]
为避免曲线相互重叠影响查看，本发明通过检测探针所对应的荧光通道对结果进行了观察，结果如图4～6所示。
[0161]
图4为l452r位点检测引物的精密度检测结果。
[0162]
图5为t478k位点检测引物的精密度检测结果。
[0163]
图6为p681r/orf1ab位点检测引物的精密度检测结果。
[0164]
由图4～6可知，l452r、t478k和p681r/orf1ab位点检测的重复性较好。
[0165]
实施例5特异性检测
[0166]
为检测所设引物的特异性，本发明以mers冠状病毒假病毒、冠状病毒oc43+冠状病毒nl63模拟样本、冠状病毒229e+冠状病毒hku1、副流感病毒+甲型流感病毒、腺病毒+呼吸道合胞病毒、sars冠状病毒假病毒为模板进行特异性检测，结果如图7～9所示，由图可知，本发明所设的l452r、t478k和p681r/orf1ab的引物探针与其他感染部位相同或感染症状相似的样本无交叉反应，具有较高的特异性。
[0167]
实施例6临床样本的实际检测
[0168]
本发明收集了10例德尔塔变异株和10例新冠病毒野生型临床样本的核酸，取5μl提取的核酸样本加入配制好的pcr反应体系中，进行扩增反应。
[0169]
通过检测结果判断所测样本中是否存在新型冠状病毒或新型冠状病毒德尔塔(delta)突变株。
[0170]
阳性检测结果的判断依据为
△
ct《7，其中
△
ct＝|突变ct值-orf1ab ct值|，orf1ab ct值是指p681r/orf1ab pcr反应管中vic通道的ct值，突变ct值是指l452r、t478k和p681r突变位点分别测得的ct值。l452r、t478k和p681r位点判定结果均为突变，可判断为新型冠状病毒德尔塔变异株。
[0171]
10例德尔塔变异株的检测结果如图所示：
[0172]
图10为实际临床样本的l452r位点体系检测结果；
[0173]
图11为实际临床样本的t478k位点体系检测结果；
[0174]
图12a为实际临床样本p681r/orf1ab位点(fam通道)检测结果；
[0175]
图12b为实际临床样本p681r/orf1ab位点(vic通道)检测结果。
[0176]
10例样本的l452r位点、t478k位点和p681r/orf1ab位点的判定结果均为阳性，表明本发明所建立的检测方法可用于临床样本的实际检测。
[0177]
10例新冠病毒野生型临床样本中，检测结果均为非德尔塔变异株。
[0178]
对比例1
[0179]
本发明人在研究过程中，针对新型冠状病毒德尔塔变异株核酸序列筛选了数十组pcr引物和探针，经过大量测试，最终获得了灵敏度和特异性能够满足临床检测需求，且能够进行多重检测的引物、探针组合。
[0180]
由于新型冠状病毒和德尔塔突变株的基因序列差异极小，因此开发能够准确识别新型冠状病毒德尔塔突变株的检测试剂难度较大，很容易出现对野生型新型冠状病毒的误判。
[0181]
例如，针对德尔塔变异株检测靶标，本发明人经过了大量的筛选、组合，设计的部分典型引物序列如下：
[0182]
l452r位点对照引物：
[0183]
l452r-f8：ctaaggttggtggtaattataattccag(seq id no.13)
[0184]
l452r-r3：acaccattagtgggttggaaacc(seq id no.14)
[0185]
t478k位点对照引物：
[0186]
t478k-f6：aaatctatcaggccggtaacta(seq id no.15)
[0187]
t478k-r2：acaaacagttgctggtgcatg(seq id no.16)
[0188]
p681r位点对照引物：
[0189]
p681r-f2：gctagttatcagactcagactaatttgcg(seq id no.17)
[0190]
p681r-r4：gcaactgaattttctgcaccaagt(seq id no.18)
[0191]
具体检测步骤、检测条件、探针序列同以上实施例，进行pcr检测测试。
[0192]
使用l452r位点对照引物检测新型冠状病毒野生型毒株和德尔塔变异株检测结果表明该l452r位点对照引物无法区分新型冠状病毒野生型毒株和德尔塔变异株，因此该位点对照引物弃用(图13)。
[0193]
使用t478k位点对照引物检测新型冠状病毒野生型毒株和德尔塔变异株检测结果表明该t478k位点对照引物无法区分新型冠状病毒野生型毒株和德尔塔变异株，因此该位点对照引物弃用(图14)。
[0194]
使用p681r位点对照引物：检测新型冠状病毒野生型毒株和德尔塔变异株检测结果表明该p681r位点对照引物无法区分新型冠状病毒野生型毒株和德尔塔变异株，因此该位点对照引物弃用(图15)。
[0195]
对比例2
[0196]
本发明人发现，多重体系中使用orf1ab基因引物探针分别和l452r、t478k、p681r位点引物探针组合，检测新型冠状病毒德尔塔变异株，不同组合的检测效果差异巨大。
[0197]
将筛选选出的s基因中l452r位点、t478k位点和p681r位点的最佳引物探针分别与orf1ab基因的最佳引物探针组合配制成pcr反应体系进行ntc测试。
[0198]
orf1ab基因引物探针和l452r位点引物探针组合的检测结果表明该组合的荧光高度相差在2倍以上，及其灵敏度较差，最低检测限为1000copies/ml(图16),因此该组合弃用。
[0199]
orf1ab基因引物探针和t478k位点引物探针组合的检测结果表明该组合的荧光高度相差较大及其灵敏度较差，最低检测限为1000copies/ml，因此该组合弃用。(图17)
[0200]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。