1.本发明涉及微生物矿物肥料技术领域，特别是一种煤矸石微生物真菌肥料及其制作方法。


背景技术：

2.我国是煤炭生产大国，煤炭在我国的能源结构中占据重要地位。在煤炭开采煤炭开采和洗选过程中产生的固体废弃物，同时也是我国目前堆积量最大的工业废弃物之一。目前，煤矸石的主要处置方式是露天堆积，而大量的煤矸石堆放会造成一系列危害：(1)煤矸石大量堆放占用土地资源，存在溃坝等安全隐患；(2)煤矸石风化自燃会产生粉尘，排放co、co2、so2、h2s、no
x
等有害气体以及造成重金属污染；(3)煤矸石经雨水淋洗后，其中成份会被逐渐溶解，并随雨水流进土壤，从而影响土壤、地下水和地表水的质量。
3.从上述可以看出，煤矸石不能只进行简单地堆积和掩埋，煤矸石的综合利用才是消除煤矸石危害的最彻底的方法。
4.近年来煤矸石的利用方式主要有：作为燃料替代煤炭或掺入煤炭；生产化工产品以及新型材料；提取稀有元素；用作建筑材料，主要是制砖、制作水泥、用作混凝土掺和料、制作保温材料以及用作筑路和填充材料。煤矸石作为燃料时，含碳量太低，导致效率低下；作为建筑材料时，由于煤矸石中的硫、有机质等的氧化，会导致鼓包、粉化，硫、磷、氮等成份还会影响煤矸石制品的强度和质量。因此，至今煤矸石未得到有效利用。
5.煤矸石中的有机质含量一般在15％～25％，并含有丰富的植物生长所需的氮、磷、钾、钙等元素，因此，可将其用作制备微生物矿物肥料的原料。煤矸石所含的磷、钾等成份大多以难溶的矿物形式存在，不能被植物直接吸收利用，煤矸石能作为生产矿物肥料的关键是将难溶磷、钾等转化为可溶形式。
6.研究表明，部分微生物能解离煤矸石，将其中的以难溶形式存在的磷、钾、钙、氮等转化为能被植物吸收的有效磷、速效钾、有交换性钙、水解氮等。用煤矸石作为原料，制备微生物肥料，是煤矸石资源化应用的新思路。利用煤矸石制备微生物肥料，必须要筛选和培育出能高效解离煤矸石的微生物细菌以及合适的制作方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于，提供一种煤矸石微生物真菌肥料及其制作方法。本发明的煤矸石微生物真菌肥料使用了烟曲霉gzt-asp01处理煤矸石，可以有效地使煤矸石中的不溶性的磷、钾、钙、氮等成分转变成有效磷、速效钾、交换性钙、水解氮等植物能吸收的营养成分，实现煤矸石资源化再利用，并且本发明提供的烟曲霉gzt-asp01解离煤矸石的工艺流程，效果显著，成本低，绿色环保。
8.本发明的技术方案：一种煤矸石微生物真菌肥料，肥料组分包括或为用烟曲霉gzt-asp01处理原料得到的产物；所述原料的主要成分为煤矸石或为煤矸石。
9.前述的煤矸石微生物真菌肥料中，所述的烟曲霉gzt-asp01，于2021年06月25日保
藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m 2021784。
10.前述的煤矸石微生物真菌肥料中，所述原料的主要成分为煤矸石时，其他原料包括含磷矿物。
11.一种煤矸石微生物真菌肥料的制作方法，所述用烟曲霉gzt-asp01处理原料的方法是：将原料破碎，将烟曲霉gzt-asp01配制成菌液；在连续搅拌下，将菌液喷洒在破碎后的原料上，搅拌均匀，定时翻动，控制温度处理，晾干，得到产物。
12.前述的煤矸石微生物真菌肥料的制作方法中，所述原料破碎后过60-100目筛。
13.前述的煤矸石微生物真菌肥料的制作方法中，所述菌液的浓度为1.0
×
10
10-1.5
×
10
10
cfu/ml。
14.前述的煤矸石微生物真菌肥料的制作方法中，所述菌液与原料中煤矸石体积质量比为1:1。
15.前述的煤矸石微生物真菌肥料的制作方法中，所述定时翻动是每间隔4-6小时翻动一次。
16.前述的煤矸石微生物真菌肥料的制作方法中，所述控制温度的温度是28-32℃。
17.前述的煤矸石微生物真菌肥料的制作方法中，所述控制温度处理的时间是6-8天。
18.述烟曲霉菌菌株已送保藏，其保藏信息如下：
19.保藏单位代码：cctcc
20.地址：中国.武汉.武汉大学
21.是否存活：是
22.保藏日期：2021年06月25日
23.保藏编号：cctcc no:m 2021784
24.分类命名：烟曲霉gzt-asp01
25.aspergillus fumigatiaffinis strain gzt-asp01
26.本发明的有益效果
27.1、本发明采用烟曲霉gzt-asp01处理煤矸石，将煤矸石中的不溶性磷、钾、钙、氮等成分，转化为有效磷、速效钾、交换性钙、水解氮等植物能吸收的营养成分，特别是能有效地解离煤矸石中的难溶性磷和/或不溶性磷，实现煤矸石资源化再利用。
28.2、本发明利用烟曲霉gzt-asp01处理煤矸石释放其中的营养成分，工艺简单可靠，成本低，是一种对环境友好的煤矸石利用的新思路。
29.3、本发明用煤矸石作为原料或主要原料(其他原料是含磷矿物，作用是增加制备微生物肥料的磷源)，用烟曲霉gzt-asp01处理煤矸石，制备煤矸石微生物真菌肥料。
30.4、在土壤中施用本发明提供的煤矸石微生物真菌肥料后，能给土壤中引入烟曲霉gzt-asp01菌株，该菌株存活后，能不断地解离土壤中的难溶性磷等，提高土壤的磷吸收系数，改善土壤吸收利用磷的能力。
31.5、本发明提供的煤矸石微生物真菌肥料的制作方法，主要技术参数参数是：原料破碎后过60-100目筛、菌液的浓度为1.0
×
10
10-1.5
×
10
10
cfu/ml、菌液与原料中煤矸石体积质量比为1:1、定时翻动是每间隔4-6小时翻动一次、制温度的温度是28-32℃、控制温度处理的时间是6-8天。这些参数均是通过大量单因素实验和正交设计实验得到，在本发明参数范围内进行gzt-asp01解离煤矸石的解离效果最好，若超出本发明参数进行，则无法得到
很好的解离效果。在本发明提出的最优参数条件下进行，本发明烟曲霉gzt-asp01解离煤矸石的总体效果优于巨大芽孢杆菌(也按照最优解离参数进行)，主要指标有效磷、速效钾等指标均优于巨大芽孢杆菌。
附图说明
32.图1是本发明gzt-asp01菌株生长曲线；
33.图2是本发明gzt-asp01菌株菌落外观图；
34.图3是本发明gzt-asp01菌体显微形态图；
35.图4是gzt-asp01菌株基于18s rrna基因序列建立的系统进化树(基于18s rrna基因序列比对结果以ef024313.1为外枝构建的neighbor-joining系统发育树)。
具体实施方式
36.下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
37.实施例1：功能菌株的分离与筛选
38.1)样品的采集
39.(1)样品采自于贵州某煤炭产区煤矸石山及附近土壤。选择长势良好的植物根部土壤，先将地表土壤铲去，沿植物根部挖10～20cm，采用“抖根法”将土壤收集于无菌自封袋中。
40.(2)冰盒密封带回实验室，剔除植物残体后，碾碎过20目筛。
41.(3)将样品保存于4℃冰箱中冷藏保存。
42.2)功能菌株的筛选
43.(1)准确称取1g样品于灭菌的250ml的锥形瓶中，加入99ml无菌水。
44.(2)在170r/min，28℃左右的恒温摇床中振荡30min。
45.(3)振荡30min以后，取上清液逐级稀释至1.0
×
10-3
，1.0
×
10-4
，1.0
×
10-5
，1.0
×
10-6
，1.0
×
10-7
。
46.(4)每种浓度分别取100ul涂布于3个解磷菌筛选固体培养基上。
47.(5)将平板放于30℃恒温培养箱中培养3～7天。
48.(6)将外观特征不同的单菌落点接种于解磷菌筛选固体培养上。
49.(7)待菌株长出后，通过菌落外观形态观察以及真菌显微形态观察，观察菌株的纯化情况，没有达到纯化要求，则进行多次重复纯化培养，直到获得单一菌株。
50.(8)将纯化的菌株，进行番红染色。
51.(9)对初筛的已纯化的菌株进行培养，解离煤矸石，通过测定煤矸石解离前后有效磷含量变化情况，确认菌株的解磷效果。
52.实施例2：功能菌株的生长曲线的绘制
53.1)制备真菌孢子悬液：用接种针挑取待测真菌菌丝于pda斜面培养基上，30℃活化36～72h，长出大量真菌孢子后取出，在超净工作台用5ml无菌蒸馏水冲洗斜面，制成真菌孢子悬液，稀释至100ml，摇匀备用。
54.2)接种和培养：在250ml锥形瓶中倒入100ml lb液体培养基，一共准备30瓶，放入高压灭菌锅121℃灭菌30min，将准备好的真菌孢子悬液按5％的接种量接入灭过菌的lb液
体培养基中，170r
·
min-1
、30℃摇床培养。于锥形瓶上标记菌号和培养时间。
55.3)测定：每隔24h取出3瓶，空白滤纸105℃烘干至恒重，记录重量，菌液过滤后再次烘干至恒重，记录重量，两次重量差即为菌丝干重，结果单位用mg来表示。
56.用干重法测得gzt-asp01真菌的生长曲线如图1所示：gzt-asp01真菌的对数生长期在4～6天，6天后到达稳定期。
57.实施例3：功能菌株的鉴定
58.本发明中真菌gzt-asp01委托中国典型培养物保藏中心对其进行鉴定。
59.1)菌落外观形态
60.gzt-asp01真菌的初生菌丝为白色，茸毛状，菌落中间突起，呈放射状扩散，5天后菌落中间开始出现烟绿色孢子，9天左右菌丝可以长满整个平板，从平板背面可以看到培养基基质变成黄褐色，如图2所示。
61.2)真菌显微形态
62.用番红染色法对gzt-asp01真菌进行染色，染色后在光学显微镜下观察到真菌的显微形态。用光学显微镜可以观察到gzt-asp01真菌菌丝透明，其分生孢子梗顶端膨大成为顶囊，呈半球形，顶囊表面生成球形分生孢子，分生孢子为透明球状，如图3所示。
63.3)its rrna基因序列：
64.ggggctcgagtgagactctgggtccacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgccgtttcgacggccgccggggaggcctcgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaactctgttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcataatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccggtttcccccggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctctgtaggcccggccggcgccagccgacacccaactttatttctaaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcataaaggccggagga
65.4)18s rrna基因序列：
66.tatctgatgtctagtataagcaatttatacggtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatagtaccttactacatggatacctgtggtaattctagagctaatacatgctaaaaacctcgacttcggaaggggtgtatttattagataaaaaaccaatgcccttcggggctccttggtgaatcataataacttaacgaatcgcatggccttgcgccggcgatggttcattcaaatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagtggcctaccatggtggcaacgggtaacggggaattagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcccgacacggggaggtagtgacaataaatactgatacggggctcttttgggtctcgtaattggaatgagtacaatctaaatcccttaacgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaaccttgggtctggctggccggtccgcctcaccgcgagtactggtccggctggacctttccttctggggaacctcatggccttcactggctgtggggggaaccaggacttttactgtgaaaaaattagagtgttcaaagcaggcctttgctcgaatacattagcatggaataatagaataggacgtgcggttctattttgttggtttctaggaccgccgtaatgattaatagggatagtcgggggcgtcagtattcagctgtcagaggtgaaattcttggatttgctgaagactaactactgcgaaagcattcgccaaggatgttttcattaatcagggaacgaaagttagtggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgccgactagggatcgggcggtgtttctatgatgacccgctcggcaccttacgagaaatcaaagtttttgggttctggggggagtatggt
cgcaaggctgaaacttaaagaaattgacggaagggcaccacaaggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacaaaataaggattgacagattgagagctctttcttgatcttttggatggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctgcttaattgcgataacgaacgagacctcggcccttaaatagcccggtccgcatttgcgggccgctggcttcttagggggactatcggctcaagccgatggaagtgcgcggcaataacaggtctgtgatgcccttagatgttctgggccgcacgcgcgctacactgacagggccagcgagtacatcaccttggccgagaggtctgggtaatcttgttaaaccctgtcgtgctggggatagagcattgcaattattgctcttcaacgaggaatgcctagtaggcacgagtcatcagctcgtgccgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctactaccgattgaatggctcggtgaggccttcggactggctcaggggagttggcaacgactccccagagccggaaagttggtcaaacccggtcattagaggaagtaaagtgttg
67.5)28s rrna基因序列：
68.cctcgggcattgcctcgtacggcgagtgaagcggcaagagctcaaatttgaaagctggccccttcggggtccgcgttgtaatttgcagaggatgcttcgggtgcagcccccgtctaagtgccctggaacgggccgtcatagagggtgagaatcccgtctgggacggggtgtctgcgtccgtgtgaagctccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggtggtaaatttcatctaaagctaaatactggccggagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttgaaaagagagttaaacagcacgtgaaattgttgaaagggaagcgtttgcgaccagactcgctcgcggggttcagccggcattcgtgccggtgtacttccccgtgggcgggccagcgtcggtttgggcggccggtcaaaggccctcggaatgtatcacctctcggggttgtcttatagccgagggtgcaatgcggcctgcccggaccgaggaacgcgcttcggctcggacgctggcgtaatggtcgtaaatgacccgtcttaaacaacccgaaccaa
69.6)菌株的生理生化特性：
70.表1-菌株的碳源氧化
[0071] 检测项目结果 检测项目结果a1水-b7d-半乳糖-a2吐温80+b8d-半乳糖醛酸+a3n-乙酰-半乳糖胺+b9龙胆二糖+a4n-乙酰-葡萄糖胺+b10d-葡萄糖酸+a5n-乙酰-甘露糖胺+b11d-葡萄糖胺+a6核糖醇-b12α-d-葡萄糖+a7苦杏仁甙+c11-磷酸-葡萄糖+a8d-阿拉伯糖-c2葡糖醛酰胺-a9l-阿拉伯糖+c3d-葡萄糖醛酸+a10d-阿拉伯糖醇+c4甘油+a11熊果苷+c5糖原+a12d-纤维二糖+c6m-肌醇+b1α-环糊精+c72-酮基-d-葡萄糖酸+b2β-环糊精+c8α-d-乳糖+b3葡聚糖+c9乳果糖+b4i-赤丝藻醇+c10麦芽糖醇+b5d-果糖+c11麦芽糖+b6l-岩藻糖+c12麦芽三糖+
[0072]
注：表1中，+：阳性反应；-：阴性反应。
[0073]
表2-菌株的碳源利用
[0074][0075]
[0076]
注：表2中，+：阳性反应；-：阴性反应。
[0077]
实施例4：烟曲霉gzt-asp01菌株的培养
[0078]
1)在无菌条件下，将烟曲霉gzt-asp01菌种置于室温下解冻。
[0079]
2)解冻后，在无菌条件下，摇匀，吸取gzt-asp01菌液于pda固体培养基中，涂布涂匀，置于30℃恒温培养箱中培养5-7d。
[0080]
3)将上一步培养得到的菌株，在无菌条件下，用接种环挑取单菌落用划线法接种在lb固体培养基中，置于30℃恒温培养箱中培养5-7d。
[0081]
4)待烟曲霉gzt-asp01长好后，在无菌条件下，用无菌水将培养基中长好的真菌洗脱，得到菌液，菌液浓度范围控制在：1.0
×
10
10-1.5
×
10
10
cfu/ml。
[0082]
实施例5：煤矸石原料准备
[0083]
煤矸石经过粗破、中破、细破、球磨逐级破碎，筛分，取60-100目颗粒待用。
[0084]
实施例6：用烟曲霉gzt-asp01菌株解离煤矸石制备肥料
[0085]
1)所用煤矸石主要成份为：c 10.52％，sio
2 38.71％，al2o
3 16.30％，fe2o
3 16.10％，tio
2 4.30％，cao 4.25％，mgo 2.03％，k2o 1.51％，na2o 0.88％，p2o
5 1.78％，s 1.34％，h 1.10％，n 0.86％，灰分82.21％。
[0086]
2)取已破碎过60目的煤矸石1kg，于控温搅拌器中，gzt-asp01菌液浓度控制在：1.0
×
10
10-1.5
×
10
10
cfu/ml cfu/ml，gzt-asp01菌液与煤矸石的用量比例为1:1(体积:质量)，在连续搅拌下，喷撒菌液，搅拌均匀，每间隔5小时翻动一次，温度控制在30℃，处理煤矸石6-8天。
[0087]
3)处理后的煤矸石经过脱水、晾干，得到粉状产品。
[0088]
4)煤矸石经烟曲霉gzt-asp01处理前后，主要成份对比，见表3：
[0089]
表3
[0090]
项目(mg/kg)原矸石gzt-asp01有效磷7.44192.25速效钾110.39938.33水解氮151.14517.02交换性钙4354.233710.68
[0091]
实施例7：用烟曲霉gzt-asp01菌株解离煤矸石制备肥料
[0092]
1)所用煤矸石主要成份为：c 11.20％，sio
2 37.64％，al2o
3 18.36％，fe2o
3 16.01％，tio
2 2.31％，cao 4.08％，mgo 1.74％，k2o 3.02％，na2o 0.75％，p2o
5 2.54％，s 0.33％，h 0.91％，n 1.08％，灰分81.41％。
[0093]
2)取已破碎过60目的煤矸石1kg，于控温搅拌器中，gzt-asp01菌液浓度控制在：1.0
×
10
10-1.5
×
10
10
cfu/ml，gzt-asp01菌液与煤矸石的用量比例为1:1(体积:质量)，在连续搅拌下，喷撒菌液，搅拌均匀，每间隔4小时翻动一次，温度控制在30℃，处理煤矸石6-8天。
[0094]
4)处理后的煤矸石经过脱水、晾干，得到粉状产品。
[0095]
5)煤矸石经烟曲霉gzt-asp01处理前后，主要成份对比，见表4：
[0096]
表4
[0097]
项目(mg/kg)原矸石gzt-asp01
有效磷5.67202.93速效钾36.56838.45水解氮135.47532.07交换性钙3763.533646.20
[0098]
实施例8：用烟曲霉gzt-asp01菌株解离煤矸石制备肥料
[0099]
煤矸石微生物真菌肥料的制作方法，采用煤矸石成分同实施例(2)，将煤矸石破碎过80目筛，将烟曲霉gzt-asp01配制成浓度为1.0
×
10
10-1.5
×
10
10
cfu/ml的菌液，在连续搅拌下，在粉碎后的煤矸石上按1:1(体积:质量)喷洒烟曲霉gzt-asp01菌液，搅拌均匀，每间隔4-6小时翻动一次，温度控制在30℃，处理煤矸石6-8天，晾干，得到粉状产品，即得煤矸石微生物真菌肥料。
[0100]
实施例9：用烟曲霉gzt-asp01菌株解离煤矸石制备肥料
[0101]
煤矸石微生物真菌肥料的制作方法，采用煤矸石成分同实施例(2)，将煤矸石破碎过100目筛，将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌gzt-asp01配制成浓度为1.0
×
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10-1.5
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10
cfu/ml的菌液，在连续搅拌下，在粉碎后的煤矸石上按1:1(体积:质量)喷洒纺锤形赖氨酸芽孢杆菌gzt-asp01菌液，搅拌均匀，每间隔4-6小时翻动一次，温度控制在30℃，处理煤矸石6-8天，晾干，得到粉状产品，即得煤矸石微生物真菌肥料。
[0102]
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造揭露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。
[0103]
[0104]
[0105]