专利名称：：用腺苷(ar)为原料生产腺苷三磷酸(atp)的新工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生化制药新工艺，特别是一种用腺苷(AR)为原料生产腺苷三磷酸(ATP)的新工艺。在七十年代末八十年代初，我国主要有四家单位生产腺苷三磷酸(ATP)，分别是江门甘蔗化工厂、上海葡萄糖厂、华北制药厂、佳木斯生化制药厂，都是用腺苷一磷酸(AMP)为原料，通过转型酵母或啤酒酵母中的有关酶系生产腺苷三磷酸(ATP)，但是，采用以上工艺技术路线生产ATP，成本很高，达3000～4000元/kg，而进口ATP进主我国市场的价格仅为2200元/kg左右，这样近使我国ATP生产厂这全部停产，我国生产ATP工业基本处于瘫痪状态。针对以上情况，华东化工学院、上海生化所、上海有机研究所等单位，在八十年代后期开始研究用腺苷(AR)为原料生产ATP医药原料的技术工艺，他们首先在江苏省启东县核苷酸厂进行中试，但由于工艺技术原因，产品质量仍达不到卫生部标准，生产成本仍高于进口产品价格，无法正式生产，究其主要原因如下1、发酵转化浓度低发酵浓度低导致(1)提取困难，使提取成本高;(2)发酵设备利用率低、生产固定费用大;(3)劳动生产率低，生产成本增加。2、配方不合理这是因为发酵辅助材料使用过高，增加材料消耗，使成本提高，更令提取困难，产率和产品质量下降。3、发酵工艺不合理主要是PH值没有达到使AR转化为ATP最佳值，从而使产品收得率低，使生产成本高。4、提取工艺不合理主要是上柱提纯工艺中的上柱离子交换树脂吸附率低，一般为5～13gATP/100g树脂，而使收回率和设备利用率低、产品含量低，质量下降。本发明的目的是针对用AR为原料生产ATP的工艺存在如上问题而提出的改进。其反应过程如下采用如下工艺流程AR溶液+清酶液进行ATP发酵→离心分离→酒精沉淀→沉淀物回溶→稀释上柱提纯→除热原→结晶→真空干燥→ATP。1、采用高浓度AR转化法，浓度在2%以上。(1)配方(见表一)实例(2)工艺参数PH6.3～6.7温度32～35℃时间4～6小时转化率90%以上;终点检测DEAE-纤维素薄板层柝跟踪检查。2、调整ATP发酵工艺，使其更适合AR转化为ATP，明显提高了产品的收率，使AR的转化率90%以上。3、采用酒精沉淀脱盐工艺，使树脂的吸附率由原来的5～13gATP/100g树脂，提高到18～22gATP/100g树脂。(1)工艺参数发酵分离清液酒精用量＝1∶4.0～5.0&lt;重量&gt;搅拌速率40～50转/分搅拌时间30～40分钟静止沉淀时间4～8小时保持发酵分离清液的PH值2.0～2.2发酵分离液的ATP含量g/l35～60;4、控制ATP上柱提纯工艺过程中的上柱液、洗涤液、洗脱液的温度在15℃以下，提高ATP上柱提纯的收回率和产品质量。(1)上柱工艺参数上柱量18～22gATP/100g201×7离子交换树脂100～200目;上柱液ATP含量1～2%;上柱液PH值3.2～3.8;上柱液温度15℃以下;上柱流速20～30ml/min.kg树脂;(2)洗涤工艺参数洗涤液成份0.01MNaCl或PH2.0溶液;洗涤流速40～50ml/min.kg树脂;洗涤时间30～40小时;洗涤温度15℃以下。洗涤终点是用DEAE纤维薄板层柝跟踪检查，确认无ATP后3～8小时。(3)洗脱液成份1MNaCl-PH3.8HCl溶液(无热原);洗脱液流速前期10～15ml/min.kg树脂;收集期3～5ml/min.kg树脂。收集方法用酒精沉淀检查较浓，ATP含量在70g/l以上。通过以上改进，使ATP成本由原来的3000～4000元/kg下降至1500元/kg，产品含量超过卫生部标准11%以上，产生了显著的经济效益和社会效益。下面详细描述本发明1、用AR生产ATP的反应过程如下其酶提取工艺流程如下分离→消酶液制取ATP的工艺如下AR溶液+清酶液进行ATP发酵→离心分离→酒精沉淀→沉淀物回溶→稀释上柱提纯→除热原→结晶→真空干燥→ATP。制取ATP的最佳工艺如下AR溶液+清酶液进行ATP发酵→终止反应→离心分离→清液→酒精沉淀→沉淀物→回溶→冷冻脱盐→硅藻土处理→过滤(压滤)→清液→稀释上柱提纯→洗涤→洗脱→脱色树脂脱色→硅藻土处理→活性炭除热原处理→过滤(G5漏斗)→结晶→结晶物→无水乙醇洗涤→无水乙醚洗涤→真空干燥→ATP。2、工艺技术条件(1)啤酒酵母泥或啤酒压榨酵母啤酒酵母泥是啤酒生产过程中所收集的具有较高活性的酵母，啤酒酵母泥中酵母含量(重量百分比)为16-18%，压榨酵母干物质中酵母含量(重量百分比)23-26%。(2)啤酒酵母的冷冻工艺条件1)冷冻温度-15℃-25℃2)冷冻时间7天-15天3)速冻结冰时间8小时以内(3)发酵提酶工艺条件1)配方物料名称规格数量备注啤酒酵母泥16-18%20～50kg加入前可用1%-2%新洁尔灭处理30分钟磷酸85%(工业)2～5kgKOH和磷酸中和后用NaOH调PH6.6-6.7KOHCP1～3kg定溶15lMgCl2CP0.1～2kg配成25%加入蔗糖食用3～6kg总容量50-60l2)控制PH值6.3-6.73)温度32-35℃4)时间2-2.5小时5)酵母残体分离离心分离(4)AR转化为ATP的工艺条件1)配方物料名称规格数量备注AR90%1.0-3.0kg配水成20%转化酶液上述分离液30-45l蔗糖食用0.5-1.0kg磷酸工业0.2-0.5kg配好后再加入配好的酶液中。2)工艺条件PH6.3-6.7温度32-35℃时间4-7小时转化率%90%以上终点检测DEAE-纤维素薄板层析跟踪检查ATP转化率90%以上。(5)终止反应终止反应剂工业盐酸终止PH值PH1.9-2.0(6)离心分离除蛋白试产过滤介质尼龙布分离机33-800三足式离心机中试管式离心机离心分离清液标准不浑浊，无悬浮物。(7)酒精沉淀ATP清液PH值1.9-2.1酒精用量4.5-5.0倍搅拌转速40-50转/分搅拌时间30-60分钟静止沉淀时间4-8小时发酵分离清液ATP含量g/l45-70g/l(8)ATP沉淀物回溶溶剂蒸馏水ATP浓度200g/l-220g/l(9)冷冻脱盐温度-5--15℃脱盐标准结冰有盐析出后抽滤除去盐类。(10)硅藻土处理ATP浓度5%硅藻土用量1%温度25℃以下时间搅拌30分钟(11)压滤或抽滤压滤用无菌过滤机介质用滤纸抽滤用真空抽滤器(12)上柱提纯树脂型号201×8(201×7)100-200目的强碱型阴离子交换树脂。树脂用量18-20gATP/100g树脂上柱液浓度ATP含量10g/l上柱液PH2.8～3.5;上柱温度20℃以下;上柱流速20～30ml/min.kg树脂;上柱终点DEAE-纤维素薄板层析检查有ATP斑点洗涤剂0.01MNaCl-0.01HCl溶液(无热原)PH2.0洗涤温度18℃以下。洗涤流速40～50ml/min.kg树脂;洗涤终点DEAE-纤维素薄板层析检查无ADP后3-8小时洗脱剂1MNaCl-PH3.8HCl溶液(无热原);洗脱流速前期10～15ml/min.kg树脂(时间30-40分钟)收集期3～5ml/min.kg树脂收集方法用酒精沉淀检查较浓ATP含量在70g/l以上收集终点ATP含量在10g/l以下(13)精制脱色处理用洗脱液流过脱色树脂脱色流速50-100ml/min.kg树脂透光率99%以上硅藻土处理硅藻土用量脱色液的1%处理时间搅拌30-40分钟抽滤真空度-0.1MPa活性炭除热源药用粉末活性炭用量第一次0.3%，第二次0.15%抽滤真空度-0.1MPa阳离子除重金属用阳离子调PH2.5后抽滤。G5漏斗过滤抽滤真空度-0.1MPa注以上精制全过程应防止热源污染。(14)ATP结晶ATP清液PH值2.5酒精用量2.5倍温度25℃以下时间10-16小时(15)无水乙醇洗涤结晶物无水乙醇用量0.5倍沉淀物真空抽滤无水流下(16)无水乙醚洗涤无水乙醚用量0.5倍沉淀物真空抽滤无水流下，结晶物无粘稠感，疏松分散良好。(17)P2O5真空干燥真空度-0.1MPa温度45℃以下成品水份含量7%以下二、试产结果1、主要经济技术指标结果(见下列表)表-2试产ATP试验结果表-3ATP试验产品质量结果表-4ATP试产结果生产成本续表-4权利要求1.一种用腺苷(AR)为原料生产腺苷三磷酸(ATP)的新工艺，其工艺流程如下AR溶液+清酶液进行ATP发酵→离心分离→酒精沉淀→沉淀物回溶→稀释上柱提纯→除热原→结晶→真空干燥→ATP。2.根据权利要求1所述的一种用腺苷(AR)为原料生产腺苷三磷酸(ATP)的新工艺，其工艺流程最好如下AR溶液+清酶液进行ATP发酵→终止反应→离心分离→清液→酒精沉淀→沉淀物→回溶→冷冻脱盐→硅藻土处理→过滤(压滤)→清液→稀释上柱提纯→洗涤→洗脱→脱色树脂脱色→硅藻土处理→活性炭除热原处理→过滤(G5漏斗)→结晶→结晶物→无水乙醇洗涤→无水乙醚洗涤→真空干燥→ATP。3.根据权利要求1所述的一种用腺苷(AR)为原料生产腺苷三磷酸(ATP)的新工艺，其清酶液的制取工艺如下4.根据权利要求1所述的一种用腺苷(AR)为原料生产腺苷三磷酸(ATP)的新工艺，其特征在于采用沉淀脱盐工艺，使树脂的吸附率提高到18～22gATP/100g树脂，其工艺参数如下发酵后的分离清液酒精用量＝1∶4.0～5.0&lt;重量&gt;搅拌速度40～50转/分搅拌时间30～40分钟静止沉淀时间4～8小时保持发酵后的分离清液的PH值为2.0～2.2发酵分离液的ATP含量为35～60g/l5.根据权利要求1所述的一种用腺苷(AR)为原料生产腺苷三磷酸(ATP)的新工艺，其特征在于控制ATP上柱提纯工艺过程中的上柱液、洗涤液、洗脱液的温度在15℃以下，以便提高ATP上柱提纯的收回率和产品质量，其(1)上柱工艺参数为上柱量18～22gATP/100g201×7离子交换树脂100～200目;上柱液ATP含量1～2%;上柱液PH值3.2～3.8;上柱液温度15℃以下;上柱流速20～30ml/min.kg树脂;(2)洗涤工艺参数为洗涤液成份0.01MNaCl-PH2.0HCl溶液;洗涤流速40～50ml/min.kg树脂;洗涤时间30～40小时;洗涤温度15℃以下。洗涤终点是用DEAE纤维薄板层柝跟踪检查，确认无ATP后3～8小时。(3)洗脱工艺参数洗脱液成份1MNaCl-PH3.8HCl溶液(无热原);洗脱液流速前期10～15ml/min.kg树脂;收集期3～5ml/min.kg树脂。6.一种用腺苷(AR)为原料生产腺苷三磷酸(ATP)的新工艺，腺苷(AR)用水配成20%(重量比)的溶液后加入清酶液中，使腺苷(AR)在整个溶液中的含量大于2%(重量比)。7.根据权利要求6所述的一种用腺苷(AR)为原料生产腺苷三磷酸(ATP)的新工艺，腺苷在整个溶液中的含量最好按下表配方料名称规格数量备注腺苷(AR)90％以上1.5～2.5kg用水配成20％溶液转化清酶液38～451</table></tables>8.根据权利要求6所述的一种用腺苷(AR)为原料生产腺苷三磷酸(ATP)的新工艺，腺苷(AR)在清酶液中发酵时的工艺参数是PH值6.3～6.7温度32～35℃时间4～6小时终点检测DEAE-纤维素薄板层柝跟踪检查ATP转化率90%以上。全文摘要一种用腺苷(AR)为原料生产腺苷三磷酸(ATP)的新工艺，通过采用以AR为底物的高浓度(2％以上)转化法，采用酒精沉淀脱盐工艺使树脂的吸附率由原来的5～13gATP/100g树脂提高到18～22gATP/100g树脂和控制ATP上柱提纯工艺过程中的上柱液、洗涤液、洗脱液的成分及15℃以下的温度等而达到使成本降低到1500元/kg，产品含量超过部颁标准11％以上。文档编号C07H19/16GK1108660SQ95100148公开日1995年9月20日申请日期1995年1月17日优先权日1995年1月17日发明者黎立奇申请人:广东省新会县荷塘镇康溪生物化学制品厂,黎立奇