1.本发明属于提取物制备技术领域，具体涉及一种高纯度岩藻聚糖硫酸酯的制备方法及其应用。


背景技术：

2.岩藻聚糖硫酸酯也称作褐藻糖胶是褐藻多糖的一种，褐藻中的多糖主要包括三种：海藻酸盐、岩藻聚糖硫酸酯和淀粉，其中海藻酸盐和岩藻聚糖硫酸酯的含量相对较高，褐藻淀粉含量较少。岩藻聚糖硫酸酯存在于细胞壁上和细胞间质中，海藻酸盐主要处在细胞内,淀粉存在于细胞间质中。
3.近年来，岩藻聚糖硫酸酯因具有多种良好的生物活性，受到人们的广泛关注。
4.岩藻聚糖硫酸酯具有保湿、修护、降血糖、降血脂、抗氧化、抗凝血、保肝护肝、免疫调节、抗肿瘤等多种功效。
5.岩藻聚糖硫酸酯的常用提取方法有水提法、酸提法、碱提法、酶法和超声波提取法，这些方法各有利弊：水提法可避免岩藻聚糖硫酸酯降解，是常用的提取方法，缺点主要有两个方面，其一无法有效提取细胞壁上的岩藻聚糖硫酸酯，因此得率低；其二，提取温度超过60℃，高温会使淀粉糊化，为固液分离带来困难。酸提法和超声提取可以提高岩藻聚糖硫酸酯的得率，但会使岩藻聚糖硫酸酯降解，影响其生物活性；酶法条件温和，对岩藻聚糖硫酸酯结构影响不大，也可提高得率，但酶法破坏了褐藻的细胞壁，会引入细胞内的海藻酸钠和淀粉，为后端岩藻糖硫酸酯的纯化提高了难度，成本较高。而碱提法进行提取时会提取更多的海藻酸钠、色素、多酚和脂肪，且提取物的颜色深、杂质多，导致得到的岩藻聚糖硫酸酯纯度低(不足60％)，且导电率高。
6.常用的岩藻聚糖硫酸酯的纯化方法有氯化钙沉淀法、膜过滤、醇沉法，这些方法各有利弊：氯化钙沉淀法可有效的剔除海藻酸盐，弊端是添加量较大，一般为褐藻重量的 15-20％,导致产品的电导率高，需增加脱盐成本；膜过滤法，可以根据分子量有效分离多糖，缺点主要有两个方面，其一，前期投入大，其二，对粘度大的多糖分离速度慢；醇沉法，可有效的除杂脱色，其缺点主要有两个方面：其一对多糖的沉淀没有选择性，不能有效分离海藻酸盐和岩藻聚糖硫酸酯；其二需要防爆车间。
7.综上，现有技术路线主要包括以下三种：
8.(1)水提法：干海藻
→
去泥沙、烘干
→
海藻粉
→
热水浸提
→
离心
→
取上清液
→
调ph至中性
→
减压浓缩
→
乙醇沉淀
→
无水乙醚、丙酮洗涤两次
→
真空干燥
→
海藻多糖粗品。
9.(2)酸提法：干海藻
→
水漂去杂、风干
→
粉碎
→
用0.1mol/l hcl和甲醛溶液浸提
→
过滤得滤液
→
滤液加0.5mo/l的naoh中和
→
离心将上清液浓缩
→
加乙醇至60％
→
静置
→
离心沉淀
→
用乙醇洗涤沉淀物
→
减压干燥得海藻多糖粗品。
10.(3)超声波萃取法：干海藻粉
→
加入蒸馏水适量(用超声波器处理)
→
提取液过滤
→
浓缩
→
乙醇沉淀
→
静置
→
离心沉淀
→
用乙醇洗涤沉淀物
→
减压干燥得海藻多糖粗品。
11.上述三种方法的操作步骤繁琐，成本高、不利于工业化大规模的生产。因此，本领
域亟需研发一种操作简单、成本低且提取率高、适合规模化生产岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，并获得高纯度和低导电率的岩藻聚糖硫酸酯。


技术实现要素：

12.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法及其应用。将褐藻洗净粉碎后用氢氧化钙水溶液提取，提取液通入二氧化碳沉淀过量的氢氧化钙，最后用阳离子交换树脂除杂，为一种操作简单、成本低、提取率高、适合规模化生产的提取分离方法。
13.本发明将褐藻用水洗去无机盐和杂质，风干、粉碎得褐藻粉末。以氢氧化钙水溶液为溶媒低温雾化提取。提取液通入二氧化碳除去过量的氢氧化钙，离子交换树脂脱盐，即可得到岩藻聚糖硫酸酯。
14.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
15.第一方面，本发明提供了一种提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法，包括以下步骤：
16.s1、将褐藻清洗干净后，烘干然后粉碎成褐藻粉末；
17.s2、将褐藻粉末在氢氧化钙水溶液中进行低温雾化提取，过滤得提取液；
18.s3、向提取液中通入二氧化碳沉淀过量的氢氧化钙，然后过滤得滤液；
19.s4、向滤液中加入阳离子交换树脂，搅拌1-2小时后过滤，喷雾干燥，即得高纯度岩藻聚糖硫酸酯。
20.优选地，步骤s1中，所述烘干温度为40-50℃，褐藻粉末粒径为10-40目。
21.优选地，步骤s1中，所述褐藻包括黑角藻(fucus vesiculosus)、大叶海藻(sargassumpallidum)、羊栖菜(hizikia fusiforme)、裙带菜(undaria pinnatifida)及海带(laminariajaponica)中的至少一种。
22.优选地，步骤s2中，所述低温雾化提取的温度为40-50℃，提取时间为0.5-1小时。
23.优选地，步骤s2中，所述褐藻粉末与水的重量比为1:8-1:15，氢氧化钙加入量为褐藻粉末重量的2.5-4.5％。
24.本发明在提取过程中使用的氢氧化钙，一方面具有很好的除杂作用(主要作用)：可与海藻酸盐反应形成不溶于水的海藻酸钙、使蛋白变性析出、络合淀粉、沉淀游离态的硫酸根；另一方面可软化细胞壁，游离出细胞壁上的岩藻聚糖硫酸酯，提高岩藻聚糖硫酸酯的得率。在发明人前期的实验中发现，若采用其他氢氧化物时，无法达到本发明的效果，岩藻聚糖硫酸酯的纯度和得率均会下降，电导率也会升高。
25.优选地，步骤s3中，所述通入二氧化碳沉淀过量氢氧化钙时，控制提取液的ph为 7.5-8.0。
26.本发明向提取液中通入二氧化碳沉淀多余的氢氧化钙，并且减少了溶液中原有的钙离子、镁离子等的浓度，消除了內源和外源阳离子对电导率的影响；电导率过高的成分会降低配方中增稠剂的粘度，为配方应用带来困难。
27.优选地，步骤s4中，所述阳离子交换树脂选自强酸性阳离子交换树脂和弱酸性阳离子交换树脂中的一种或者两种；阳离子交换树脂的添加量为滤液重量的2-5％。
28.本发明在纯化过程中使用阳离子交换树脂，不但能吸附溶液中残留的阳离子，还可以让溶液的ph降至2-3，此ph为褐藻蛋白和海藻酸的等电点，可进一步除去残留的蛋白和
海藻酸。
29.优选地，步骤s4中，所得岩藻聚糖硫酸酯的纯度为80-85％，所得的岩藻聚糖硫酸酯配制成质量分数为1％的水溶液的电导率为1.2-1.8ms/cm。
30.第二方面，本发明提供了一种根据前述方法提取的高纯度岩藻聚糖硫酸酯在制备具有保湿功效的化妆品中的应用，所述高纯度岩藻聚糖硫酸酯的添加量为0.05-0.5wt％。
31.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
32.1)本发明在提取过程中采用低温雾化提取的方法，水用量少，周期短；低温提取的方法，避免了淀粉糊化，方便后处理，提高产品在溶液中的稳定性；氢氧化钙水溶液作为提取溶媒，沉淀海藻酸盐等杂质和提取岩藻聚糖硫酸酯同步进行，减少了工艺流程，有利于规模化生产。
33.2)本发明工艺简单，绿色环保，提取率高，制备的岩藻聚糖硫酸酯具有优异的保湿功效。
34.3)本发明制备的岩藻聚糖硫酸酯的纯度可达80％以上，且其配制成质量分数为1％的水溶液的电导率仅为1.2-1.8ms/cm，相比现有方法，显著提高了岩藻聚糖硫酸酯的纯度、且降低了岩藻聚糖硫酸酯的电导率。
附图说明
35.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
36.图1为验证实施例1中不同浓度的sea-gel涂抹后1.5h的皮肤含水量即时测试结果；
37.图2为验证实施例1中不同实验组涂抹后不同时间的皮肤含水量即时测试结果；
38.图3为验证实施例1中不同实验组涂抹后不同时间的tewl即时测试结果；
39.图4为验证实施例1中不同实验组涂抹后不同时间的皮肤含水量长效测试结果；
40.图5为验证实施例1中不同实验组涂抹后不同时间的tewl长效测试结果；
41.图6为验证实施例2中不同实验组涂抹后24h的皮肤含水量即时测试结果；
42.图7为验证实施例2中不同实验组涂抹后24h的tewl即时测试结果。
具体实施方式
43.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
44.以下实施例中，制备的岩藻糖硫酸酯的纯度计算方法为：取适量固形物(重量记为 m)，用水配成浓度约5％的溶液。向溶液中缓慢滴加氯化钡溶液直至无沉淀产生。离心，收集沉淀，干燥，准确称重，得重量m1。按《中国药典》2020版通则0841的方法测试沉淀物的炽灼残渣，得炽灼残渣的重量m2。岩藻聚糖硫酸酯的纯度(％)＝100*(m1-m2)/m。
45.实施例1
46.本实施例提供了一种提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法，具体步骤如下：
47.s1：墨角藻5kg用纯净水洗去表面的无机盐及其他杂质，45℃烘干后粉碎为40 目的墨角藻粉末；
48.s2：向50kg水中加入0.2kg氢氧化钙，搅拌混合均匀形成氢氧化钙水溶液，后以氢氧化钙水溶液为溶媒，45℃雾化提取墨角藻粉末，雾化提取时间为1h，然后过滤，得提取液；
49.s3.向提取液中通入二氧化碳调节至ph 7.81，沉淀过量的氢氧化钙，过滤，得滤液37.2kg；
50.s4.向步骤s3获得的滤液中加入1.86kg阳离子交换树脂(d001树脂)脱盐，室温搅拌1小时，过滤，喷雾干燥，得固形物0.085kg，岩藻聚糖硫酸酯纯度为83.5％，得率为1.42％。采用该方法得到的岩藻聚糖硫酸酯配制成质量分数为1％的水溶液放置一周澄清透明，且测得该水溶液的电导率为1.6ms/cm。
51.实施例2
52.本实施例提供了一种提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法，具体步骤如下：
53.s1：墨角藻5kg用纯净水洗去表面的无机盐及其他杂质，40℃烘干后粉碎为10 目的墨角藻粉末；
54.s2：向40kg水中加入0.125kg氢氧化钙，搅拌混合均匀形成氢氧化钙水溶液，后以氢氧化钙水溶液为溶媒，50℃雾化提取墨角藻粉末，雾化提取时间为0.5h，然后过滤，得提取液；
55.s3.向提取液中通入二氧化碳调节至ph 7.50，沉淀过量的氢氧化钙，过滤，得滤液25.5kg；
56.s4.向步骤s3获得的滤液中加入0.51kg阳离子交换树脂(d001树脂)脱盐，室温搅拌1小时，过滤，喷雾干燥，得固形物0.086kg，岩藻聚糖硫酸酯纯度为81.60％，得率为1.40％。采用该方法得到的岩藻聚糖硫酸酯配制成质量分数为1％的水溶液放置一周澄清透明，且测得该水溶液的电导率为1.78ms/cm。
57.实施例3
58.本实施例提供了一种提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法，具体步骤如下：
59.s1：墨角藻5kg用纯净水洗去表面的无机盐及其他杂质，50℃烘干后粉碎为10 目的墨角藻粉末；
60.s2：向75kg水中加入0.225kg氢氧化钙，搅拌混合均匀形成氢氧化钙水溶液，后以氢氧化钙水溶液为溶媒，45℃雾化提取墨角藻粉末，雾化提取时间为1h，然后过滤，得提取液；
61.s3.向提取液中通入二氧化碳调节至ph 7.99，沉淀过量的氢氧化钙，过滤，得滤液58.5kg；
62.s4.向步骤s3获得的滤液中加入2.925kg阳离子交换树脂(d001树脂)脱盐，室温搅拌1小时，过滤，喷雾干燥，得固形物0.09kg，岩藻聚糖硫酸酯纯度为84.7％，得率为1.52％。采用该方法得到的岩藻聚糖硫酸酯配制成质量分数为1％的水溶液放置一周澄清透明，且测得该水溶液的电导率为1.30ms/cm。
63.实施例4
64.本实施例提供了一种提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法，具体步骤如下：
65.s1：海带5kg用纯净水洗去表面的无机盐及其他杂质，45℃烘干后粉碎为40目的海
带粉末；
66.s2：向50kg水中加入0.15kg氢氧化钙，搅拌混合均匀形成氢氧化钙水溶液，后以氢氧化钙水溶液为溶媒，45℃雾化提取1h，然后过滤，得提取液；
67.s3.向提取液中通入二氧化碳调节至ph 7.75，沉淀过量的氢氧化钙，过滤，得滤液35.2kg；
68.s4.向步骤s3获得的滤液中加入1.0kg阳离子交换树脂(d001树脂)脱盐，室温搅拌1小时，过滤，喷雾干燥，得固形物0.053kg，岩藻聚糖硫酸酯纯度为82.5％，得率为0.87％。采用该方法得到的岩藻聚糖硫酸酯配制成质量分数为1％的水溶液放置一周澄清透明，且测得该水溶液的电导率为1.40ms/cm。
69.对比例1
70.本对比例提供了一种提取岩藻聚糖硫酸酯的方法，具体步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于：步骤s2中，没有采用低温雾化法，而是直接在氢氧化钙水溶液中加入墨角藻粉末，在85-90℃下搅拌1小时后过滤得提取液。
71.最后得到固形物0.047kg，岩藻聚糖硫酸酯纯度为72.5％，得率0.68％。采用该方法得到的岩藻聚糖硫酸酯配制成质量分数为1％的水溶液室温放置1周有轻微乳光，且测得该水溶液的电导率为1.65ms/cm。
72.对比例2
73.本对比例提供了一种提取岩藻聚糖硫酸酯的方法，具体步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于：步骤s3为：加入5％的碳酸钠水溶液沉淀氢氧化钙，直至溶液中无沉淀产生，过滤得滤液。
74.最后得到固形物0.089kg，岩藻聚糖硫酸酯纯度为77.8％，得率1.38％。采用该方法得到的岩藻聚糖硫酸酯配制成质量分数为1％的水溶液放置一周澄清透明，且测得该水溶液的电导率为13.7ms/cm。
75.对比例3
76.本对比例提供了一种提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法，具体步骤与实施例3基本相同，不同之处仅在于：本对比例的步骤s2中，加入的氢氧化钙量为0.3kg。
77.最终得固形物0.0865kg，岩藻聚糖硫酸酯纯度为：81.4％，得率1.41％。采用该方法得到的岩藻聚糖硫酸酯配制成质量分数为1％的水溶液放置一周澄清透明，且测得该水溶液的电导率为3.70ms/cm。
78.对比例4
79.本对比例提供了一种提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法，具体步骤与实施例2基本相同，不同之处仅在于：本对比例的步骤s2中，加入的氢氧化钙量为0.1kg。
80.最终得固形物0.892kg，岩藻聚糖硫酸酯纯度为73.5％，得率1.31％。采用该方法得到的岩藻聚糖硫酸酯配制成质量分数为1％的水溶液放置一周澄清透明，且测得该水溶液的电导率为2.5ms/cm。
81.对比例5
82.本对比例提供了一种提取高纯度岩藻聚糖硫酸酯的方法，具体步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于：本对比例的步骤s2中，采用氢氧化钠代替氢氧化钙。
83.最终得固形物0.13kg，岩藻聚糖硫酸酯纯度为53.2％，得率1.38％。采用该方法得
到的岩藻聚糖硫酸酯配制成质量分数1％的水溶液，且测得该水溶液的电导率为15.7 ms/cm。
84.验证实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯的保湿功效验证
85.实验方法：
86.1.受试者选择：年龄20～50岁的健康受试者11～14人，男女不限。
87.2.样品：0.2％透明质酸ha和0.05％、0.25％、0.5％岩藻聚糖硫酸酯(以下简称为 sea-gel)水溶液(由实施例1制备的固形物与水按质量百分含量配制而成)。
88.3.即时测试方法：左右手前臂内侧标记3
×
3cm2试验区域，同一手臂同时标记3 个区域，区域间隔1cm。测试样品和空白对照均随机分布在左、右手臂上。先测量各测试区域清洁后30min的空白值，用仪器检测每个试验部位，分别重复3次，得出其平均值，此为基础值。然后按2.0
±
0.1mg样品/cm2的用量，将试样均匀涂布于试验区内。涂抹后分别测量1.5h、3h、6h、24h受试区域和空白对照区域的皮肤含水量、tewl，对测试区域和对照区各检测3次，得出平均值。
89.皮肤含水量和经表皮失水率(tewl)是通过人体临床实验评价样品是否具有保湿功效的两大指标。同时tewl也是反映角质层屏障功能的常用指标，对于皮肤屏障功能已经受损的人群，tewl检测值会增大。
90.4.长效测试方法：基础值检测步骤同即时测试方法相同。每天早晚2次涂抹不同样品，涂抹后第7天、14天及不涂抹后3天分别测量受试区域和空白对照区域的皮肤水分含量、tewl，对测试区域和对照区各检测3次，得出平均值。
91.5.主要仪器/试剂如下表1所示。
92.表1
93.仪器/试剂名称品牌型号/货号备注多功能皮肤测试仪ckmpa6自校准cm825探头ck-自校准tm300探头ck-自校准
94.6.分析方法：
95.所有检测数据先除以其基础值，再除以空白对照，使空白对照为100％，计算各个样品对于皮肤含水量及tewl的效果，其变化率分别记为mmv％、tewl％。用ttest的方法计算样品与空白对照相比的显著性差异，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。计算公式如下：
96.检测变化值％＝使用后检测值/使用前检测值
×
100％
97.变化率％＝检测变化值
样品组
/检测变化值
空白组
×
100％
98.7.即时测试结果：
99.首先测试了sea-gel 0.05％、0.25％和0.5％浓度下涂抹1.5h后对皮肤含水量的影响，结果如图1所示。由图1可知，与对照组(water)相比，0.05％、0.25％、0.5％的 sea-gel在1.5h后对皮肤含水量的提升率分别为5.2％、12.2％、14.4％。
100.继续测试0.5％sea-gel涂抹不同时间后对皮肤含水量、tewl的影响，结果如图2和图3所示。由图2可知，与空白对照组(nt组)相比，在处理1.5～24h时，0.5％sea-gel 可显著提升皮肤含水量，在1.5h、3h、6h的提升率分别达到19％、11％、12％，在24h 仍然能提升10％，强于0.2％的ha样品。对tewl，由图3可知，sea-gel使用3h、24h后相比nt组可下降
2.1％和5.3％，而ha处理组使用3h后相比nt组上升了约4％。
101.8.长效测试结果：
102.最后测试了每天持续使用0.5％的sea-gel后皮肤含水量、tewl的变化，结果如图4 和图5所示。由图4和图5可知，与空白对照组(nt组)相比，连续使用7天后，sea-gel 对皮肤含水量和tewl均有显著的改善效果，使用7天、14天，皮肤含水量分别上升了 24％、34％，tewl分别降低了14％、19％。且与ha组相比，sea-gel对含水量的提升效果更强(p《0.01)。在最后一次使用后48h(图4中的+48h结果)，相比于nt组，sea-gel 仍然能提升皮肤含水量至132％，而ha组仅为108％。
103.综上，0.05％～0.5％的sea-gel在一次使用后1.5h可提升皮肤含水量，最大提升率达到19％。
104.0.5％的sea-gel在一次使用后1.5～24h，每天2次使用后7～14天均能显著提升皮肤含水量，最大提升率达到34％。在持续使用7～14天，还可显著下降tewl，最大减少率达到19％。
105.因此，本发明实施例制得的岩藻聚糖硫酸酯可增加皮肤含水量、减少皮肤水分散失，维持皮肤的正常功能，具有保湿、修护功效。
106.验证实施例2、对比例1和对比例2制备的岩藻聚糖硫酸酯的保湿功效验证
107.按照验证实施例1中相同的方法，评价对比例1与对比例2得到的岩藻聚糖硫酸酯的保湿功效。
108.将对比例1和对比例2得到的岩藻聚糖硫酸酯(即固形物)均配成0.5％浓度的水溶液(分别对应对比例1处理组、对比例2处理组)，考察它们在一次使用后24h，皮肤含水量的变化。结果如下：
109.由图6可知，与验证实施例2中相同条件处理的空白对照组(nt组)、ha处理组、 0.5％的sea-gel处理组相比，在使用后24h时，0.5％的sea-gel处理组可显著提升皮肤含水量，提升率达到10％。而对比例1处理组效果不明显，对比例2处理组甚至下降了13％。对tewl，由图7可知，0.5％的sea-gel处理组使用后24h相比nt组可下降5.3％，而对比例1处理组和对比例2处理组均分别上升了约1％和5％。
110.需要说明的是，采用本发明实施例2-5的方法获得的岩藻聚糖硫酸酯也同样具有与实施例1方法获得的岩藻聚糖硫酸酯相当的保湿功效。
111.本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。