1.本发明涉及酶技术领域。特别是，本文公开了在不同化学环境中具有良好甘露聚糖降解性能和稳定性的甘露聚糖酶变体，使其可用于需要降解甘露聚糖的各种应用，例如在洗衣和清洁应用中，在饲料和食品技术中，以及在制浆工业、造纸工业和石油工业中。


背景技术：

2.甘露聚糖是在各种植物中发现的含有甘露糖的多糖。甘露聚糖在水性环境中溶解性差，并且其物理化学性质引起粘性分散。此外，甘露聚糖具有高的水结合能力。甘露聚糖的这些特性中的每一者在加工含甘露聚糖材料的行业中(例如在酿造、烘焙、动物营养以及洗衣和清洁应用中)引起问题。
3.在基于植物的膳食中，存在不同的β-甘露聚糖，并且根据它们的量和性质，它们可能会损害营养物消化、微生物定植和生长。甘露聚糖的酶促降解可用于降低食糜粘度。甘露聚糖酶对甘露聚糖的降解导致产生甘露寡糖。在饲料中使用甘露聚糖酶提高了单胃动物的平均日增重、饲料效率、体重均匀度和存活率。对于动物饲料应用，例如在用于含谷物膳食的单胃动物的饲料中，甘露聚糖是肠道内容物粘度的一个促进因素，并且其由此对饲料可消化性和动物生长速度产生不利影响。对于反刍动物，甘露聚糖是纤维摄入的重要组成部分，并且甘露聚糖的更完全消化会促进更高的饲料转化效率。
4.对于洗衣和清洁应用，包含甘露聚糖酶的酶组合物可用于降解甘露聚糖，例如在甘露聚糖污渍中。然而，提供在不同储存和使用条件下稳定且同时仍显示良好甘露聚糖降解活性的甘露聚糖酶是困难的。因此，在工业应用中使用野生型甘露聚糖酶并不总是可行的。
5.本发明的一个目的是提供表现出甘露聚糖酶活性并且具有允许它们在工业过程中使用的性能和/或稳定性的甘露聚糖酶变体。另一个目的是提供可用于酶组合物中以降解或改性甘露聚糖的变体。


技术实现要素：

6.本技术涉及在独立权利要求中限定的发明及其在下面公开的实施方案。本发明基于通过蛋白质工程修饰亲本甘露聚糖酶来开发甘露聚糖酶变体。本发明人已惊奇地发现，并在以下实施例中表明，通过取代本发明的亲本甘露聚糖酶的第256位氨基酸，可以获得一种变体，该变体在甘露聚糖降解中的性能得到改善(即提高)。特别是当用于洗涤剂中以洗涤含有甘露聚糖的污渍时，性能得到改善。此外，可以通过在选定位置进行额外取代来提高变体的稳定性。即使在非常低的剂量下，新型变体在宽泛范围的洗涤剂中也具有良好的性能。
7.根据第一方面，本发明提供了一种甘露聚糖酶的变体，其中所述变体：
8.与seq id no:1具有至少90％但小于100％的序列同一性，
9.在位置256中，优选在位置s256中具有氨基酸取代，并且
10.具有甘露聚糖酶活性。
11.本发明的变体的优势在于具有良好的降解甘露聚糖的性能。如下文提供的实施例所示，所要求保护的变体的性能与对其进行取代的天然的(即野生型)甘露聚糖酶相比有所提高。因此，所要求保护的取代位置可以单独使用，或与额外的取代位置一起使用，以提高“亲本”甘露聚糖酶的性能。
12.根据第二方面，本发明提供了一种酶组合物，其包含第一方面的变体，以及：
13.a.至少一种稳定剂，所述稳定剂选自多元醇、丙二醇、聚乙二醇、己二醇、甘油、糖、糖醇、多糖、乳酸、肽、表面活性剂或其组合；或至少一种防腐剂或缓冲剂，所述防腐剂或缓冲剂选自有机酸、柠檬酸、抗坏血酸、苯甲酸及其盐和衍生物、苯甲酸钠、苯甲酸盐、羟基苯甲酸酯及其衍生物、磷酸盐、山梨酸、山梨酸钠、山梨酸盐、盐、氯化钠或氯化钾、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(bit)或其组合；
14.b.任选地至少一种抑制剂，所述抑制剂选自硼酸、硼酸衍生物、芳族硼酸酯、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸衍生物、具有抑制功能的肽化合物或其组合；
15.c.任选地至少一种酶，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、核酸酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和具有或不具有介体的氧化酶或其组合；和
16.d.任选地至少一种填充剂，所述填充剂选自麦芽糖糊精、面粉、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
17.根据一个方面，本发明提供了一种酶组合物，其包含第一方面的变体和至少一种稳定剂。
18.根据另一方面，本发明提供了一种酶组合物，其包含第一方面的变体和至少一种防腐剂，或者包含第一方面的变体和至少一种缓冲剂。
19.本发明的变体适用于各种组合物。由于所述变体的良好稳定性，即使没有蛋白酶抑制剂，例如含硼抑制剂，它也可以在蛋白酶存在下使用。
20.组分a-e为本发明的酶组合物提供改进的特性。所述酶组合物与组分a-e相容并提高所述酶组合物在各种用途中的适用性。盐，例如氯化钠和硫酸钠，起到干燥助剂的作用。
21.根据第三方面，本发明提供了一种洗涤剂组合物，其包含本发明的变体或本发明的酶组合物。
22.在洗涤剂组合物中使用本发明的变体的一个优点是它表现良好并且长时间保持稳定。有利地发现，含有本发明的变体的组合物可以储存很长时间，并且即使没有硼或含硼化合物，在蛋白酶的存在下也能保持甘露聚糖降解活性。因此，本发明的甘露聚糖酶对蛋白酶具有良好的稳定性。
23.根据第四方面，本发明提供了一种重组宿主细胞，其包含允许产生至少一种包含第一方面的变体的重组多肽的遗传元件。
24.根据第五方面，本发明提供了一种产生第一方面的变体的方法，其包括培养第四方面的重组宿主细胞，其中：
25.所述遗传元件包含至少一种控制所述重组宿主细胞中的重组多肽产生的控制序列；
26.所述遗传元件任选地包含至少一种编码用于将所述重组多肽转运到所述宿主细胞外的信号序列的序列；以及
27.在允许产生所述重组多肽的条件下进行培养。
28.根据第六方面，本发明提供了一种用于降解或改性含甘露聚糖材料的方法，其包括用有效量的第二方面的酶组合物或第一方面的变体处理所述含甘露聚糖材料。
29.在一个实施方案中，所述方法包括使所述含甘露聚糖材料与所述酶组合物或所述变体在水性介质中接触。
30.根据第七方面，本发明提供了一种动物饲料，其包含第二方面的酶组合物或第一方面的变体，和至少一种植物来源的蛋白质源或含甘露聚糖的产物或副产物，以及
31.a.任选地至少一种酶，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶或其组合；和
32.b.任选地至少一种填充剂，所述填充剂选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
33.根据第八方面，本发明提供了一种饲料补充剂，其包含第二方面的酶组合物或第一方面的变体；以及
34.a.任选地至少一种酶，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶或其组合；和
35.b.任选地至少一种填充剂，所述填充剂选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
36.根据第九方面，本发明提供了第一方面的变体或第二方面的酶组合物在石油钻井或水力压裂中；在咖啡提取物、果汁、菠萝汁或豆浆的加工中；在洗涤剂中；在降解含有甘露聚糖的污渍中；或在降解水溶液中的甘露聚糖中的用途。
附图说明
37.图1显示了在里氏木霉(trichoderma reesei)转化中用于表达目标基因(goi)/甘露聚糖酶变体基因的表达质粒的示意图。重组基因在宿主细胞中的表达通过使用以下遗传元件来控制：用于转录起始的里氏木霉cel7a启动子(pcel7a)和用于转录终止的里氏木霉cel6a(tcel6a)终止子。使用里氏木霉cel6a载体代替以kex2作为切割位点的天然甘露聚糖酶信号序列。包括amds基因(amds)用于选择转化体，并且里氏木霉cel7a 3'-和5'-侧翼区域用于任选地将表达靶向cel7a基因座。图片是使用biomatters创建的geneious prime 2019生成的。
38.图2a描述了变体cm124和亲本man6甘露聚糖酶在launder-ometer中在40℃、16
°
dh、60min、ph约8.2下在4.4g/l的商业重垢液体洗涤剂存在下以亮度增加(4种污渍的δl*的总和)表示的去污性能。酶以每毫升洗涤液的活性单位(mnu)计量。
39.图2b描述了变体cm124和亲本man6甘露聚糖酶在launder-ometer中在40℃、16
°
dh、60min、ph约10下在3.8g/l的商业漂白洗涤剂粉末存在下以亮度增加(4种污渍的δl*的总和)表示的去污性能。酶以每毫升洗涤液的活性单位(mnu)计量。
40.图3a描述了变体cm124、cm201、cm206和亲本man6甘露聚糖酶在launder-ometer中在40℃、16
°
dh、60min、ph约8.4下在3.2g/l的商业hdl基础洗涤剂浓缩物存在下以亮度增加
(4种污渍的δl*的总和)表示的去污性能。酶的剂量为每毫升洗涤液0.8个活性单位(mnu)。
41.图3b描述了变体cm124、cm201、cm204、cm206和亲本man6甘露聚糖酶在launder-ometer中在40℃、16
°
dh、60min、ph约10下在3.8g/l的商业漂白洗涤剂粉末存在下以亮度增加(4种污渍的δl*的总和)表示的去污性能。酶的剂量为每毫升洗涤液0.8个活性单位(mnu)。
42.图4显示了变体cm124、cm201、cm204、cm206和亲本man6甘露聚糖酶在不含硼酸的含蛋白酶的商业液体洗涤剂浓缩物制剂中在37℃和4周时的稳定性。
43.图5描述了变体cm201、cm206和亲本man6甘露聚糖酶在洗衣机中在40℃和16
°
dh下进行全尺寸试验时以亮度增加(6种污渍的δl*的总和)表示的去污性能。含硼酸的商业液体洗涤剂浓缩物的剂量为每次洗涤56.9g。酶的剂量为每毫升洗涤液0.5个活性单位(mnu)。
44.图6描述了变体cm201、cm206和亲本man6甘露聚糖酶在洗衣机中在40℃和16
°
dh下进行全尺寸试验时以亮度增加(6种污渍的δl*的总和)表示的去污性能。商业漂白洗涤剂粉末的剂量为每次洗涤58.9g。酶的剂量为每毫升洗涤液0.5个活性单位(mnu)。
45.图7a显示了变体cm201和cm206与商业甘露聚糖酶相比，在含硼酸的含蛋白酶的商业液体洗涤剂浓缩物中在37℃和4周时的稳定性。
46.图7b显示了变体cm201和cm206与商业甘露聚糖酶相比，在不含硼酸的含蛋白酶的商业液体洗涤剂浓缩物中在37℃和4周时的稳定性。
47.图8描述了变体cm201和cm206在launder-ometer中在40℃、16
°
dh、60min、ph约10下在3.8g/l的商业漂白洗涤剂粉末存在下以亮度增加(4种污渍的δl*的总和)表示的去污性能。使用商业甘露聚糖酶进行比较。酶以每毫升洗涤液的活性单位(mnu)计量。
48.序列表
49.seq id no:1不含信号肽的成熟man6蛋白的氨基酸序列
50.seq id no:2不含信号肽编码序列的里氏木霉密码子优化的man6基因的核苷酸序列
具体实施方案
51.在一个实施方案中，seq id no:1的至少位置s256被取代。优选地，所述变体相比于对其进行取代的亲本甘露聚糖酶man6具有改进的性能。从下面的实施例以及图3a和图3b可以看出，位置256可以被不同的氨基酸取代并获得改进的变体。例如，在位置256中具有不同取代的变体cm201和cm204均具有优于亲本man6酶的性能。因此，在位置256中可以使用不同的氨基酸取代，只要所述变体保留甘露聚糖酶活性即可，这很容易测试，例如通过使用实施例2的测试。例如，在位置256具有不同取代的变体cm125(s256t)、cm79(s256n)、cm80(s256r)和(s256h)cm81具有甘露聚糖酶活性。此外，cm123(s256a)具有与上述变体相似的活性。因此，将残基256取代为ala或gly是取代的一种优选实施方案，但也可以使用其他取代。
52.在一个实施方案中，位置256，例如s256，被取代为n、r、h、t、g或a以提供活性甘露聚糖酶变体。所述变体可以是单取代变体，或者其与seq id no:1相比可以在其氨基酸序列中包含进一步的取代或变异。
53.在一个实施方案中，所述变体在位置256中包含对选自s、n、e和d的天然氨基酸的
取代。在一个优选的实施方案中，所述天然氨基酸被取代为g或a。
54.在一个实施方案中，所述变体包含至少一个进一步的取代。
55.在一个实施方案中，所述变体包含在位置256(例如s256)中的氨基酸取代，以及在位置24和/或123中(例如在位置v24和/或v123中)的进一步的取代。优选地，所述进一步的取代是对另一氨基酸的取代，例如选自g、a、v、l、i、f、w的取代。可以根据实施例2和4测试此类变体的性能和稳定性。优选地，所述变体与具有seq id no 1的天然甘露聚糖酶相比具有提高的性能和/或稳定性。
56.在洗涤剂中的稳定性测试中，变体cm201和cm204的残余活性也比亲本man6酶有所提高(参见实施例4和图4)。结果证实可以使用位置256中的不同取代，并且可以通过取代来修饰位置24以进一步提高此类变体的储存稳定性。
57.在一个实施方案中，所述变体至少包含以下取代：位置24和256；位置24、123和256；或位置123和256。这些实施方案的优点是相比于亲本甘露聚糖酶改进的性能。另一个优点是相比于在位置256(例如s256)中具有取代的变体改进的稳定性。
58.在一个实施方案中，与具有seq id no:1的氨基酸序列的甘露聚糖酶相比，所述变体具有改进的性能。性能可以如实施例2中所述测量。
59.在一个实施方案中，与具有seq id no:1的氨基酸序列的甘露聚糖酶相比，所述变体具有改进的稳定性。稳定性可以如实施例4中所述测量。
60.在一个实施方案中，与具有seq id no:1的氨基酸序列的甘露聚糖酶相比，所述变体在不具有蛋白酶抑制剂的含蛋白酶的洗涤剂中具有改进的稳定性。
61.在一个实施方案中，所述变体至少包含以下取代：位置v24i和s256a；或位置v24i和s256g；或位置v24i、v123i、s256a；或位置v24i、v123i和s256g；或位置v123i和s256a；或位置v123i和s256g。
62.在一个实施方案中，与seq id no:1相比，所述变体中的取代的总数为1-10、2-10、3-10或4-10个。在一个实施方案中，所述变体具有1个取代。在一个实施方案中，所述变体具有2个取代。在一个实施方案中，所述变体具有3个取代。在一个实施方案中，所述变体具有4个取代。在一个实施方案中，所述变体具有5个取代。
63.在一个实施方案中，所述变体是表1中公开的变体。这些变体可以作为重组蛋白产生，例如在木霉(trichoderma)宿主细胞中。
64.在一个实施方案中，所述酶组合物以液体组合物或固体组合物、溶液、分散体、糊剂、粉末、细粒、颗粒、包衣颗粒、片剂、饼状物、晶体、晶浆、凝胶或丸粒的形式提供。
65.在一个实施方案中，所述洗涤剂组合物以液体洗涤剂或固体洗涤剂、条状物、均质片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个隔室的囊袋、常规或致密的粉末、细粒、颗粒、糊剂、凝胶、或常规的、致密的或浓缩的液体的形式提供。
66.在一个实施方案中，所述洗涤剂组合物还包含一种或多种额外的酶，所述额外的酶选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、果胶分解酶、酯酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、核酸酶和/或过氧化物酶，优选选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。
67.在一个实施方案中，所述洗涤剂组合物不含蛋白酶抑制剂、硼酸或其衍生物，例如硼酸盐和4-甲酰基苯基硼酸(4-fpba)，或具有蛋白酶抑制功能的肽化合物。
68.甘露聚糖是指由通过β-1,4-键连接在一起的甘露糖骨架与通过α-1,6-键连接到所述骨架上的半乳糖侧链组成的多糖。甘露聚糖构成基于植物的材料，例如瓜尔胶和刺槐豆胶。葡甘露聚糖是具有或多或少规则交替的β-1,4连接的甘露糖和葡萄糖的骨架的多糖，半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖是具有α-1,6连接的半乳糖侧分支的甘露聚糖和葡甘露聚糖。
69.如本文所用，术语“甘露聚糖酶”或“半乳甘露聚糖酶”是指本领域中定义为甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶并具有替代名称β-甘露聚糖酶和内切-1,4-甘露聚糖酶并且催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖中的1,4-β-d-甘露糖苷键的水解的甘露聚糖酶。甘露聚糖酶根据酶命名法分类为ec 3.2.1.78。
70.如本文所用，“分离的”是指在自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子在内的任何物质，其至少部分地从一个或多个或所有与它在自然界中缔合的天然存在成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质，通过人为修饰的任何物质；或(4)通过相对于与物质天然缔合的其他组分增加或减少所述物质的量(例如，在宿主细胞中重组产生；编码所述物质的基因的一个或多个拷贝；以及使用对于与编码所述物质的基因天然缔合的启动子而言替代的启动子)而修饰的任何物质。在一个实施方案中，本发明的变体、多肽、酶、多核苷酸、宿主细胞或组合物是分离的。
71.如本文所用，术语“包含”包括“包括”、“含有”和“涵盖”的更广泛含义，以及“由
……
组成”和“仅由
……
组成”的更狭义表达。
72.术语变体是指具有甘露聚糖酶活性并且在一个或多个氨基酸位置包含改变的多肽。所述改变优选地是在一个或多个(例如，几个)位置处的取代、插入和/或缺失。取代是指用一个不同的氨基酸或多个不同的氨基酸替换占据位置的氨基酸；缺失是指去除占据一个位置的氨基酸；而插入是指在占据位置的氨基酸附近并紧接其后添加氨基酸。在一个实施方案中，本发明的变体与seq id no:1具有至少80％，例如至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述变体与seq id no:1不具有100％的序列同一性。
73.在一个实施方案中，所述变体的改进性能包括与亲本甘露聚糖酶相比增加的甘露聚糖降解活性，对所述亲本甘露聚糖酶进行至少一个取代。甘露聚糖降解活性可以通过使用以下实施例中描述的测定法来确定。
74.优选地，与亲本或参考甘露聚糖酶相比，所述变体的去污或洗涤性能相似或有所改进。洗涤性能可以根据以下实施例测量。
75.亲本或亲本甘露聚糖酶是指对其进行改变以产生本发明的变体的甘露聚糖酶。所述亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体，或其片段。在一个优选的实施方案中，所述亲本包含具有seq id no:1的氨基酸序列的多肽。在一个优选的实施方案中，所述亲本甘露聚糖酶是细菌甘露聚糖酶，其与seq id no:1具有至少90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
76.如本文所用，“肽”和“多肽”是包括多个连续聚合氨基酸残基的氨基酸序列。为了本发明的目的，肽是包括多达20个氨基酸残基的分子，而多肽包括超过20个氨基酸残基。肽
或多肽可以包括修饰的氨基酸残基、并非由密码子编码的天然存在的氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基。如本文所用，“蛋白质”可指任何大小的肽或多肽。蛋白质可以是酶、蛋白质、抗体、膜蛋白、肽激素、调节剂或任何其他蛋白质。
77.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，位置256处的丝氨酸被丙氨酸取代被指定为“ser256ala”或“s256a”。
78.优选地，所述变体的氨基酸编号对应于seq id no:1的编号。当它们的序列进行比对时，可以认为两个多肽的氨基酸编号是对应的。
79.术语“多核苷酸”是指从5'至3'端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括rna和dna，并且可以从天然来源分离、体外合成、或由天然和合成分子的组合制备。
80.如本文所用，“同一性”是指两个比对序列之间的氨基酸残基的精确匹配占两个序列中存在残基的位置数量的百分比。当一个序列有一个残基而另一个序列中没有相应的残基时，比对程序允许比对中存在一个空位，并且该位置不计入同一性计算的分母中。同一性是使用embl-ebi网站(www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/)上的成对序列比对工具emboss needle确定的值。
81.如本文所用，“宿主细胞”是指易于用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导、交配、杂交等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而不相同的任何后代。可用的宿主细胞的非限制性实例是真菌细胞，丝状真菌细胞，其来自子囊菌门(ascomycota)、盘菌亚门(pezizomycotina)；优选来自粪壳菌纲(sordariomycetes)、肉座菌亚纲(hypocreomycetidae)、肉座菌目(hypocreales)和小囊菌目(microascales)以及曲霉属(aspergillus)、金孢属(chrysosporium)、毁丝霉属(myceliophthora)和腐质霉属(humicola)；更优选来自肉座菌科(hypocreacea)、丛赤壳科(nectriaceae)、麦角菌科(clavicipitaceae)、小囊菌科(microascaceae)和木霉属(trichoderma)(无性型肉座菌属)、镰孢霉属(fusarium)、赤霉菌属(gibberella)、丛赤壳属(nectria)、葡萄状穗霉属(stachybotrys)、麦角菌属(claviceps)、绿僵菌属(metarhizium)、稻曲菌属(villosiclava)、蛇形虫草属(ophiocordyceps)、头孢霉属(cephalosporium)和赛多孢子菌属(scedosporium)；更优选来自由里氏木霉(红褐肉座菌(hypocrea jecorina))、柠檬绿木霉(t.citrinoviridae)、长枝木霉(t.longibrachiatum)、绿木霉(t.virens)、哈茨木霉(t.harzianum)、棘孢木霉(t.asperellum)、深绿木霉(t.atroviridae)、近里氏木霉(t.parareesei)、尖镰孢霉(fusarium oxysporum)、禾本镰孢霉(f.gramineanum)、假禾谷镰孢霉(f.pseudograminearum)、镶片镰孢霉(f.venenatum)、藤仓赤霉(gibberella fujikuroi)、串珠赤霉(g.moniliformis)、玉蜀黍赤霉(g.zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳菌)(nectria(haematonectria)haematococca)、黑葡萄穗霉(stachybotrys chartarum)、s.chlorohalonata、黑麦麦角菌(claviceps purpurea)、黄绿绿僵菌(metarhizium acridum)、金龟子绿僵菌(m.anisopliae)、稻绿核菌(villosiclava virens)、冬虫夏草(ophiocordyceps sinensis)、顶头孢霉(头孢霉菌)(acremonium(cephalosporium)chrysogenum)和尖端赛多孢子菌(scedosporium apiospermum)和黑曲霉(aspergillus niger)、泡盛曲霉(aspergillus awamori)、米曲霉(aspergillus oryzae)、鲁克文金孢菌
(chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)、特异腐质霉(humicola insolens)和灰腐质霉(humicola grisea)，最优选里氏木霉。
82.宿主细胞的非限制性实例是细菌细胞，优选地革兰氏阳性杆菌(例如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(b.pumilus))，革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌(escherichia coli))，放线菌目(actinomycetales)(例如链霉菌属(streptomyces sp.))，和酵母(例如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica))。
83.在一个实施方案中，所述宿主细胞是真菌细胞，优选丝状真菌细胞，例如木霉属或里氏木霉。在一个实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞，优选地革兰氏阳性杆菌细胞，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌。
[0084]“重组细胞”或“重组宿主细胞”是指这样的细胞或宿主细胞，其已被遗传修饰或改变以包含对于所述细胞或宿主细胞不是天然的核酸序列。在一个实施方案中，所述遗传修饰包括将多核苷酸整合到宿主细胞的基因组中。在另一个实施方案中，所述多核苷酸在宿主细胞中是外源的。
[0085]
如本文所用，“表达”包括涉及在宿主细胞中产生多肽的任何步骤，包括但不限于转录、翻译、翻译后修饰和分泌。表达之后可以是收获(即回收)宿主细胞或表达的产物。
[0086]
术语“表达载体”是指线性或环状的dna分子，其包含编码目标多肽的区段，该区段可操作地连接至提供其转录的额外区段(遗传元件)。这种额外区段可以包括启动子和终止子序列，并且可以任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个可选择标记、增强子、多聚腺苷酸化信号、载体等。表达载体通常来源于质粒或病毒dna，或者它们可含有两者的元件。表达载体可以是方便地进行重组dna程序的任何表达载体，并且载体的选择将经常取决于其中待引入载体的宿主细胞。因此，所述载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。或者，所述载体可以是在引入宿主细胞时被整合至宿主细胞基因组中并与其已整合于其中的染色体一起复制的载体。
[0087]
如本文所用，与特定微生物来源相关的术语“获自”和“可获得的”是指多核苷酸由特定来源表达(同源表达)，或由其中已插入来自来源的基因的细胞表达(异源表达)。
[0088]
术语“酶组合物”是指常规的酶促发酵产物，可能是从单一物种的微生物中分离和纯化的，这种制剂通常包含许多不同的酶促活性；或者单组分酶(优选通过使用常规重组技术从细菌或真菌物种衍生的酶)的混合物，这些酶已经发酵并且可能单独分离和纯化并且其可能源自不同物种，优选真菌或细菌物种或微生物的发酵产物，所述微生物充当用于产生重组甘露聚糖酶的宿主细胞，但所述微生物同时产生其他酶。
[0089]
术语“可操作地连接”在提及dna区段时是指所述区段被排列成使其共同起作用以达到其预期目的，例如转录在启动子中起始并通过编码区段进行至终止子。术语“启动子”是指含有提供rna聚合酶结合和转录起始的dna序列的基因的一部分。启动子序列优选位于基因的5'非编码区中。
[0090]
术语“分泌信号序列”或“信号序列”是指编码多肽(“分泌肽”或“信号肽”)的dna序列，其作为较大多肽的组分，引导所述较大多肽通过产生其的宿主细胞的分泌途径。所述分泌信号序列可以是天然的，或者它可以用来自另一来源的分泌信号序列或载体序列代替。
取决于宿主细胞，较大的肽可能在通过分泌途径转运期间被切割以除去分泌肽。
[0091]
术语“核心区”是指酶的结构域，其可能已经或可能没有被修饰或改变，但其保留了酶原始活性的至少一部分；本领域已知的催化结构域保持功能性。根据本发明的变体的核心区对应于与man6 seq id no:1的氨基酸1-289对齐的氨基酸。
[0092]
有效量是指在所选应用或用途中足以降解甘露聚糖的变体的量。
[0093]
优选地，变体的改进性能包括所述变体在某些实验条件下降解甘露聚糖的性能提高的含义。因此，所述变体的性能可由技术人员测试并与参考例如野生型酶或另一变体进行比较。
[0094]
除非另有说明，否则术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂”包括固体、颗粒或粉末形式的通用或重垢洗涤试剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊剂形式的通用洗涤试剂，尤其是所谓的重垢液体(hdl)类型；液体细织物洗涤剂；手动洗碗剂或轻垢洗碗剂，尤其是高发泡型的那些；机器洗碗剂，包括用于家用和机构使用的各种片剂、颗粒、液体和冲洗-助剂类型；液体清洁和消毒剂、汽车或地毯清洗剂、浴室清洁剂；金属清洁剂；以及清洗助剂如漂白添加剂和“染色棒(stain-stick)”或预处理类型。术语“洗涤剂”、“洗涤剂组合物”和“洗涤剂制剂”用于指混合物，所述混合物旨在用于清洁被染污物体的洗涤介质。在一些实施方案中，所述术语用于指清洗织物和/或服装(例如，“洗衣洗涤剂”)。在替代实施方案中，所述术语是指其他洗涤剂，例如用于清洁碗碟、餐具等的洗涤剂(例如，“洗碗洗涤剂”)。本发明并不旨在限于任何特定的洗涤剂制剂或组合物。除了含有根据本发明的甘露聚糖酶变体以外，所述洗涤剂还旨在可含有例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、泡沫促进剂、肥皂泡抑制剂、染料、香料、鞣质抑制剂、光学增白剂、杀细菌剂、杀真菌剂、土壤悬浮剂、防腐剂、助水溶剂、织物色调剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、土壤释放聚合物、抗再沉积剂、抗收缩剂、抗皱剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、香料、颜料、sod抑制剂、溶剂和用于液体洗涤剂的结构化剂、结构弹性剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、蓝化剂和荧光染料、抗氧化剂和增溶剂。然而，如上所述，蛋白酶抑制剂是任选的，因为本发明的变体在若干洗涤剂制剂中在蛋白酶存在下是稳定的。蛋白酶抑制剂可用于多酶组合物和洗涤剂以保护其他酶免于降解。
[0095]
术语“纺织品”是指任何纺织品材料，包括纱线、纱线中间物、纤维、非编织材料、天然材料、合成材料和任何其他纺织品材料、由这些材料制成的织物和由织物制成的产品(例如服装、亚麻布和其他物品)。纺织品或织物可以呈针织物、编织物、斜纹粗棉布、非编织物、毡、纱线和毛巾布的形式。纺织品可以是基于纤维素的，例如天然纤维素材料，包括棉、亚麻(flax)/亚麻制品(linen)、黄麻、苎麻、剑麻或椰棕或人造纤维素材料(例如源自木浆)，包括粘胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(tricell)、莱赛尔纤维(lyocell)或其掺合物。纺织品或织物也可以是基于非纤维素的，例如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和丝绸或合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和spandex/弹性纤维(elastane)，或其掺合物，以及基于纤维素和基于非纤维素的纤维的掺合物。掺合物的实例是棉和/或人造丝/粘胶与一种或多种伴随材料如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)和含纤维素纤维(例如人造丝/粘胶、苎麻、亚麻/亚麻制品、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤
维)的掺合物。织物可以是常规的可洗衣服，例如染污的家用衣服。当使用术语织物或服装时，也旨在包括更广泛的术语纺织品。
[0096]
术语“稳定性”在某些实施方案中包括储存稳定性和在使用期间、例如在洗涤过程期间的稳定性(呈洗涤稳定性)，并且反映了根据本发明的变体随时间变化的稳定性，例如，当甘露聚糖酶保持在溶液中，特别是在洗涤剂溶液中时，保留多少活性。稳定性受许多因素的影响，所述因素例如ph、温度、洗涤剂组成，例如蛋白酶、稳定剂、助洗剂、表面活性剂、蛋白酶抑制剂等。甘露聚糖酶稳定性可使用如在实施例中描述的“活性测定”来测量。
[0097]
如本文所用，“甘露聚糖酶活性”是指多肽如本发明的变体的甘露聚糖降解活性。如本文所用的降解或改性是指通过甘露聚糖酶从甘露聚糖多糖水解甘露糖单元。根据本发明的多肽的甘露聚糖降解活性可以根据本领域中已知的标准测试程序进行测试。实施例2提供了用于测定甘露聚糖酶活性的方法的实例。
[0098]
在本发明的一个实施方案中，所述酶组合物还包含一种或多种额外的酶，所述额外的酶选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、果胶分解酶、酯酶、植酸酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、核酸酶、漆酶和/或过氧化物酶，优选选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。
[0099]
包含变体和额外的酶的本发明的酶组合物在提供协同效应方面是有利的。当包含甘露聚糖酶的本发明的酶组合物用于洗涤剂中例如当洗涤污渍时，需要此类额外的酶。与甘露聚糖酶和甘露聚糖酶变体一起工作的特别有利的协同酶是淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶，或其组合，例如包含甘露聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶的组合物。
[0100]
一般来说，所选酶的性质应与所选洗涤剂相容(即，最佳ph值、与其他酶促和非酶促成分的相容性等)，并且所述酶应以有效量存在。
[0101]
用于固体衣物洗涤剂的组合物例如可包含按所述组合物的重量计0.000001％-5％、例如0.000005-2％、例如0.00001％-1％、例如0.00001％-0.1％的酶蛋白。在一个实施方案中，所述酶蛋白是本发明的变体。
[0102]
用于洗衣液的组合物例如可包含按所述组合物的重量计0.000001％-3％、例如0.000005％-1％、例如0.00001％-0.1％的酶蛋白。在一个实施方案中，所述酶蛋白是本发明的变体。
[0103]
用于自动洗碗机的组合物例如可包含按所述组合物的重量计0.000001％-5％、例如0.000005％-2％、例如0.00001％-1％、例如0.00001％-0.1％的酶蛋白。在一个实施方案中，所述酶蛋白是本发明的变体。
[0104]
在本发明的另一个实施方案中，所述洗涤剂组合物呈条状物、均质片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个隔室的囊袋、常规或致密的粉末、细粒、糊状物、凝胶，或常规的、致密的或浓缩的液体的形式。在一个实施方案中，所述洗涤剂组合物可以是衣物洗涤剂组合物，优选液体或固体衣物洗涤剂组合物。存在多种洗涤剂制剂形式，例如层(相同或不同相)、囊袋以及用于机器计量单元的形式。
[0105]
实施例
[0106]
提供以下实施例以说明本发明的各个方面。它们并不旨在限制由权利要求限定的本发明。
[0107]
实施例1.合成甘露聚糖酶变体的变体设计和表达
[0108]
将标准分子生物学方法用于dna的分离和酶处理(例如质粒dna的分离、dna消化以产生dna片段)、大肠杆菌转化、测序等。所使用的基本实验室方法如酶、试剂或试剂盒制造商所描述，或如标准分子生物学手册(例如sambrook和russell(2001))中所描述，或如以下实施例中所描述。
[0109]
为了改进克劳氏芽孢杆菌(bacillus clausii)man6甘露聚糖酶的性能，基于野生型酶的结构分析设计了210种变体(表1)。man6甘露聚糖酶变体源自亲本man6分子，所述分子是在里氏木霉中产生的不具有天然信号肽的野生型克劳氏芽孢杆菌man6甘露聚糖酶(seq id no:1)。编码亲本甘露聚糖酶的核酸序列针对里氏木霉进行密码子优化(seq id no:2)。使用来自里氏木霉cel6a的载体序列代替克劳氏芽孢杆菌man6甘露聚糖酶的天然信号序列，构建表达载体(质粒)用于生产重组甘露聚糖酶变体cm1-210。所述表达构建体含有可操作连接的里氏木霉cel7a启动子、作为载体的cel6a cbd、kex2切割位点、甘露聚糖酶变体基因和cel6a终止子，接着是如paloheimo等人,2003所述的amds标记基因。此外，构建体含有cel7a 3'和5'侧翼区域，用于任选地将表达载体靶向cel7a基因座(图1)。合成基因(包括在亲本分子的核心区中引入的突变)通过连接作为nrui-bamhi片段与里氏木霉cel7a启动子后的cel6a载体/kex2阅读框精确融合。
[0110]
环状表达质粒用于里氏木霉原生质体转化。以乙酰胺作为唯一氮源来选择转化体。宿主菌株缺乏四种主要的内源性纤维素酶：cbhi/cel7a、cbhii/cel6a、egi/cel7b和egii/cel5a。转化是根据等人,1987并利用karhunen等人,1993中描述的修改进行的。在摇瓶培养之前，将转化体在马铃薯右旋糖琼脂(pda)上形成孢子。
[0111]
从摇瓶培养的培养物上清液(50ml)分析转化体的甘露聚糖酶产生。转化体在用ph 6.0的5％kh2po4缓冲的复合纤维素酶诱导培养基(joutsjoki等人,1993)中于30℃、250rpm下生长7天。如实施例2中所述，以从半乳甘露聚糖的还原糖释放从培养物上清液中测量重组蛋白的酶活性。还通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)从培养物上清液中检测重组蛋白的产生。
[0112]
选择的转化体和产生亲本man6甘露聚糖酶的参考菌株在选择平板上通过单个分生孢子纯化，然后在pda上形成孢子，并在摇瓶或生物反应器中在复合纤维素酶诱导培养基中培养以获得用于应用测试的材料(实施例3至7)。
[0113]
表1.在里氏木霉中产生的man6变体列表。氨基酸编号对应于seq id no:1中呈现的亲本分子的氨基酸编号。
[0114]
[0115]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119][0120]
实施例2.通过dns方法测定半乳甘露聚糖酶活性
[0121]
以在50℃和ph 7.0下5分钟内从半乳甘露聚糖(0.3重量/重量％)中释放的还原糖测量甘露聚糖酶活性(mnu)。使用二硝基水杨酸以分光光度法测定释放的还原糖的量。
[0122]
所述测定中使用的底物(0.3重量/重量％)制备如下：在约80℃下使用加热磁力搅拌器将0.6g刺槐豆胶(sigma g-0753)溶解在50mm柠檬酸钠缓冲液ph 7(或柠檬酸磷酸盐缓冲液ph 7)中并加热至沸点。将所述溶液冷却并在冷室(2-8℃)中在连续搅拌下溶解过夜，并通过离心去除不溶性残余物。之后，将溶液用缓冲液加注至200ml。将底物冷冻储存并通过在沸水浴中加热至约80℃熔化，冷却至室温并在使用前小心混合。
[0123]
所述测定中使用的dns试剂是通过将50g 3.5-二硝基水杨酸(sigma d-550)溶解在约4升水中制备的。在连续磁力搅拌下逐渐加入80.0g naoh并使其溶解。在连续搅拌下分小份加入1500g量的罗谢尔盐(rochelle salt)(k-na-酒石酸盐，merck 8087)。小心地将溶液升温至最高温度45℃，冷却至室温并加注至5000ml。之后，通过whatman 1滤纸过滤并在室温下储存在暗瓶中。
[0124]
反应首先通过在两个试管中的每一者中加入1.8ml底物溶液并在50℃下平衡5分钟来起始，然后向其中一个试管中加入200μl适当稀释的酶溶液，使用涡旋混合器充分混合并在50℃下精确温育5分钟。酶空白未平衡或温育。通过将3.0ml dns试剂加入到两个管中并混合来停止反应。添加dns后，将200μl样品溶液加入到酶空白管中。两个管均置于沸水浴中。煮沸精确5分钟后，将试管置于冷却水浴中并使其冷却至室温。在540nm处测量样品相对于酶空白的吸光度，并且从校准曲线读取活性并乘以稀释因子。合适的稀释样品产生0.3-0.45的目标吸光度差异。
[0125]
通过将360mg甘露糖(sigma m-6020，储存在干燥器中)溶解在100ml测定缓冲液中并稀释至含有3、6、10和14μmol/ml甘露糖的溶液，从20mm甘露糖储备溶液制备标准曲线。除了在50℃下温育之外，标准品的处理方式与样品相同。在540nm处测量相对于试剂空白(含有缓冲液而不是甘露糖的标准稀释液)的吸光度。为每个系列的测定构建校准曲线。
[0126]
一个甘露聚糖酶单位(mnu)定义为在测定条件(1mnu＝1nkat)下在一秒钟内从半乳甘露聚糖中产生还原能力相当于1nmol甘露糖的还原糖的酶量。
[0127]
实施例3.甘露聚糖酶变体cm124、cm201、cm204和cm206与亲本man6甘露聚糖酶相比在launder-ometer中在40℃下的小规模测试中的去污性能
[0128]
测试在木霉属中产生的甘露聚糖酶变体cm124、cm201、cm204和cm206的摇瓶上清液(如实施例1中所述)在40℃和16
°
dh的水硬度下用商业洗涤剂去除甘露聚糖酶敏感性标准污渍的能力。亲本man6被用作参考。使用来自center for testmaterial b.v.(荷兰)的以下人工染污的测试布：棉织品上的甘露聚糖酶敏感性巧克力布丁(e-165)、棉织品上的刺
槐豆胶与色素(c-s-73)、棉织品上的瓜尔豆胶与炭黑(c-s-43)以及棉织品上的蛋黄酱与炭黑(c-s-05s)。将织物切成6cm
×
6cm的布样并且在测试中使用各2块。
[0129]
表2中描述的商业重垢液体洗涤剂(hdl)的使用浓度为每升洗涤液4.4g，商业hdl基础洗涤剂浓缩物的使用浓度为3.2g/l，并且商业漂白洗涤剂粉末的使用浓度为3.8g/l。洗涤剂含有除甘露聚糖酶外的所有其他酶。含有洗涤剂的洗涤液是在硬度为16
°
dh的合成自来水中制备的。液体洗涤剂的洗涤液的ph为约8.2-8.4，而漂白洗涤剂的ph为约10。
[0130]
表2.市售液体洗涤剂的组成
[0131]
成分％ 阴离子表面活性剂、肥皂15
–
30 非离子表面活性剂5
–
15 膦酸盐《5 硼酸≤1 其他成分：例如光学增白剂、香料、防腐剂
ꢀꢀ
ph 8.2-8.6
ꢀꢀ
[0132]
根据测试和洗涤剂，甘露聚糖酶的剂量为每毫升洗涤液0.05-0.8mnu活性。如实施例2中所述测量活性。对照样品含有不含甘露聚糖酶的洗涤剂溶液。
[0133]
对于硬度为16
°
dh的合成自来水，在去离子水(milli-q或等同物)中制备以下储备溶液：
[0134]
具有1000
°
d钙硬度的储备溶液：cacl2×
2h2o(1.02382.1000，merck kgaa，德国)26.22g/l
[0135]
具有200
°
d镁硬度的储备溶液：mgso4×
7h2o(1.05886.1000，merck kgaa，德国)8.79g/l
[0136]
nahco3储备溶液：nahco3(1.06329.1000merck kgaa，德国)29.6g/l
[0137]
将13.3ml cacl2溶液、13.3ml mgso4溶液和10.0ml新鲜配制的nahco3溶液按给定顺序加入容量瓶中，用去离子水补充至1升并混合。水的硬度通过络合滴定法测定并发现正确。
[0138]
如下在atlas lp-2launder-ometer中进行去污处理。首先将launder-ometer预热到40℃。然后将洗涤剂、250ml硬度为16
°
dh的合成自来水和稀释的酶(《1.0ml)加入到1.2升容器中。加入污渍，并将launder-ometer在40℃下以42rpm的转速运行60分钟。之后，将布样在流水下仔细冲洗并在室内空气中在避光的栅格上干燥过夜。
[0139]
通过使用konica minolta cm-3610a分光光度计使用l*a*b*颜色空间坐标(光源d65/10
°
，420nm截止)以反射值测量颜色来评价去污效果。指示甘露聚糖酶性能(去污效果/效率)的污渍褪色计算为δl*(delta l*)，其是指酶处理织物的亮度值l*减去用不含甘露聚糖酶的洗涤液处理的织物的亮度值l*(对照)。最终结果(总去污效果)显示为每4种污渍的δl*的总和。每种污渍的颜色值是2个布样的平均值。
[0140]
在商业重垢液体洗涤剂(图2a)和商业漂白洗涤剂粉末(图2b)中使用每ml洗涤液0
–
0.4mnu的剂量将变体cm124与亲本man6进行比较。与亲本man6相比，cm124在两种洗涤剂中都具有改进的去污性能。
[0141]
使用亲本man6作为参考，在商业hdl基础洗涤剂浓缩物(图3a)和商业漂白洗涤剂
粉末(图3b)中对变体cm124、cm201和cm206进行了进一步测试。在两个测试中甘露聚糖酶的剂量为0.8mnu/ml，并且也在漂白洗涤剂中测试了变体cm204。根据结果，所有变体甘露聚糖酶都比亲本man6具有更好的去污性能。
[0142]
实施例4.甘露聚糖酶变体(cm124、cm201、cm204、cm206)与亲本man6相比在液体洗涤剂中的稳定性
[0143]
将表现最佳的甘露聚糖酶变体的稳定性与亲本man6甘露聚糖酶进行比较。将在木霉属中产生的变体cm124、cm201、cm204和cm206的摇瓶培养上清液(如实施例1中所述)以4重量/重量％加入洗涤剂中。使用不含硼酸的商业液体洗涤剂浓缩物。它含有其他酶，包括蛋白酶，但没有甘露聚糖酶。样品在带盖的塑料管中在37℃下温育4周。除了使用30分钟温育时间之外，通过实施例2中描述的活性测定以特定间隔测量活性。结果计算为残余活性(％)，其是通过将在特定时间点采集的样品的活性除以样品的初始活性而获得的。
[0144]
使用不含硼酸的洗涤剂制剂获得的结果显示于图4中。与亲本man6相比，变体cm124、cm201、cm204和cm206的稳定性在37℃高温下储存4周时得到改进。在室温(约20-22℃)下，man6和所有变体都同样稳定。结果证实，变体的储存稳定性可以通过额外的取代进一步改进，例如通过在位置24和123中的取代。
[0145]
实施例5.甘露聚糖酶变体cm201和cm206在40℃下的全尺寸测试中的去污性能
[0146]
变体cm201和cm206的去污性能在洗衣机中用液体和粉末洗涤剂在40℃下并使用16
°
dh的水硬度进行了全尺寸测试。亲本分子man6用作参考。所测试的酶制剂是从生物反应器培养中获得的生产样样品，并且它们的剂量为每毫升洗涤液0.5mnu。如实施例2所述测量活性。商业漂白洗涤剂粉末(含有除甘露聚糖酶以外的所有其他酶)的剂量为每次洗涤58.9(约3.8g/l)，并且商业液体洗涤剂浓缩物(含有蛋白酶和除甘露聚糖酶以外的其他酶)的剂量为每次洗涤56.9g。使用由center for testmaterial b.v.(cft，荷兰)供应的人工染污的甘露聚糖酶敏感试验布(5件)和天然污渍(1件)作为试验材料(表3)。污渍布样被缝合到浮松布(huckaback)毛巾上。首先将人造测试布切成10cm
×
10cm的小块。除了测试监测物外，每次洗涤添加4块压载染污片(wfk-sbl2004，cft)。每次洗涤使用双倍量的每种测试监测物(示踪剂)并重复测试。在主洗之前，首先使用速洗程序预润湿压载负载物(不具有含污渍的浮松布毛巾)。主洗步骤使用针对棉织品的短程序(45分钟)在40℃下进行。通过添加适量的溶液cacl2×
2h2o和mgso4×
7h2o，将洗涤水的硬度调节至16
°
dh。洗涤后，将布样在室内空气中在避免日光的栅格上干燥过夜。工艺条件和参数描述于表4中。
[0147]
如实施例3中所述，通过以反射值测量颜色来评价去污效果，不同之处在于最终结果(总去污效果)显示为每6种污渍的δl*的总和。每种污渍的颜色值是从两次洗涤中获得的4个布样的平均值。
[0148]
使用商业液体洗涤剂浓缩物获得的结果示于图5中并且使用商业漂白洗涤剂粉末获得的结果示于图6中。在两种洗涤剂中，变体cm201与man6相比具有更好的去污效果。当与亲本man6相比时，变体cm206在液体和漂白洗涤剂中表现出至少同样好的性能。
[0149]
表3.全尺寸测试中使用的污渍
[0150][0151]
表4.全尺寸测试中使用的工艺参数和条件
[0152][0153]
实施例6.变体cm201和cm206与商业甘露聚糖酶相比在液体洗涤剂中的稳定性
[0154]
从cm201和cm206的生物反应器培养获得生产样样品，在不同温度下测试其在液体洗涤剂中的稳定性持续数周，使用商业甘露聚糖酶制剂用于比较。
[0155]
在不含硼酸的商业液体洗涤剂浓缩物(与实施例4中使用的相同)和另一种含硼酸的商业液体洗涤剂浓缩物中进行测试。洗涤剂含有蛋白酶和其他酶，但不含甘露聚糖酶。甘露聚糖酶以4重量/重量％添加在洗涤剂中。样品在带盖的塑料管中在37℃下温育4周，并且在30℃和室温(20-22℃)下温育近7或8周。除了使用60分钟温育时间之外，使用实施例2中描述的活性测定以特定间隔测量活性。结果计算为残余活性(％)，其是通过将在特定时间点获取的样品的活性除以样品的初始活性而获得的。
[0156]
与商业甘露聚糖酶相比，变体cm201和cm206在含硼酸的液体洗涤剂(图7a)和不含硼酸的液体洗涤剂(图7b)中具有明显更好的稳定性。
[0157]
实施例7.变体cm201和cm206与商业甘露聚糖酶相比在launder-ometer中在40℃下的小规模测试中的性能
[0158]
从生物反应器培养中获得的cm201和cm206的酶制剂在40℃和16
°
dh的水硬度下在商业漂白洗涤剂粉末中进行测试，如实施例3中所述，使用商业甘露聚糖酶作为参考。酶以每毫升洗涤液的活性单位(mnu)计量，代表商业甘露聚糖酶的典型计量范围，也计算为洗涤剂重量的酶产物％)。
[0159]
结果示于图8中。与商业甘露聚糖酶相比，变体cm201和cm206在含漂白剂的洗涤剂中具有明显更好的去污性能。
[0160]
参考文献
[0161]
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