mirna在预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性中的应用
技术领域：
：1.本发明属于生物医学
技术领域：
：，具体地，本发明涉及mirna在预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性中的应用。
背景技术：
：：2.肺癌(lungcancer)是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中，非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)占80％，而肺腺癌(lungadenocarcinoma)是nsclc的主要组织学类型(jip,diederichss,wangw,etal.malat-1,anovelnoncodingrna,andthymosinβ4predictmetastasisandsurvivalinearly-stagenon-smallcelllungcancer[j].oncogene,2003,22(39):8031-8041.)。尽管目前对肺癌的相关研究和临床试验进展迅速，但肺癌预后仍较差，80-85％患者诊断时已是中晚期，5年生存率不到15％(bailey-wilsonje,amosci,pinneysm,etal.amajorlungcancersusceptibilitylocusmapstochromosome6q23–25[j].theamericanjournalofhumangenetics,2004,75(3):460-474.)，因此，为达到肺癌患者的早期诊断和精准化、个体化治疗，亟需筛查新的生物标志物和作用靶点，探讨肺癌发生发展的作用机制，提高肺癌病人患者的生存率。[0003]mirna是一种长度为19-22个核苷酸的非编码单链rna。它们通过沉默mrna来发挥作用，从而在转录后水平调节基因的表达。mirna的合成首先是由mirna编码基因转录出pre-mirna，随后由rnaseⅲ家族成员drosha将pri-mirna剪切成为长度大约为80bp的发卡结构的pre-mirna，也是mirna前体。最后，pre-mirna在细胞质中被rnaseⅲ家族成员dicer加工成双链的rna。其中一条则与rna沉默复合物(rna-inducedsilencingcomplex，risc)结合形成了risc-mirna复合物，随后再次结合到靶基因的mrna的3’utr来调控靶标。随着近期生物信息学在mirna领域应用逐步推广和深入，科学家应用生物信息学软件对mirna的机制进行分析，显示许多mirna调控靶点位于与细胞癌变密切相关的肿瘤调控因子或通路上，这对于肿瘤病因学的研究具有重要意义。但目前对肺腺癌的分析多局限在对靶基因的预测。[0004]目前，治疗肺腺癌的常规方法有手术治疗、含铂双药化疗、放疗和靶向治疗等，其中，含铂双药化疗作为一种晚期肺腺癌的治疗方案备受关注，也是临床上在晚期肺腺癌患者人群中应用较广的一种治疗方案，含铂双药化疗是指将铂类化疗药物(卡铂、顺铂)与其他非铂单药(紫杉醇、吉西他滨、长春瑞滨)联合应用，但是目前仍然难以预测哪些肺腺癌患者会对含铂双药化疗治疗方案具有敏感性，预测肺腺癌患者对含铂双药化疗的敏感性或反应性仍然是一个巨大的挑战，因此，发现能够用于肺腺癌对含铂双药化疗敏感性进行准确预测的生物标志物，并将其应用于化疗前肺腺癌患者的筛查中对于本领域而言具有重要意义。技术实现要素：[0005]为了克服目前本领域存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供mirna在预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性中的应用。[0006]本发明为了实现上述目的，采用了如下技术方案：[0007]本发明的第一方面提供了检测样本中mirna标志物表达水平的试剂在制备用于预测肺腺癌对含铂双药化疗的敏感性或反应性的产品中的应用。[0008]进一步，所述mirna标志物为mir-4291、mir-449a、和/或mir-663。[0009]本发明中所述mir-4291的序列如seqidno:1所示；[0010]uucagcaggaacagcu(seqidno:1)[0011]所述mir-449a的序列如seqidno:2所示；[0012]uggcaguguauuguuagcuggu(seqidno:2)[0013]所述mir-663的序列如seqidno:3所示；[0014]aggcggggcgccgcgggaccgc(seqidno:3)[0015]进一步，所述mirna标志物为mir-4291、mir-449a、和/或mir-663均为人源(hsa)的mirna。[0016]进一步，所述试剂选自：[0017]特异性识别所述mirna标志物的探针；或[0018]特异性扩增所述mirna标志物的引物。[0019]进一步，所述含铂双药化疗这一治疗方案包括卡铂+紫杉醇、顺铂+吉西他滨、顺铂+长春瑞滨、卡铂+吉西他滨。[0020]进一步，所述产品包括通过高通量测序方法、实时定量pcr、rt-pcr、原位杂交、芯片检测样本中所述mirna标志物表达水平的试剂。[0021]进一步，本发明所述的高通量测序方法包括一代测序、二代测序、三代测序，其中，一代测序也称sanger测序，是利用dna聚合酶合成反应的测序技术，一代测序是基于sanger方法的测序技术；二代测序基于大规模平行测序技术(massiveparallelanalysis，mps)，它能同时完成测序模板互补链的合成和序列数据的获取；三代测序则基于单分子测序和大规模平行测序技术。[0022]进一步，本发明中所述的实时定量pcr是指实时定量聚合酶链式反应，pcr通常使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；rt-pcr则将逆转录酶用于从mrna制备互补的dna(cdna)，然后将cdna通过pcr扩增以产生dna的多个拷贝，本发明中所述的rt-pcr是指逆转录聚合酶链式反应。[0023]进一步，本发明中所述的原位杂交，是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程，原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。[0024]进一步，本发明中所述的芯片检测，是指基因芯片检测，又称dna芯片检测或生物芯片检测，它是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而对靶分子的序列和数量进行分析。[0025]进一步，所述样本来源于受试者的血液或组织。[0026]本发明的第二方面提供了一种用于预测肺腺癌患者对含铂双药化疗的敏感性或反应性的产品。[0027]进一步，所述产品包含检测样本中mirna标志物表达水平的试剂，所述mirna标志物为mir-4291、mir-449a、和/或mir-663。[0028]进一步，所述试剂选自：[0029]特异性识别所述mirna标志物的探针；或[0030]特异性扩增所述mirna标志物的引物。[0031]进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、或试纸。[0032]进一步，所述试剂盒中包含的特异性扩增所述mirna标志物的引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员熟知的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。[0033]在某些实施方案中，该试剂盒作为用于进行本发明的方法的单位推销、分销或销售。这类试剂盒可以包含区室化来紧密限制地容纳一个或多个容器手段(如小瓶、管等)的载体手段，每个容器手段包含将要在方法中使用的分开的组成部分之一。例如，容器手段之一可以包含进行可检测标或可以进行可检测标记的探针。这种探针可以是对包含基因表达特征的一个或多个基因的多核苷酸特异的多核苷酸。在试剂盒利用核酸杂交来检测靶核酸时，试剂盒还可以具有包含用于扩增靶核酸序列的一种或多种核酸的容器和/或包含报道手段的容器。[0034]进一步，试剂盒通常将包含上述容器和一个或多个其他容器，该其他容器包含商业和用户角度希望的物质，包括缓冲液、稀释液、滤器、针头、注射器和含有使用说明的包装说明书。容器上可以存在标签来指示该组合物的具体应用，且还可以指示体内或体外使用的方向，如上文所述的那些。试剂盒中的其他可选成分包括一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、其他试剂(如通过酶标记发生化学改变的底物)、表位修复溶液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照切片等。[0035]本发明的第三方面提供了一种用于提高肺腺癌患者对含铂双药化疗的敏感性或反应性的药物组合物。[0036]进一步，所述药物组合物包括降低mir-4291表达水平的试剂、降低mir-449a表达水平的试剂、和/或升高mir-663表达水平的试剂。[0037]进一步，所述药物组合物中还包括药学上可接受的载体和/或辅料。[0038]进一步，本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于：经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。[0039]进一步，本发明的药物组合物的施用途径不受限制，包括但不限于：静脉内、腹膜内、眼内、动脉内、肺内、口服、小泡内、肌肉内、气管内、皮下的、通过皮肤、通过胸膜、局部的、吸入、通过粘膜、皮肤、肠胃、关节内、心室内、直肠、阴道、颅骨内、尿道内、肝内、瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。[0040]进一步，本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。[0041]本发明的第四方面提供了mirna标志物mir-4291、mir-449a、和/或mir-663在构建预测肺腺癌患者对含铂双药化疗的敏感性或反应性的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统中的应用。[0042]进一步，所述计算模型以mirna标志物mir-4291、mir-449a、和/或mir-663的表达水平作为输入变量，通过生物信息学方法进行运算，输出肺腺癌患者对含铂双药化疗的敏感性或反应性。[0043]本发明的第五方面提供了一种预测肺腺癌患者对含铂双药化疗的敏感性或反应性的系统或装置；[0044]进一步，所述系统或装置包括：[0045](1)评估装置：包括控制单元和存储单元，用于预测评估肺腺癌患者对含铂双药化疗的敏感性或反应性；[0046](2)彼此通信连接的信息通信终端装置：用于提供关于来自肺腺癌患者的样本中mirna标志物mir-4291、mir-449a、和/或mir-663的表达水平的数据；[0047]所述评估装置的控制单元包括如下四个单元：[0048]1)数据接收单元：用于接收从所述信息通信终端设备传输的关于来自肺腺癌患者的样本中所述mirna标志物表达水平的数据；[0049]2)判别值计算单元：其基于对由所述数据接收单元接收的所述mirna标志物的表达水平以及存储在所述存储单元中的作为解释变量的所述mirna标志物的表达水平的判别来计算判别值；[0050]3)判别值基准评价单元：其基于由所述判别值计算单元计算的判别值，对所述肺腺癌患者对含铂双药化疗的敏感性或反应性进行评价；[0051]4)评估结果发送单元：其将由所述判别值基准评估单元获得的所述肺腺癌患者的预测评估结果发送到所述信息通信终端装置。[0052]为了进一步阐明本发明的内容，此处对本发明中涉及到的部分专业科学术语进行如下解释。[0053]在本发明的上下文中，术语“mirna标志物”，同“标志物”、“生物标志物”，是指患者表型的指示物，在本发明的具体实施方式中，是指对含铂双药化疗的敏感性或反应性的肺腺癌患者(有反应者)与对含铂双药化疗的无敏感性或反应性的肺腺癌患者(无反应者)之间差异表达的标志物，所述标志物包括但不限于：基因、蛋白质、小分子代谢物质、糖类、基于糖脂的分子等，优选地，所述标志物为mirna。[0054]在本发明的上下文中，术语“表达水平”，同“mirna标志物的表达水平”、“生物标志物的表达水平”，是指样本中本发明所述的mirna的表达水平。[0055]在本发明的上下文中，术语“样本”，同“样品”、“受试者样本”、“肺腺癌患者的样本”，是指获自或衍生自目标受试者(肺腺癌患者)的组合物，其包含有待例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定的细胞实体和/或其他分子实体。该样本可以获自受试者(肺腺癌患者)的血液和生物来源的其他流体样本及组织样本，如活检组织样本或从其衍生的组织培养物或细胞。组织样本的来源可以是实体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保藏的器官或组织样本、活检组织或吸出物；血液或任意血液组分；体液；来自个体妊娠或发育的任何时间的细胞；或血浆。术语“样本”包括在其获得后以任何方式处理过的生物样本，如经试剂处理、稳定化、或针对某些成分(如蛋白质或多核苷酸)富集、或包埋在用于切片目的的半固体或固体基质中。本发明中所述的样本包括但不限于：组织、全血、血液来源的细胞、血清、血浆、淋巴液、滑膜液、细胞提取物及其组合，优选地，所述样本为组织。[0056]在本发明的上下文中，术语“引物”，同“扩增引物”，是指包含5-100个核苷酸的核酸片段，优选地，所述引物或扩增引物包含能起始酶促反应(例如，酶促扩增反应)的15-30个核苷酸。[0057]在本发明的上下文中，术语“探针”，是指包括至少5个核苷酸的核酸序列，例如，包含5-100个核苷酸，所述探针能在指定条件下与目标基因的表达产物或者该表达产物的扩增产物杂交形成复合物。杂交探针上还可以包括用于检测的标记物。所述标记物包括但不限于用于荧光定量pcr或荧光原位杂交的标记物。[0058]在本发明的上下文中，术语“受试者工作特征曲线下面积(auc)”，是诊断规程的性能或精确性的一项指标。诊断方法的精确性由它的受试者工作特征(roc)描述得最好。roc图是源自在观察的整个数据范围上连续改变决策阈的所有灵敏度/特异性对的线图。在本发明的具体实施方式中，可根据受试者工作特征曲线下面积(auc)来评估本发明所述的mirna标志物对预测肺腺癌患者对含铂双药化疗的敏感性或反应性的诊断效能，其中，若auc＞0.6，则表明所述mirna标志物具有一定的诊断效能，可作为预测肺腺癌患者对含铂双药化疗的敏感性或反应性的标志物；若auc＞0.7，则表明所述mirna标志物具有相对较好的诊断效能，可作为预测肺腺癌患者对含铂双药化疗的敏感性或反应性的标志物；若auc＞0.8，则表明所述mirna标志物具有较好的诊断效能，可作为预测肺腺癌患者对含铂双药化疗的敏感性或反应性的标志物。[0059]在本发明的上下文中，术语“反应性”，是指患有、怀疑患有或倾向于患肺腺癌的患者/受试者显示对含铂双药化疗治疗方案的反应。技术人员依照本发明所述的方法会容易地确定采用含铂双药化疗的患者/受试者是否显示反应。[0060]在本发明的上下文中，术语“敏感性”，是指患有、怀疑患有或倾向于患肺腺癌的患者/受试者以某种方式对含铂双药化疗治疗方案显示阳性反应。本领域的技术人员依照本发明所述的方法会容易地确定采用含铂双药化疗治疗方案的患者/受试者是否显示反应。[0061]相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：[0062]本发明首次发现基因mir-4291、mir-449a、和/或mir-663联合可用于预测肺腺癌患者对含铂双药化疗的敏感性或反应性，准确性、敏感性、特异性、auc值均较高，可辅助临床医生判断受试者对含铂双药化疗的敏感性或反应性，进而筛选出对含铂双药化疗敏感的肺腺癌患者，以实现个体化治疗，本发明为临床上治疗肺腺癌提供了新策略和思路。附图说明[0063]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：[0064]图1显示mir-4291在对含铂双药化疗有反应组和对含铂双药化疗无反应组的肺腺癌患者之间差异表达的结果图；[0065]图2显示mir-449a在对含铂双药化疗有反应组和对含铂双药化疗无反应组的肺腺癌患者之间差异表达的结果图；[0066]图3显示mir-663在对含铂双药化疗有反应组和对含铂双药化疗无反应组的肺腺癌患者之间差异表达的结果图；[0067]图4显示mir-4291对预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的诊断效能的结果图；[0068]图5显示mir-449a对预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的诊断效能的结果图；[0069]图6显示mir-663对预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的诊断效能的结果图；[0070]图7显示mir-4291+mir-449a对预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的诊断效能的结果图；[0071]图8显示mir-4291+mir-663对预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的诊断效能的结果图；[0072]图9显示mir-449a+mir-663对预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的诊断效能的结果图；[0073]图10显示mir-4291+mir-449a+mir-663对预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的诊断效能的结果图。具体实施方式[0074]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，有必要指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练技术人员所熟悉的意义相同，此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。[0075]实施例1与肺腺癌对含铂双药化疗敏感性相关的基因筛选[0076]1、数据来源[0077]在经病理诊断为肺腺癌的患者接受含铂双药化疗之前，收集其肿瘤组织，根据肺腺癌是否对含铂双药化疗有反应，结合recist(实体瘤的疗效评价标准)指南将上述肺腺癌患者分为有反应组(r，responder)或无反应组(nr，non-responder)；所述肺腺癌患者在接受含铂双药化疗之前均未接受过铂类药物化疗；所述有反应组包括完全反应(cr，completeresponse)的肺腺癌患者和部分反应(pr，partialresponse)的肺腺癌患者，所述无反应组包括稳定性疾病(sd，stabledisease)和进行性疾病(pd，progressivedisease)；本研究的数据来源于gse56264，non-responder：responder＝24：16；[0078]进一步，在本研究中，所述肺腺癌患者接受的含铂双药化疗这一治疗方案包括卡铂+紫杉醇、顺铂+吉西他滨、顺铂+长春瑞滨、卡铂+吉西他滨；[0079]对比有反应组的肺腺癌患者和无反应组的肺腺癌患者之间差异表达的mirnas；使用r语言中的“limma”包进行差异表达分析，其中，差异表达基因的筛选标准为p.value《0.05，|log2fc|》1。[0080]2、实验结果[0081]结果显示，筛选得到的在有反应组和无反应组之间差异表达基因共43个，其中，mir-4291、mir-449a、mir-663在对含铂双药化疗有反应组和对含铂双药化疗无反应组的肺腺癌患者之间呈现显著性的差异表达，mir-4291、mir-449a、mir-663在有反应组中的表达趋势分别为下调、下调和上调(见图1-图3)，上述结果提示mir-4291、mir-449a、mir-663是预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的潜在生物标志物。[0082]实施例2筛选得到的差异表达基因在预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性中的应用[0083]1、实验方法[0084]对实施例1中筛选得到的在有反应组和无反应组之间差异表达的基因，使用r包“proc”(版本1.15.0)执行接收器工作特性(roc)分析，计算受试者工作特征曲线下面积(auc)以评估单个差异表达基因、任意两个差异表达基因联合、三个差异表达基因联合分别对预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的准确性，其中，所述auc值的范围是0-1；[0085]其中，在判断单个差异表达基因对预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的诊断效能时，直接采用单个差异表达基因的表达量进行分析，选择youden指数最大的一点对应的水平作为其cutoff值，auc在0.5《auc《0.8的差异表达的基因被用于联合分析；[0086]其中，在判断任意两个差异表达基因联合、三个差异表达基因联合对预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的诊断效能时，对各个差异表达基因的表达水平进行logistics回归分析，通过拟合出的回归曲线计算出每个肺腺癌个体对含铂双药化疗敏感的概率，确定不同的概率划分阈值，根据确定的概率划分阈值，计算得出任意两个差异表达基因联合、三个差异表达基因联合对预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的准确性、特异性以及灵敏度等。[0087]2、实验结果[0088]结果显示，基因联合mir-4291+mir-449a、mir-4291+mir-663、mir-449a+mir-663、mir-4291+mir-449a+mir-663对预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的诊断效能显著优于单个基因的诊断效能，利用上述基因联合预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的auc值均较高(见表1、图4-图10)，表明了上述基因mir-4291、mir-449a、和/或mir-663可用于临床上辅助医生判断肺腺癌患者对含铂双药化疗敏感性，具有非常好的临床应用前景。[0089]表1基因对预测肺腺癌对含铂双药化疗敏感性的诊断效能[0090]基因auc值mir-42910.701mir-449a0.690mir-6630.768mir-4291+mir-449a0.758mir-4291+mir-6630.872mir-449a+mir-6630.849mir-4291+mir-449a+mir-6630.911[0091]上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。当前第1页12当前第1页12