一株贝莱斯芽孢杆菌zh902及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌zh902及其应用。


背景技术：

2.黄酒酒曲中的微生物群落极其复杂，在传统黄酒的酿造过程中除了作为糖化发酵剂外，还是一种集生香、增味、成色等诸多功能的复合生化酶制剂，是传统液态发酵黄酒的重要风味保障。
3.对于新酿制出的黄酒酒香较为粗杂，生料味和霉杂味明显，香气冲而轻浮，而经过陈化后熟后，酒香则变得复合且浓郁，香气品质提升。根据《基于气相-离子迁移谱技术快速鉴定黄酒酒龄及品牌》等研究报道，黄酒中的多种酮类物质是陈化后香气的重要贡献物质，且随陈化时间增加而含量上升。通过提高黄酒中酮类物质，可以进一步提升黄酒香气品质。但是通过陈化来提升黄酒香气不仅周期长，同时受外界环境因素影响较大，质量可控性较低，难以满足消费者对产品品质的需求。而通过筛选增香菌种进行香气强化应用，则可以较好的改善这一问题。
4.专利文献《cn201310017836.8增香菌剂及其使用方法》和《cn201710827683.1一种多菌种强化大曲发酵酿造清香型白酒的生产方法》中从白酒企业自家白酒曲中，通过高温培养、平板筛选等方式筛选、富集出提香提味功能性菌株，再通过制曲、接种培养液等方式扩培，最后于生产投料过程中添加，从而提高白酒的香气及风味，但均是通过复合菌剂的方式发酵增香。
5.芽孢菌为细菌中常见的种属，对外界有害因子具有很强的抵抗能力，如：耐高温、耐射线等，分布很广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道中。据《一株酒曲耐高温芽孢菌的功能特性及产酯酶条件研究》、《黄酒熟麦曲中细菌多样性的评价》、《绍兴黄酒发酵中微生物群落结构及其对风味物质影响研究》等报道指出，白酒、黄酒酒曲中常见有芽孢菌存在，以其较优的淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶及酯化酶活力为酒曲贡献相应的酶系，进而保证了酒发酵的正常进行与风味的稳定，其代谢所产出的酸、酯、醛、酮等挥发性成分更是支撑了酒体香气的整体框架，决定着酒体的香气风格。根据《固相微萃取-气质联用法分析黄酒中挥发性成分》、《红曲黄酒传统酿造用曲的特征挥发性风味成分分析》等相关研究表明，黄酒中的挥发性成分主要为醇类、酯类、烃类、酚类、醛类、酮类，这些成分支撑起了黄酒的香气风格，其中酮类物质的嗅觉阈值较低，即使在黄酒中占比较少也具有较强的香气贡献。
6.因此本技术是通过从传统酒曲中进行芽孢类增香菌的筛选，通过对该类微生物应用来提高黄酒或其它应用产品的香气，提升产品品质。


技术实现要素：

7.本发明的发明人从黄酒酒曲中分离筛选出一株产香能力较强的贝莱斯芽孢杆菌，将该菌株制备成菌种曲，可应用于传统酿制工艺酒曲，提升黄酒的香味，使生产得的黄酒具有酯香和奶油香；也可用于米醋发酵工艺，提升米醋的香气品质，使生产所得的米醋具有一
定的奶油香气。
8.基于上述发现，本发明提供一株贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)zh902，其保藏编号为：gdmcc no：61836。
9.具体的菌株保藏信息如下：
10.保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心
11.保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼
12.保藏日期：2021年7月26日
13.保藏编号：gdmcc no：61836
14.本发明的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)zh902的菌落特征如下：在牛肉膏蛋白胨固态培养基上45℃培养48小时，菌落呈圆形，淡黄色不透明，表面光滑湿润，容易挑起，菌落质地均匀，边缘整齐。显微镜下呈杆型。
15.本发明还提供了一种由所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)zh902培养液制备的菌剂。
16.本发明还提供了一种含有所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)zh902的强化酒曲的制备方法，包括以下步骤：
17.s1将经灭菌的小麦粒与贝莱斯芽孢杆菌zh902制得的菌液混匀后进行培养，将所得培养产物烘干，制得一级种曲；
18.s2将蒸熟的小麦粒与一级种子曲混合拌匀，于曲池中培养，将所得培养物烘干，即制得二级种曲；
19.s3将二级种曲与小麦粒置于拌曲装置内，加入清水后，搅拌均匀，制得曲料；将曲料压成曲块；保持温度在30-40℃，培养7天；继续培养10-15天后干燥，即得所述强化酒曲。
20.优选地，所述s1的培养条件为30℃中培养72小时，烘干温度为40℃。
21.优选地，所述s2曲池中培养条件为30-35℃培养72h；烘干温度为40-45℃。
22.本发明还提供了所述强化酒曲在食品调味品酿造中的应用，优选地，所述食品调味品为黄酒或米醋。
23.本发明还提供了一种使用本发明贝莱斯芽孢杆菌zh902酿造黄酒的方法，具体步骤如下：
24.s1将经灭菌的小麦粒与贝莱斯芽孢杆菌zh902制得的菌液混匀后进行培养，将所得培养产物烘干，制得一级种曲；
25.s2将蒸熟的小麦粒与一级种子曲混合拌匀，于曲池中培养，将所得培养物烘干，即制得二级种曲；
26.s3将二级种曲与小麦粒置于拌曲装置内，加入清水后，搅拌均匀，制得曲料；将曲料压成曲块；保持温度在30-40℃，培养7天；继续培养10-15天后干燥，即得所述强化酒曲；
27.s4将所述强化酒曲按照黄酒酿造工艺进行发酵，制得强化酒曲黄酒。
28.采用本发明方法制得的黄酒具有独特的酯香、奶油香、奶香香气，较传统黄酒香气浓更为郁度，香味更为丰富。
29.本发明还提供了一种使用本发明贝莱斯芽孢杆菌zh902酿造米醋的方法，具体步骤如下：
30.s1将经灭菌的小麦粒与贝莱斯芽孢杆菌zh902制得的菌液混匀后进行培养，将所
得培养产物烘干，制得一级种曲；
31.s2将蒸熟的小麦粒与一级种子曲混合拌匀，于曲池中培养，将所得培养物烘干，即制得二级种曲；
32.s3将二级种曲与小麦粒置于拌曲装置内，加入清水后，搅拌均匀，制得曲料；将曲料压成曲块；保持温度在30-40℃，培养7天；继续培养10-15天后干燥，即得所述强化酒曲；
33.s4将所述强化酒曲按照米醋酿造工艺进行发酵，制得强化酒曲米醋。
34.采用本发明方法制得的米醋具有独特的奶油香、奶香香气，与传统米醋相比，其生醋味稍弱，香气浓更为郁度，香味更为丰富，口感较细腻，入口刺激性减弱，后味尚可，较持久。
35.本发明的有益效果为：本发明的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)zh902的培养液能生产出酯香、奶油香、奶香独特的香气，将其用于黄酒和米醋的酿造工艺，可使黄酒和米醋产生奶油香和酯香的香味。能提高黄酒与米醋中的酯类、醛类和酮类物质，起到掩盖黄酒中的生料味，降低醋酸的尖酸感的作用，提升黄酒与米醋的品质。
附图说明
36.图1为本发明筛选贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)zh902的流程图；
37.图2为划线分离的菌落形态照片；
38.图3为划线分离镜检形态示意图；
39.图4为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)zh902强化酒曲制曲工艺流程图；
40.图5为使用本发明贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)zh902强化酒曲进行黄酒酿造和米醋酿造的工艺流程图；
41.图6为本领域常规黄酒酿造工艺流程图；
42.图7为本领域常规米醋酿造工艺流程图。
具体实施方式
43.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
44.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
45.除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规食品级试剂、方法和设备。
46.除非特别说明，本发明实施例所用试验条件为本领域常规试验条件。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。
47.实施例1贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)zh902的分离筛选
48.1.材料准备：
49.酒曲：传统黄酒麦曲
50.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基
51.培养条件：45℃，48h
52.2.菌株分离纯化：
53.取1g酒曲加至10ml生理盐水中，用生理盐水稀释至适当浓度，取0.5ml于培养基上涂布，45℃培养48h，再从该培养基中选取菌落形态符合芽孢菌形态的菌落，用接种环在新培养基上进行划线分离，45℃培养48小时，其中单独的菌落即为纯种芽孢菌株。划线分离的菌落形态如图2所示，镜检图如图3所示。
54.3.菌种液扩培：用接种环取纯化所得的多个芽孢单菌落，以牛肉膏蛋白胨培养液进行扩培，培养条件为45℃、48h，得多个单菌落芽孢菌液，菌落总数达108cfu/ml。
55.4.风味筛选：对多个单菌落芽孢菌液进行香气鉴评，根据结果优选出产香能力最优的菌株，筛选结果如表1所示。在分离的5株芽孢菌中，其中标记为4#的菌株其产出的香气为酯香、奶油香、奶香，香气愉悦度较优，且香气浓郁，综合评分最高，因此选择该菌株作为产香功能菌株。
56.表1菌株香气筛选结果
[0057][0058]
5.菌种鉴定：将标记为4#的芽孢菌株送检进行基因测序，其鉴定结果如表2所示，该鉴定结果表明4#芽孢菌株与bacillus velezensis最为接近，因此，将其鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，且命名为zh902。
[0059]
表2菌株基因测序鉴定结果
[0060][0061][0062]
本发明人已将该芽孢杆菌株zh902已于2021年7月26日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmcc no:61836。
[0063]
实施例2
[0064]
本实施例提供一种使用贝莱斯芽孢杆菌zh902酿造黄酒的方法，具体步骤如下(图5)：
[0065]
1.制备一级种曲：取一定量小麦，用轧麦机轧成小麦粒，过2mm筛除去颗粒过小的面粉和麸皮；于三角瓶中称取50g小麦粒，按1:0.2的比例加水，用高压蒸汽灭菌，压力为0.1mpa，时间为30min。待冷却后加入0.5ml由贝莱斯芽孢杆菌zh902制得的菌液，充分摇匀后，置于30℃中培养72小时，再于40℃下烘干，即制得一级种曲。
[0066]
2.制备二级种曲：取一定量小麦粒，于连续蒸煮设备上蒸煮60-75min，蒸煮过程中持续喷淋水以保证麦粒煮熟，熟麦粒冷却后按10g/kg的量加入一级种子曲，拌匀，于曲池中30-35℃培养72小试，再升温至40-45℃通风烘干，即制得二级种曲。
[0067]
3、制备贝莱斯芽孢杆菌zh902强化酒曲：a轧碎：用轧麦机将小麦轧成小麦粒，过2mm筛除去颗粒过小的面粉和麸皮；b拌曲：按10g/kg的量加入二级种曲与小麦粒于拌曲机内，再加入20％-30％清水，搅拌均匀；c成型：使用麦曲压块机将曲料压成曲块；d堆曲：在曲室中将块曲整齐堆砌好；e保温培养：保持曲室温度在30-40℃，培养7天；f干燥：保持曲室通风，继续培养10-15天后完成干燥，即得所述强化酒曲(图4)。
[0068]
4、强化酒曲黄酒发酵：将上述所述强化酒曲按照本领域常规黄酒酿造工艺(图6)进行发酵，制得强化酒曲黄酒。
[0069]
效果验证一：
[0070]
本实验中以使用传统黄酒酒曲作为黄酒发酵用酒曲，按照黄酒酿造工艺(图6)进行发酵制得的黄酒作为对照，并将由两种不同酒曲酿造的黄酒进行鉴定评价，鉴评结果如表3所示：
[0071]
表3黄酒酒样风味鉴评结果
[0072][0073]
从鉴评结果表明，应用贝莱斯芽孢杆菌zh902强化酒曲酿造的黄酒优于对照的传统黄酒酒曲，其中香气差异显著，强化酒曲黄酒含有酯香与奶油香气，香气浓郁度与丰富度均优于传统酒曲黄酒。
[0074]
效果验证二：分别对传统酒曲黄酒和强化酒曲黄酒的理化指标进行分析，结果如表4所示，结果表明，强化酒曲黄酒相比传统酒曲黄酒，理化指标差异较小。
[0075]
表4两种黄酒的理化指标对比
[0076][0077]
使用gc-ms分析二者的挥发性成分，结果如表5所示，结果表明，强化酒曲黄酒相比传统酒曲黄酒，挥发性成分中酯类、醛类和酮类物质总含量都有所提高；酮类物质总含量更是提升了53％，其中2-丁酮、仲辛酮、2-庚酮含量最高，其含量分别提高了85％、72％、68％，分别呈现为奶酪香、花香、奶油香，这也明确了本发明黄酒中的香气呈现奶油香气的物质基础，赋予了黄酒奶油香气和部分酯香，掩盖了黄酒中生料味，提升了黄酒的香气品质。
[0078]
表5强化酒曲黄酒挥发性成分对比
[0079]
[0080]
综上所述，表明采用本发明贝莱斯芽孢杆菌zh902进行黄酒酿造，可赋予黄酒独有的酯香和奶油香香气，丰富黄酒的香气，有效提升黄酒香气品质，同时，不仅可作为黄酒香气减弱的解决方式，还可生产出具特殊香气的黄酒基础酒，用于搭配勾调高端黄酒。
[0081]
实施例3
[0082]
本实施例提供一种使用贝莱斯芽孢杆菌zh902酿造米醋的方法，具体步骤如下(图5)：
[0083]
1.制备一级种曲：取一定量小麦，用轧麦机轧成小麦粒，过2mm筛除去颗粒过小的面粉和麸皮；于三角瓶中称取50g小麦粒，按1:0.2的比例加水，用高压蒸汽灭菌，压力为0.1mpa，时间为30min。待冷却后加入0.5ml由贝莱斯芽孢杆菌zh902制得的菌液，充分摇匀后，置于30℃中培养72小时，再于40℃下烘干，即制得一级种曲。
[0084]
2.制备二级种曲：取一定量小麦粒，于连续蒸煮设备上蒸煮60-75min，蒸煮过程中持续喷淋水以保证麦粒煮熟，熟麦粒冷却后按10g/kg的量加入一级种子曲，拌匀，于曲池中30-35℃培养72小试，再升温至40-45℃通风烘干，即制得二级种曲。
[0085]
3、制备贝莱斯芽孢杆菌zh902强化酒曲：a轧碎：用轧麦机将小麦轧成小麦粒，过2mm筛除去颗粒过小的面粉和麸皮；b拌曲：按10g/kg的量加入二级种曲与小麦粒于拌曲机内，再加入20％-30％清水，搅拌均匀；c型：使用麦曲压块机将曲料压成曲块；d堆曲：在曲室中将块曲整齐堆砌好；e保温培养：保持曲室温度在30-40℃，培养7天；f干燥：保持曲室通风，继续培养10-15天后完成干燥，即得所述强化酒曲(图4)。
[0086]
4、强化酒曲米醋发酵：将上述所述强化酒曲按照本领域常规米醋酿造工艺(图7)进行发酵，制得强化酒曲米醋。
[0087]
效果验证一：
[0088]
本实验中以使用传统黄酒酒曲作为米醋发酵用酒曲，按照米醋酿造工艺(图7)进行发酵制得的米醋作为对照，并将由两种不同酒曲酿造的米醋进行鉴定评价，鉴评结果如表6所示：
[0089]
表6强化酒曲米醋风味鉴评结果
[0090][0091]
从鉴评结果表明，应用贝莱斯芽孢杆菌zh902强化酒曲酿造的米醋优于对照的传
统黄酒酒曲的，香气和口感差异均有较显著提升，强化酒曲米醋具有一定的奶油香气，香气浓郁度与丰富度均优于传统酒曲米醋；口感上，强化酒曲米醋较为柔和，且细腻而余维持久，没有传统酒曲米醋的尖酸刺激感。
[0092]
效果验证二：分别对传统酒曲米醋和强化酒曲米醋的理化指标进行分析，结果如表7所示，结果表明，强化酒曲米醋相比传统酒曲米醋，总酸和ph值变化较小，不挥发酸含量提升了15％；而米醋中的不挥发酸可以使其酸味变得柔和且持久，降低醋酸的尖酸感，这就是米醋产品风味较为柔和、后味持久的原因，所以本发明的强化酒曲米醋的风味较为柔和，没有醋酸的尖酸感。
[0093]
表7强化酒曲米醋理化指标对比
[0094][0095]
使用gc-ms分析二者的挥发性成分，结果如表8所示，酯类、醛类、酮类物质含量均有提升，其中酮类物质总含量提升了35％，其中2,3-丁二酮、3-乙酰基-2-丁酮、2-庚酮含量最高，其含量分别提高了48％、38％、25％，分别呈现为奶油香、牛奶香、水果香，这些物质赋予了米醋奶油香气，使米醋的香气变得丰富，减少了生醋的气味，提升了米醋的香气品质。
[0096]
表8强化酒曲米醋挥发性成分对比
[0097][0098]
综上所述，表明使用本发明贝莱斯芽孢杆菌zh902进行米醋发酵，可赋予米醋具有米醋奶油香气，丰富了米醋的香气，有效提升了米醋品质。
[0099]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。