一种冻存脐带血来源的nk细胞及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及血液制品技术领域，具体为一种冻存脐带血来源的nk细胞及其制备方法和应用。


背景技术：

2.nk细胞是具有自然杀伤功能的天然免疫效应细胞，主要在骨髓微环境中分化、发育，分布于骨髓、外周血、肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结。nk细胞不需要特异性抗原刺激，可通过表面受体对“自身”及“非己”进行识别，直接杀伤肿瘤细胞和被病毒感染的靶细胞，是机体对抗病原体和肿瘤细胞的第一道防线。
3.nk细胞无hla限制性，有研究表明，hla半相合细胞具有更强的杀瘤作用。所以，异体nk细胞的培养具有极高的临床价值。相比较于外周血，脐带血取材方便，伤害性小，污染概率低，是最佳的nk细胞制备材料。但脐带血应用范围较广，储存初期应用方向不太确定，所以会先进行冻存处理。
4.目前，冻存脐带血复苏后诱导的nk细胞数量、纯度及活性均不能满足临床应用需求，存在很大的上升空间。


技术实现要素：

5.针对相关技术中的问题，本发明提出的一种冻存脐带血来源的nk细胞及其制备方法和应用，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题，本发明的目的是解决传统的冻存脐带血复苏后诱导的nk细胞数量、纯度及活性均不能满足临床应用需求的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，第一方面，本发明提供一种冻存脐带血来源的nk细胞的制备方法，包括以下步骤，步骤一：将冻存脐带血迅速转移至已预热过的37℃水浴锅内进行溶解复苏；步骤二：将复苏后的脐带血转移至250ml离心瓶内，加入配制好的含保护剂的洗涤液定容至200ml，1200rpm 5min 离心，洗涤，以去除其中冻存液成分；步骤三：离心后弃掉上清，下层细胞加入含保护剂的洗涤液混匀，之后将其按体积比2:1比例缓慢加入预先装有ficoll的离心管内，2000rpm，20min，升2降1进行离心，以提取单个核细胞；步骤四：吸取中间白膜层，加入含有保护剂的洗涤液，1500 rpm，8min，离心，洗涤2-3次，以获得较为纯净的脐血单个核细胞；步骤五：使用nk细胞基础培养基将上述单个核细胞调浓度整至2-4
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106/ml浓度，加入体积分数为4-8%的自体或异体血浆、150-250iu/ml il-2及滋养层细胞，进行nk细胞诱导培养，记为d0；步骤六：d3天经1500 rpm，8min，离心，洗涤2-3次，去除原有培养基，重新按照使用d0同等条件进行换液；步骤七：d4-d7天，每天添加nk细胞基础培养基进行补液，调整细胞浓度为0.8-2
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106/ml，并加入体积分数为4-8%的自体或异体血浆、150-250iu/ml il-2，进行nk细胞诱导；步骤八：d8天添加nk细胞基础培养基进行补液，调整细胞浓度为0.8-2
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106/ml，并加入体积分数为1-3的自体或异体血浆、150-250iu/ml il-2及滋养层a2细胞，进行nk细胞诱导扩增；步骤九：d9-d13天，每天添加nk细胞基础培养基进行补液，调整细胞浓度为0.8-2
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106/ml，并加入体积分数为1-3%的自体或异体血浆、150-250iu/ml、il-2，继续进行nk细胞诱导扩增；步骤十：d14天收取细胞，计数，检测。
7.优选的，所述nk细胞来源于冻存脐带血，所述冻存脐带血为液氮保存时间20年以内的冻存脐带血。
8.优选的，所述含保护剂的洗涤液包括pbs缓冲液、人血白蛋白、右旋糖酐、海藻糖。
9.优选的，所述单个核细胞浓度为3
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106/ml。
10.优选的，所述d0-d7天加入自体或异体血浆浓度为7%。
11.优选的，所述d8-d13天加入自体或异体血浆浓度为2%。
12.优选的，所述il-2加入浓度为200iu/ml。
13.优选的，所述d4-d13天调整细胞浓度为1.5
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106/ml。
14.第二方面，本发明提供一种冻存脐带血来源的nk细胞，所述nk细胞由第一方面所述的制备方法制备得到。
15.第三方面，本发明提供第一方面所述的nk细胞制备中，含保护剂的洗涤液，包括组成成分：pbs缓冲液、人血白蛋白、右旋糖酐、海藻糖；人血白蛋白添加的体积分数为6%；右旋糖酐添加的体积分数为10%；海藻糖添加的质量体积分数为9%；主体试剂成分为pbs缓冲液。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1）本发明为一种冻存脐带血来源的nk细胞及其制备方法和应用，本发明中的nk细胞来源为冻存脐带血，诱导所得nk细胞数量可达3
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109以上、活性可达90%以上，纯度可达80%以上，所有指标均可满足市场应用需求；（2）本发明为一种冻存脐带血来源的nk细胞及其制备方法和应用，本发明使用的冻存脐带血，与新鲜血液相比较，有充足的时间进行病原体检测，降低了污染风险，提高了细胞的安全性；（3）本发明为一种冻存脐带血来源的nk细胞及其制备方法和应用，本发明加入的保护剂成分均为临床可用试剂，进一步保证了nk细胞的安全性；（4）本发明为一种冻存脐带血来源的nk细胞及其制备方法和应用，本发明的制备方法步骤简单，可操作性强，技术成本低，可以进行大规模临床应用。
附图说明
17.图1为本发明的实施例1的流式检测结果图；图2为本发明的实施例2的流式检测结果图；
图3为本发明的实施例3的流式检测结果图；图4为本发明的nk细胞对k562细胞杀伤活力检测图。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
19.实施例一一种冻存脐带血来源的nk细胞的制备方法，包括以下步骤，1、取血液样品：确保血液为液氮保存20年以内的冻存脐带血；2、nk细胞的制备，步骤一：将冻存脐带血迅速转移至已预热过的37℃水浴锅内进行溶解复苏；步骤二：将复苏后的人脐带血转移至250ml离心瓶内，加入配制好的含保护剂的洗涤液定容至200ml，1200rpm 5min 离心，洗涤，以去除其中冻存液成分；步骤三：离心后弃掉上清，下层细胞加入含保护剂的洗涤液混匀，之后将其按体积比2:1比例缓慢加入预先装有ficoll的离心管内，2000rpm，20min，升2降1进行离心，以提取单个核细胞；步骤四：吸取中间白膜层，加入含有保护剂的洗涤液，1500 rpm，8min，离心，洗涤2-3次，以获得较为纯净的脐血单个核细胞；步骤五：使用nk细胞基础培养基将上述细胞调浓度整至2
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106/ml浓度，加入体积分数为4%的自体或异体血浆、150iu/ml il-2及滋养层细胞，进行nk细胞诱导培养，记为d0；步骤六：d3经1500 rpm，8min，离心，洗涤2-3次，去除原有培养基，重新按照使用d0同等条件进行换液；步骤七：d4-d7天，每天添加nk细胞基础培养基进行补液，调整细胞浓度为0.8
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106/ml，并加入体积分数为4%的自体或异体血浆、150iu/ml il-2，进行nk细胞诱导；步骤八：d8天添加nk细胞基础培养基进行补液，调整细胞浓度为0.8
×
106/ml，并加入体积分数为1%的自体或异体血浆、150iu/ml il-2及滋养层a2细胞，进行nk细胞诱导扩增；步骤九：d9-d13天，每天添加nk细胞基础培养基进行补液，调整细胞浓度为0.8
×
106/ml，并加入体积分数为1%的自体或异体血浆、150iu/ml il-2，继续进行nk细胞诱导扩增；步骤十：d14天收取细胞，计数，检测；步骤十一：取nk细胞与k562细胞混合培养，使用cck-8试剂盒检测体外杀瘤效果。
20.实施例二一种冻存脐带血来源的nk细胞的制备方法，包括以下步骤，1、取血液样品：确保血液为液氮保存20年以内的冻存脐带血；2、nk细胞的制备，步骤一：将冻存脐带血迅速转移至已预热过的37℃水浴锅内进行溶解复苏；
步骤二：将复苏后的人脐带血转移至250ml离心瓶内，加入配制好的含保护剂的洗涤液定容至200ml，1200rpm 5min 离心，洗涤，以去除其中冻存液成分；步骤三：离心后弃掉上清，下层细胞加入含保护剂的洗涤液混匀，之后将其按体积比2:1比例缓慢加入预先装有ficoll的离心管内，2000rpm，20min，升2降1进行离心，以提取单个核细胞；步骤四：吸取中间白膜层，加入含有保护剂的洗涤液，1500 rpm，8min，离心，洗涤2-3次，以获得较为纯净的脐血单个核细胞；步骤五：使用nk细胞基础培养基将上述细胞调浓度整至3
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106/ml浓度，加入体积分数为7%的自体或异体血浆、200iu/ml il-2及滋养层细胞，进行nk细胞诱导培养，记为d0；步骤六：d3经1500 rpm，8min，离心，洗涤2-3次，去除原有培养基，重新按照使用d0同等条件进行换液；步骤七：d4-d7天，每天添加nk细胞基础培养基进行补液，调整细胞浓度为1.5
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106/ml，并加入体积分数为7%的自体或异体血浆、200iu/ml il-2，进行nk细胞诱导；步骤八：d8天添加nk细胞基础培养基进行补液，调整细胞浓度为1.5
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106/ml，并加入体积分数为2%的自体或异体血浆、200iu/ml il-2及滋养层a2细胞，进行nk细胞诱导扩增；步骤九：d9-d13天，每天添加nk细胞基础培养基进行补液，调整细胞浓度为1.5
×
106/ml，并加入体积分数为2%的自体或异体血浆、200iu/ml il-2，继续进行nk细胞诱导扩增；步骤十：d14天收取细胞，计数，检测；步骤十一：取nk细胞与k562细胞混合培养，使用cck-8试剂盒检测体外杀瘤效果。
21.实施例三一种冻存脐带血来源的nk细胞的制备方法，包括以下步骤，1、取血液样品：确保血液为液氮保存20年以内的冻存脐带血；2、nk细胞的制备，步骤一：将冻存脐带血迅速转移至已预热过的37℃水浴锅内进行溶解复苏；步骤二：将复苏后的人脐带血转移至250ml离心瓶内，加入配制好的含保护剂的洗涤液定容至200ml，1200rpm 5min 离心，洗涤，以去除其中冻存液成分；步骤三：离心后弃掉上清，下层细胞加入含保护剂的洗涤液混匀，之后将其按体积比2:1比例缓慢加入预先装有ficoll的离心管内，2000rpm，20min，升2降1进行离心，以提取单个核细胞；步骤四：吸取中间白膜层，加入含有保护剂的洗涤液，1500 rpm，8min，离心，洗涤2-3次，以获得较为纯净的脐血单个核细胞；步骤五：使用nk细胞基础培养基将上述细胞调浓度整至4
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106/ml浓度，加入体积分数为8%的自体或异体血浆、250iu/ml il-2及滋养层细胞，进行nk细胞诱导培养，记为d0；步骤六：d3经1500 rpm，8min，离心，洗涤2-3次，去除原有培养基，重新按照使用d0同等条件进行换液；步骤七：d4-d7天，每天添加nk细胞基础培养基进行补液，调整细胞浓度为2
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106/ml，并加入体积分数为8%的自体或异体血浆、250iu/ml il-2，进行nk细胞诱导；
步骤八：d8天添加nk细胞基础培养基进行补液，调整细胞浓度为2
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106/ml，并加入体积分数为3%的自体或异体血浆、250iu/mlil-2及滋养层a2细胞，进行nk细胞诱导扩增；步骤九：d9-d13天，每天添加nk细胞基础培养基进行补液，调整细胞浓度为2
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106/ml，并加入体积分数为3%的自体或异体血浆、250iu/mlil-2，继续进行nk细胞诱导扩增；步骤十：d14天收取细胞，计数，检测；步骤十一：取nk细胞与k562细胞混合培养，使用cck-8试剂盒检测体外杀瘤效果。
22.实验结果（1）nk细胞数量：收获诱导培养14天的nk细胞，计算细胞数量，结果见表1。
23.表1nk细胞数量由表1可以看出，在文中所述复苏诱导条件下，nk细胞数量均在10的9次方以上，扩增倍数约为50-70倍，可以满足临床应用需求。
24.（2）nk细胞纯度：收获诱导培养14天nk细胞，流式检测细胞纯度，数据结果见表2；流式检测结果见图1-图3。
25.表2nk细胞纯度由表2可以看出，在文中所述复苏诱导条件下，nk细胞纯度均在80%以上，可以满足临床应用需求。
26.（3）nk细胞活率：收获诱导培养14天nk细胞，检测细胞活率，结果见表3。
27.表3nk细胞活率组别实施例1实施例2实施例3nk细胞活率94%99%99%由表3可以看出，在文中所述复苏诱导条件下，nk细胞活率均在90%以上，可以满足临床应用需求。
28.（4）nk细胞冻存前后对k562细胞杀伤活力检测：选上述实施例nk细胞，分别使用基础培养基重悬至1
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106/ml，备用；选取k562细胞作为靶细胞，用基础培养基重悬至5
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104/ml，备用；在96孔板内，分别按照效靶比为5:1、10:1、20:1的比例加入nk细胞及k562细胞，控制总体积为200ul，之后放入37℃，5%co2条件培养箱内进行培养；杀伤率计算公式：nk细胞杀伤率=[1-（实验细胞孔a值-效应细胞孔a值）/靶细胞孔a值]
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100%。
[0029]
24h之后，加入cck-8试剂，培养箱内放置2-4h后使用酶标仪进行检测，具体结果见图4。
[0030]
由图4可看出，此方法诱导的nk细胞对k562的杀伤率均保持在70%以上，具有明显的杀伤效果。
[0031]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。