1.本发明提供一种促进造血干细胞移植后造血恢复的方法。更具体地说，本发明涉及一种用雌激素增强造血干细胞活性的方法。


背景技术：

2.造血干细胞(hsc)是成年哺乳动物骨髓中的一种罕见细胞群，位居祖细胞级链顶端，这些祖细胞逐渐演变成局限于几个或单个血细胞谱系。hsc能够自我更新(产生更多造血干细胞)并具有多能分化为所有血细胞谱系的能力(orkin和zon，2008)。hsc对于维持所有血细胞的终身生产至关重要。hsc受到高度调控，通过静息、自我更新和分化之间的微妙平衡来维持体内平衡。尽管hsc很少分裂，它们会响应骨髓损伤而激活自我更新，由此重建体内平衡(wilson等，2008)。
3.造血干细胞移植(hsct)是目前最常用的细胞治疗方法。hsct是多种危及生命的疾病例如白血病、罕见血细胞疾病、再生障碍性贫血等的推荐疗法，并且被推荐用于清髓性化疗或放疗后恢复造血系统。全世界迄今已进行了超过100万例hsct。hsc负责终身的血细胞生产。hsc的自我更新、多能性等特点确保了hsct的成功。hsct的主要瓶颈是hsc供体不足以及输注供体hsc数量不足导致的hsct失败。为了解决这些问题，人们提出了各种不同的方法，例如利用不同的hsc来源(骨髓、脐血、动员外周血、羊水或胎盘脐带)，从胚胎细胞产生可移植的hsc，以及离体(ex vivo)扩增hsc。此外，对如何令有限数量hsc的植入(engraftment，移植成活率)最大化进行了广泛的研究；对不同的hsct调节剂—无论是辅助细胞还是特定的调节剂分子—进行研究以增强低量供体hsc的造血重建。
[0004]“雌激素”用来指来源于胆固醇的一组雌性性激素，包括多种化合物：雌酮(e1)、17β-雌二醇(e2，通常缩写为β-雌二醇或简称为雌二醇)、雌三醇(e3)，还包括妊娠期产生的仅由胎肝表达的称为雌四醇的雌激素(e4：亦称15α-羟基雌三醇)(相关综述可见holinka等，2008，摘要可见：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/s0960076008000794)。雌激素是主要的雌性性激素，负责调控许多细胞过程，包括生殖系统的生长、分化和功能。雌激素通过基因组(核启动的类固醇信号传导)和非基因组(膜启动的类固醇信号传导)信号通路发挥作用。此外，基因组和非基因组信号传导都可以从雌激素与雌激素受体α(esrα)或esrβ的相互作用开始。因此，雌激素对细胞过程的调控可遵循不同的机制，并可得到不同的反应。
[0005]
最近，有记载称1β-雌二醇(e2)和雌四醇(e4)信号传导主要通过与esrα的相互作用发生，尽管雌四醇调控不依赖于非基因组信号传导(abot等，2014)。更具体地说，根据abot等所述(abot等，2014)，与β-雌二醇不同，雌四醇表现出独特的esrα调节模式，因为雌四醇不能触发esrα介导的作用于细胞膜的细胞反应，但它能够触发雌激素共有的其他反应，这些反应似乎与雌四醇的核活性相关。此外，雌四醇可以作为弱雌激素拮抗雌二醇依赖性乳腺增生(gerard等，2015)，这是其临床应用的一个重要考虑因素。此外，e4对esrα的亲和力高于对esrβ的亲和力，这与其他雌激素不同。此外，体内e4半衰期比其他雌激素长得
多，这弥补了它作为雌激素的低效力。e4的另一个特点是不被性激素结合球蛋白(shbg)结合，这与大多数已知雌激素不同，e4血清水平代表生物活性，与shbg水平无关。最后，e4的另一个重要优点是不太依赖微粒体肝酶的调节，并且对与其他药物相互作用相对不敏感(coelingh-bennink，holinka和diczfalusy，2008)。
[0006]
最近有证据表明，雌激素参与调节造血干细胞的增殖和谱系定向(heo人，2015)。然而，雌激素在hsc自我更新和多能性调控中的作用尚待明确。关于雌激素对hsc影响的研究很少，有时甚至相互矛盾，这些研究主要是用β-雌二醇进行的，但人们普遍认为适用于其他雌激素，尽管事实上从未用雌四醇进行过造血祖细胞或造血细胞相关的研究。因此，人们认为，总体上，雌激素处置能够特异性增加小鼠的血管hsc数量但不能增加骨内hsc数量；然而，雌激素限制hsc的长期再增殖能力(illing等，2012)。具体地说，illing等记载了这样的实验，其中，给小鼠皮下或腹腔注射雌二醇。该篇论文记载了多项发现，其中提到雌二醇增加骨髓血管分部(compartment)中的祖细胞(hsc)数量但不增加骨髓骨内分部中的祖细胞(hsc)数量，erα敲除小鼠没有骨量增加时也有这一效应，这表明雌二醇诱导的hsc数量增加不依赖于雌二醇的对骨效应。另据记载，hsc数量增加(能够在受到致命辐射的小鼠中实现重建的造血祖细胞增加)是通过增强细胞周期进入而增加的，因此，移植了不同稀释度的经雌二醇处理动物的bm细胞的小鼠4个月后的重建优于移植对照处理的bm细胞的小鼠，但是雌二醇处理也导致连续移植后长期重建效能降低。此外，illing等也记载了雌二醇治疗增强造血干细胞在骨髓血管生态龛(niche)中的滞留。
[0007]
此外，雌激素还在雌性中促进hsc和多能祖细胞(mpp)的细胞周期，增加红系分化。据报道(notta等，2010)，雌性nod/scid/il-2rg
c-null(nsg)小鼠在单一人hsc植入和检测方面远胜于与之对等的雄性小鼠。该篇论文还评论说，雌性nsg受主似乎更支持人hsc的自我更新。notta及其同事提出了两个理由来解释所获得的结果：或者是雌性nsg小鼠可能比雄性更缺乏免疫力，或者是性相关因子例如类固醇激素会积极或消极调节人类hsc，但没有明确描述怎样的情况下会发生积极或消极调节。鉴于他们的结果，notta及其同事建议在未来需要人类hsc检测的实验设计中对性别进行密切关注。
[0008]
雌性中观察到的雌激素对hsc细胞周期促进和红系分化的增强被认为是雌激素受体α(esrα)介导的可在妊娠期间检测到的作用于hsc的效应(nakada等，2014)。相反，它莫西芬(tamoxifen)(其活性代谢物4-羟基三苯氧胺有雌激素受体拮抗剂的作用)减少mpp和短效hsc的数量，但激活长效hsc的增殖(sanchez-aguilera等，2014)。另有研究雌二醇对雄性动物模型(小鼠)影响的报道，这些模型具有雌激素受体α基因表达能力的不同组合(er-/-：erα敲除，er
+/+
：野生型，以及辐射嵌合：非造血或造血元素或两者中erα阳性或阴性)(thurmond等，2000年)。如下获得骨髓嵌合体：照射c57bl/6(ly5.1)和129/sv x c57bl/6n(ly5.2)er
+/+
或er-/-小鼠，并给予经照射小鼠来自ly5.1、ly5.2 er
+/+
或ly5.2 er-/-小鼠的骨髓细胞，即：给予的骨髓细胞仍是小鼠细胞。er-/-：er
+/+
：或erα嵌合小鼠接受单次最小剂量的皮下注射雌二醇来对免疫系统产生影响，在骨髓细胞给药的4周后对嵌合小鼠进行这一注射。雌二醇给药后10天观察效果。在全部至少含有er
+
元素的动物中，观察到雌二醇给药后总骨髓细胞减少，而雌二醇治疗的er-/-和er全阴性嵌合动物即er-/-动物和造血和非造血分部均为er-/-的嵌合动物都未发生骨髓细胞数量明显减少。这表明骨髓细胞的减少可能与先前报道的小鼠服用雌激素后上调成骨细胞活性并继而增加骨密度的能力有关。
[0009]
此外，雌激素能够通过作用于骨形成及其间充质干细胞(msc)间接调控hsc。然而，这种激素家族介导的调节可能更为间接。雌激素(β-雌二醇)处置被认为激活msc成骨分化和来自这些msc的gm-csf和il6分泌，所有这些都通过调节它们的生态龛(niche)来增加hsc的数量(qiu_zhao)。然而，如上文所述，雌激素通过msc调节造血祖细胞的作用存在争议(illing等，2012)。
[0010]
此外，脐血中造血祖细胞的出现频率被与不同激素和生长因子的水平相关联，其中包括雌三醇(savarese等，2007)。
[0011]
欧洲专利申请ep-2049129-a1将雌激素描述为能够改善hsc移植的物质，因为它们与骨髓细胞因子(例如gm-csf、g-csf和il-3)或儿茶酚胺受体本身的表达载体一起被列为能够上调儿茶酚胺受体表达的物质的例子，将其与儿茶酚胺类神经递质直接调节造血祖细胞的增殖和迁移这一事实相关联，这些在移植治疗中具有重要意义。然而，没有述及这些效应是仅限于雌二醇还是可见于任何其他雌激素，也没有实验证明任何雌激素都确实有这样的效应。
[0012]
美国专利申请公开us 2018/163177 a1记载了一种用于造血干细胞(hsc)扩增的无血清培养基，其包括基础培养基、细胞因子、脐带间充质干细胞条件培养基(或msc饲养细胞)和补充成分，所述补充成分可包括维生素c，维生素e和雌二醇(e2)。细胞(来源于脐带血)培养12天。分析显示(参见us 2018/163177图6)，添加雌二醇(e2)、维生素c和维生素e增加cd34+细胞(造血祖细胞相关标志)扩增和集落形成单位。
[0013]
尽管有这些证据，不同雌激素在造血祖细胞调控中的全面作用及其潜在机制尚不清楚。因此，全面研究雌激素在hsc调节中的作用对于开发这些激素的临床应用潜力至关重要。尤其是，需要进一步了解每种雌激素(特别是β-雌二醇和雌四醇)对造血干细胞的活性以及使用它们来可控地增加造血干细胞数量的可能性和/或它们在已经是造血干细胞移植对象的个体中改善造血重建的适用性，从而确定是否能够提供它们以上目的的临床应用并知晓这样做的适宜条件，尤其是在有某种偏好的情形中，例如偏好增强产生特定细胞系的能力。因此，应当明确雌激素是否可用来增强造血恢复，可用于此目的的雌激素以及使用的条件。
[0014]
本发明为所述问题提供了解决方案。
[0015]
发明概述
[0016]
本发明涉及用雌激素特别是雌四醇处置来增强造血干细胞移植(hsct)的恢复。
[0017]
第一方面的内容中，本发明涉及用于增强对象造血干细胞移植(hsct)或造血祖细胞移植后造血重建的雌激素，其中，将雌激素给予作为移植受主的对象(即移植细胞的接受者)，所述雌激素是雌四醇。优选系统性给予所述雌激素。并且优选在对象接受造血干细胞或祖细胞干细胞移植之后给予对象雌激素(雌四醇)。
[0018]
第二方面内容中，本发明涉及一种增加培养物中造血祖细胞和/或造血干细胞数量的方法，所述方法包括以下步骤：将雌激素添加到含有造血祖细胞和/或造血干细胞的细胞培养物中，在雌激素存在下培养所述细胞，以及，任选地，收集造血祖细胞和/或造血干细胞，其中添加到细胞培养物中的雌激素是雌四醇。优选地，在骨髓-间充质干细胞(bm-msc)生态龛存在下培养所述细胞。例如，可以培养一周。
[0019]
第三方面的内容中，本发明涉及用于给对象移植的造血祖细胞或造血干细胞或包
含造血祖细胞和/或造血干细胞的组合物，其中，一个或多个所述细胞在雌激素存在下培养过，所述雌激素为雌四醇。造血祖细胞或造血干细胞或造血祖细胞和/或造血干细胞群可以是用上述方法即本发明第二方面所述方法获得的。
[0020]
就本发明任一方面的内容而言，所述雌激素是雌四醇。
[0021]
并且，就本发明任一方面的内容而言，受体对象，即已经接受或打算接受移植的对象可以是任何哺乳动物，优选人类。
附图说明
[0022]
图1显示异种移植小鼠中雌激素效应测试方案的示意图。
[0023]
图2涉及雌激素处置对人造血重建的增强。显示免疫缺陷雄性nsg小鼠移植后3个月的人植入facs分析，所述小鼠在造血祖细胞移植后用载剂(对照)或β-雌二醇(e2，2μg/天)或雌四醇(e4，2μg/天)处置4天。两个治疗组的结果与对照组相比都有统计显著性差异(kruskal-wallis检验；p《0.05，三个独立实验中每组9-13只小鼠)。
[0024]
图3a和图3b绘制的是人的造血植入中的多谱系重建。图4a显示facs分析所得人细胞中骨髓细胞(表达cd33的人造血细胞)的百分比。图3b显示facs分析所得人植入中b细胞(cd19
+
细胞)的百分比。无一处置产生显著性差异(kruskal-wallis检验；p值无显著性(n.s.，两个独立实验中每组5-9只小鼠)。
[0025]
图4a和图4b涉及nsg小鼠中人的造血植入中的人造血干细胞(hsc)分部。图4a和图4b分别显示移植后三个月人植入中的人造血祖细胞(hcd34
+
)和人hsc(hcd34
+
cd38-)。e4处置的效果与对照组和e2处置组相比有统计显著性差异(kruskal-wallis检验；p《0.05，三个独立实验中每组9-13只小鼠)。
[0026]
图5表明雌激素处置不会降低人hsc的长期自我更新能力。移植后3个月，通过细胞分选由原代异种移植小鼠收获人cd45
+
细胞。将分选所得人cd45
+
细胞移植给第二代雌性nsg。移植后3个月，facs分析人植入。数据相对于对照组的人植入进行归一化。全部处置都未产生显著差异(kruskal-wallis检验；p＝0.1183，两个独立实验中每组4只小鼠)。
[0027]
图6显示雌激素处置在接受移植的雄性免疫缺陷nsg中增加人植入，所述雄性免疫缺陷nsg接受5
×
103个cb-cd34+移植并在三天后接受载剂、e2或e4处置。图6a显示给予e4提高的人植入水平。图6b显示，考虑到非移植动物骨髓中人造血细胞不超过0.1％，雌激素有利于用有限剂量的hpc实现成功的hsct。大约四分之一小鼠的人移植成活率高于0.1％。然而，e2或e4处置使植入小鼠的比例增加到70％。(kruskal-wallis检验；p＝0.1150，每组7-10只小鼠)。
[0028]
图7显示雌激素增强雌性受主中低量cb-cd34
+
的人植入。为了了解e2和e4对改善人造血植入的有益作用是否仅限于雄性受主，给接受了亚致死剂量照射的雌性nsg移植有限数量的人造血祖细胞(5
×
103个cb-cd34+)，并于三天后用载剂、e2或e4处置。图7a显示四个月后的人造血重建情况。值得注意的是，雌性动物中的人植入率高于接受相同低量造血祖细胞的雄性受主，这可能是雌性动物体内存在内源性雌激素的缘故。然而，尽管存在内源性雌激素，雌性受主的人植入仍在e2处置、更重要的是在e4处置后有所增加。图7b显示，雌激素处置的雌性小鼠有更多原始造血祖细胞，这体现重建质量。(kruskal-wallis检验；p《0.05，每组4只小鼠)。
[0029]
图8显示长期培养起始细胞(ltc-ic)试验。ltc-ic通过人骨髓间充质基质细胞(bm-msc)与人祖细胞(cb-cd34+)共培养来研究雌激素的对人积极作用，例如在体外(in vitro)人骨髓模型中。ltc-ic用载剂或100μm e2或e4处理一周。图8a显示e2和e4减少造血细胞的数量，e4减少的幅度较小。图8b显示雌激素(主要是e2)处置后原始造血祖细胞百分比更高。图8c显示原始造血祖细胞总数在e2处置后没有变化，但在e4处置后几乎翻倍。图8d显示共培养1周后的集落形成单位(cfu)分析。将细胞接种在含有特定造血因子的甲基纤维素介质中来评估造血祖细胞的含量。14天后计数集落形成单位(cfu)。数据相对于对照组归一化。与对照组相比，两种处置都产生统计显著性差异(kruskal-wallis检验；p《0.05，每组6个重复)。
[0030]
图9涉及不同浓度e1、e2、e3和e4对人造血祖细胞的影响。将人造血祖细胞培养在加有100ng/ml scf、100ng/ml flt3l和100ng/ml tpo以及不同浓度e1、e2、e3和e4(从10nm到500μm)的无酚红培养基中。图9a显示四天后培养物中造血细胞数量的倍增。图9b显示培养物中的原始造血祖细胞(cd34
+
/cd38-)的总数，根据facs分析所得细胞数量和该细胞群频率推断得出。图9c显示培养物中hsc(cd34
+
/cd38-/cd90
+
/cd45ra-)的总数，如前所述计算得出。灰色虚线表示对照组的值，红色虚线表示第0天的初始值。(kruskal-wallis检验；p《0.05，数据来自四个独立实验)。
[0031]
图10显示不同造血祖细胞亚群中esrα和esrβ的表达。根据cd34、cd38、cd90和cd45ra的表达进行造血祖细胞不同亚群的分选。将hsc(cd34
+
/cd38-/cd90
+
/cd45ra-)、mlp(cd34
+
/cd38-/cd90-/cd45ra
+
)和其他造血祖细胞(cd34
+
/cd38-/cd45ra-)的mrna纯化并逆转录为cdna，然后通过qrt-pcr进行定量。图10a显示不同造血亚群和乳腺癌细胞系中esrα、esrβ和hprt1转录物的存在情况。图10b涉及esrα相对于hprt1的相对表达。图10c显示esrβ相对于hprt1的相对表达。
[0032]
图11显示雌激素在造血生态龛调节中的作用。图11显示移植了5
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104个hcb-cd34+细胞的nsg雄性小鼠的bm中非造血细胞群(hcd45-hcd235a-mcd45.1-mter119-)中小鼠msc(mcd140a+)和小鼠血管内皮细胞(mcd144+)的流式细胞术分析的代表性点图。
[0033]
图12是雌激素对造血生态龛的调节。图12a显示5
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104个hcb-cd34+细胞移植后4个月分析的雄性小鼠bm中小鼠msc 710(mcd140a+或pdgfra+)的相对百分比。图12b显示5
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104个hcb-cd34+细胞移植后4个月分析的雄性小鼠bm中小鼠血管内皮细胞(mcd144+或ve-钙粘素+)的相对量。图12c所示为代表性琼脂糖凝胶，显示esr1(上图)、esr2(中图)和hprt1(下图)进行rt-pcr的pcr产物分析。图12d显示用抗esr1(绿色，左图)、抗esr2(绿色，中图)或二抗(绿色，右图)和dapi(蓝色)染色的人bm-msc的代表性免疫荧光图像。数据用显示四分位距范围(p75，上缘；p25，下缘；p50，中线；p95，箱上方的线；p5，箱下方的线)的点及箱线图来表示。显著性分析采用mann-whitney u检验，显示为**p《0.01。
具体实施方式
[0034]
除非另作说明，本技术所用的科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。此外，除非上下文要求另作别解，单数术语包涵复数含义且复数术语包涵单数含义。
[0035]
本发明基于本技术中所述的发现，其中可以看出雌激素特别是17β-雌二醇(或简
称雌二醇)和15α-羟基雌三醇(亦称雌四醇)在以下两种情形中都能够增加造血祖细胞(cd34+)和/或造血干细胞(cd34+/cd38+)的数量，即：给予已经或意欲成为(因为他们需要)造血干细胞移植(hsct)接受者的个体从而有助于移植后的恢复并有利于过程效率，和加入有cd34+细胞存在的体外骨髓样培养物中从而提高供体造血干细胞或祖干细胞在用于移植前的可得性，因为这些细胞事先经雌激素(尤其雌四醇)处置的细胞同样可有效用于移植。
[0036]
因此，可以说，本发明提供了一种增强hsct后造血重建的方法，该方法主要基于本技术中所述的发现即低剂量的雌激素特别是雌四醇能够增强造血植入从而增加hsct后的造血重建，不仅在将雌激素给予已经或将要接受hsct的对象时如此，将雌激素施用于培养供体细胞(cd34
+
细胞)的细胞培养物时亦是如此。可能有三方面的内容：
[0037]-用于对象造血干细胞移植之前或之后增强造血重建的雌激素，特别是雌四醇(这方面内容可以更直接地视为一种在已经接受细胞移植或将要成为所述细胞受主的对象中增强造血干细胞移植(hsct)后造血重建的方法，所述方法包括给予对象有效量的雌激素，特别是雌四醇，从而增加移植造血干细胞(hsc)的造血贡献。所述对象或个体可以是因为有需要所以已经或将要接受hsct的任何雄性/雌性哺乳动物，优选人，考虑到用人细胞进行的本技术的试验支持对人的适用性。对象可能患有或曾经患有需要在化疗和/或放疗清髓或骨髓抑制后进行hsc移植的任何血液病、实体瘤、骨髓瘤或淋巴瘤。可以是对象自体的或与之同种异体的hsct。所述对象可能患有贫血(镰状细胞贫血、地中海贫血、丙酮酸激酶缺乏症、范可尼(fanconi)贫血或其他再生障碍性贫血)、原发性或获得性免疫缺陷、可通过同种异体造血祖细胞移植治愈的遗传性疾病、可通过移植经遗传矫正的造血祖细胞来治愈的遗传性疾病、或可受益于造血祖细胞移植的任何其他疾病。hsc群可从外周血、脐血、骨髓、羊水、胎盘脐带或任何其他造血祖细胞来源获得。hsc可用本领域所知的方法进行遗传修饰。具体而言，本发明这方面内容基于以下发现，即雌激素增强hsct后的造血重建。雌激素(尤其雌四醇)，最好通过系统性途径给药(虽然其他途径例如皮下途径也可以)并且在对象进行任何骨髓抑制处置后给药，由此避免骨髓抑制剂对hsc的损害，因为雌激素诱导hsc自我更新，此时这些细胞对清髓处置更敏感。
[0038]-一种用于增加培养物中造血祖细胞和/或造血干细胞数量的方法，所述方法包括向所述细胞培养物中添加雌激素(尤其雌四醇)，在所述雌激素存在下培养所述细胞的步骤。在一段时间的暴露后(例如一周，如实施例4)，收集细胞。优选地，在骨髓-间充质干细胞(bm-msc)生态龛存在下进行所述细胞培养。实施例5的结果还表明，各种雌激素似乎有利于增加不同祖细胞亚群的比例，这对于某些特定疾病的相关治疗用途可能是有用的。另一方面，根据本技术中所述的试验，使用雌激素特别是雌四醇来增加所述细胞培养物中的造血祖细胞和/或造血干细胞数量不仅可获得更高数量的供体细胞用于移植，并且可减少hsct所需的造血干细胞比例。由此可提高取自对象的hsc的效率，使得能够获得的移植回输给对象或移植给另一对象的hsc数量最大化。如同前一方面内容中所述，hsc群可从外周血、脐血、骨髓、羊水、胎盘脐带或任何其他造血祖细胞来源获得。hsc可用本领域所知的方法进行遗传修饰。
[0039]-事先经雌激素处理的用于给经历了清髓或骨髓抑制(一般通过化疗和/或放疗进行)的对象移植的造血干细胞或造血祖细胞，即用上述本发明第二方面内容所述方法所得细胞用于移植的用途。对象可能患有或曾经患有需要hsc移植的(如化疗和/或放疗清髓或
骨髓抑制后的)任何血液病或实体瘤。如本发明第一方面中所述，hsct可以是对象自体的或与之同种异体的。hsc群可从外周血、脐血、骨髓、羊水、胎盘脐带或任何其他造血祖细胞来源获得。hsc可用本领域所知的方法进行遗传修饰。
[0040]
本文中，术语“雌激素”包括任何能够在体外试验中激活雌激素受体的物质，并且还包括天然雌激素的衍生物。本技术中，当实施例中的试验用它们进行时，该术语可特指β-雌二醇和雌四醇。出于以下解释的原因，可选择雌四醇作为用于本发明目的和实施方式的雌激素。
[0041]
本发明及其各不同方面的内容以后文实施例的结果为基础。
[0042]
首先，观察到雌激素调节hsct(实施例1)，提示雌激素或者对移植的hsc有作用，或者对受主的骨髓有作用。
[0043]
如实施例2中所示，低剂量雌激素(主要是雌四醇)处置促进造血植入并增强植入造血干细胞分部，这确保了hsct成功。必须注意的是，与雌二醇相比，雌四醇令造血祖细胞和造血干细胞的百分比上升到更高的值。另外值得注意的是，本发明的发明人采用的是低剂量雌四醇短期处置。
[0044]
然后，为了确定雌激素是否对雄性和雌性受主都有积极作用，给雌性动物移植限定剂量的细胞并用雌激素处置。雌激素特别是雌四醇同样增强雌性免疫缺陷小鼠中有限数量人hcs的植入(实施例3)。这一结果表明雌激素处置有利于雌性和雄性对象的hsct。鉴于雌四醇是一种胎儿雌激素，考虑“背景技术”中提及的notta等人的教导，所得结果是出人意料的，并且似乎不能用性别差异来解释。
[0045]
此外，如实施例4中所示，人hsc在人骨髓样环境中受到正向调节，强烈提示雌激素在患者中的效力。并且，与前述试验中一样，雌四醇的效果高于雌二醇。
[0046]
此外，已观察到，雌四醇对造血祖细胞的体内毒性低于其他天然雌激素，并且它部分拮抗erα响应β-雌二醇的非基因组信号传导(实施例5)；后者与先前报告的数据一致(abot等，2014；gerard等，2015)。所以，雌四醇的hsc调节活性可能不同于雌激素对造血祖细胞的一般作用，因此可用于增强造血恢复。
[0047]
这是首次发现雌四醇在hsct后作用于人hsc。如前所述，据报道，雌性小鼠通过雌激素信号传导增加hsc自我更新(nakada等，2014)，但另一方面，雌二醇长期处置似乎能短暂增加hsc但会降低hsc的长期种群恢复(repopulating)活性(illing等，2012)。在体外，雌二醇通过作用于间充质干细胞诱导hsc增殖(qiu、jin、shao和zhao，2014)，但另一方面雌激素信号传导被显示对造血祖细胞有负面作用并损害hsc功能(sanchez-aguilera等，2014)。与本技术中显示的结果相反，先前的一些数据似乎显示雌激素作用可能对hsct有害。此外，这些结果是用β-雌二醇获得的，事实上不表明其他雌激素(例如雌四醇)可能的作用，根据本技术中显示的结果，雌四醇似乎更有效增强hsct。
[0048]
雌激素的负面作用(qu，1983)(dieter、french、boorman和luster，1987)(illing等，2012；perry、samuels、bird和tobias，2000；shevde和pike，1996；sontas、dokuzeylu、turna和ekici，2009)与其增强hsc活性的有益应用(hayama，nawa，ezaki和kotani，1983；nakada等人，2014年)之间存在矛盾的原因可能不仅在于雌激素治疗的时间和使用剂量，还可能在于雌激素彼此之间的差异以及它们在hsc中引发的分子路径差异。
[0049]
可以认为，雌四醇所得的结果尤其出人意料。其作用机制据称不同于其他雌激素
特别是β-雌二醇的作用机制，雌四醇仅由胎儿肝脏表达，并且雌四醇从未用于任何造血祖细胞或造血细胞相关的研究，因此无法预测雌四醇对hsc的作用，尤其在hsct之后，也无法预料其对造血的作用。此外，传统上认为雌四醇相比β-雌二醇或其他雌激素是一种较弱的雌激素，令人惊讶的是，后文实施例中试验显示，雌四醇对造血祖细胞的作用明显强于雌二醇，在给经照射小鼠(雄性和雌性)移植低剂量人脐血cd34
+
细胞的试验中将人造血重建提高到了更高的百分比，并且在添加雌激素的人骨髓样培养物体外试验中获得了人祖细胞更高的增量(见实施例4)。此外，如实施例5中所示，雌四醇对人造血祖细胞的毒性更低，可能是因为它通过与其他雌激素不同的机制发挥作用(abot等，2014；gerard等，2015)，这将促进雌四醇的临床应用，并使其特别适合本发明的目的。
[0050]
雌四醇与er结合的亲和力低于β-雌二醇，且结合偏性略高于erβ。然而，雌四醇的erα复合物能够结合重要的共活化因子(coactivator)src3，这与β-雌二醇的复合物一样。此外，雌四醇在棕榈酰油酰磷脂酰胆碱脂质体中的溶解度与β-雌二醇的相似，但雌四醇在双层(脂-水界面的酚与疏水核内的酚)中的分布主要朝向脂-水界面，而β-雌二醇在双层中具有平衡的双向取向。雌四醇这些不同的化学特性有利于其独特的生物学特性。
[0051]
本发明的方法提供以下有益效果：a)被认为造血植入失败高风险的患者可以接受移植。b)减少获得足量hsc收获物所需的单采周期。c)减少允许植入特定数量hsc的hsct预处理方案剂量。d)总体上，减少造血移植失败。本发明选择的雌激素，雌四醇或其衍生物，将在hsct后以低剂量(0.1mg/kg/天，持续4天)给予(即，与例如illing等和thurmond等所述的试验相比是降低剂量雌激素的短期处置)。血相恢复(blood recovery)通过血细胞计数和免疫表型分析来评估。
[0052]
此外，值得注意的是，雌激素特别是雌四醇的应用可扩大造血重建，因此，少量造血干细胞即可满足移植所需。这样，举例来说，脐血干细胞移植不仅可用于儿童也可用于成人。此外，给予雌激素可增强雌性动物中的造血重建；因此，本发明可应用于雌性对象。
[0053]
现将通过以下非限制性示例来详细描述多种实施方式。
[0054]
实施例
[0055]
缩写
[0056]
后文实施例中，以下缩写意义如下。未定义的缩写取其公知含义。
[0057]
gy＝戈瑞(gray)
[0058]
nsg＝nod.cg-prkdc
scid il2rg
tm1wjl
/szj小鼠
[0059]
ltc-ic＝长期培养起始细胞
[0060]
α-mem＝α-改良伊氏培养基
[0061]
fbs＝胎牛血清
[0062]
hs＝马血清
[0063]
ps＝青霉素/链霉素
[0064]
hepo＝人重组促红细胞生成素
[0065]
hscf＝人重组干细胞因子
[0066]
hflt3l＝人fms样酪氨酸激酶3配体
[0067]
实施例1.造血干细胞移植后造血重建的增加
[0068]
雄性免疫缺陷nsg小鼠接受2.2gy照射，24h后移植5
×
104个人脐血cd34
+
细胞。72小
时后，接受移植的动物接受每天2μg雌激素或载剂(橄榄油)处置，持续4天。3-4个月后处死动物，facs分析人造血植入(移植成活率)情况。将人造血细胞群鉴定为hcd45-apc-cy7(白乐津公司(biolegend))阳性和小鼠cd45.1-pe(白乐津)阴性的细胞。
[0069]
对雌激素处置或载剂处置的动物进行比较。结果如表1所示：
[0070]
表1.人造血重建百分比(平均数的均值+/-标准误差和小鼠数量)
[0071]
载剂26.70+/-4.19(n＝10)e246.05+/-5.98(n＝13)e447.47+/-6.08(n＝9)
[0072]
此外，对这些动物的人多谱系重建进行了分析。结果如表2所示：
[0073]
表2.人造血细胞群中的百分比(平均数的均值+/-标准误差和小鼠数量)
[0074] 髓系淋巴系载剂6.86+/-1.18(n＝7)82.31+/-2.85(n＝7)e28.42+/-0.88(n＝9)82.26+/-2.14(n＝9)e48.24+/-1.65(n＝5)81.22+/-4.83(n＝5)
[0075]
因此，雌激素处置小鼠的人造血植入比对照组小鼠高约80％。并且，这在各造血谱系中都一样。综上表明，雌激素对人造血重建有积极作用。
[0076]
实施例2.雌激素提高人造血植入中的造血干细胞分部
[0077]
为了进一步研究雌激素在hsct中的作用，对实施例1所述经处置nsg中人细胞群内的造血祖细胞(hcd34+)和造血干细胞(hcd34+/hcd38-)进行了facs分析。结果如表3所示。
[0078]
表3.人造血细胞群中的百分比(平均数的均值+/-标准误差和小鼠数量)
[0079][0080][0081]
此外，为了研究在hsct中的长期作用，分选出人cd45+细胞并移植到二次照射的雌性nsg小鼠中。第二次移植后3个月，在所有移植了来自经雌激素处理原代小鼠的细胞的动物中都检测到人造血植入。
[0082]
因此，雌激素处置令人造血祖细胞增加70％，令人hsc增加一倍。更重要的是，这种处置不影响长期人造血重建。
[0083]
实施例3.雌激素在雄性动物中提高有限剂量cd34
+
细胞获得的人造血植入
[0084]
为了确定雌激素是否能改善少量造血祖细胞的造血重建，对雄性nsg进行照射并移植低剂量的人脐血cd34+(5
×
103个hcd34+)。如实施例1所述分析人植入。雌激素促进低剂量人祖细胞植入的效果如表4所示：
[0085]
表4.人造血重建百分比(平均数的均值+/-标准误差和小鼠数量)
[0086]
[0087]
考虑到非移入动物骨髓中人造血细胞不超过0.1％，雌激素(主要是e4)有利于用有限剂量的hpc实现成功的hsct。如前所示，大约四分之一小鼠的人植入率高于0.1％。然而，e2或e4处置几乎令植入小鼠的比例增至三倍。
[0088]
为了探讨雌激素是否能改善雌性受主的造血重建，对雌性nsg进行照射并移植低剂量的人脐血cd34
+
(5
×
103个hcd34+)。如实施例1所述分析人植入。值得注意的是，雌性动物中的人植入率高于接受相同低量造血祖细胞的雄性受主，这可能是雌性动物体内存在内源性雌激素的缘故。然而，尽管存在内源性雌激素，雌性受主的人植入仍在e2处置、更重要的是在e4处置后有所增加。
[0089]
表5.人造血重建百分比(平均数的均值+/-标准误差和小鼠数量)
[0090][0091]
此外，雌激素处置的雌性小鼠中原始造血祖细胞含量更高，这体现重建的质量。
[0092]
表6.人造血细胞群中造血干细胞(hcd34+/hcd38-)的百分比(平均数的均值+/-标准误差和小鼠数量)
[0093][0094]
这些数据表明雌激素还能在有限数量hcd34+的受主中改善植入。
[0095]
实施例4.雌激素增加体外人骨髓样培养物中的人祖细胞
[0096]
为了进一步研究雌激素对人hsct的有益作用，建立人骨髓样培养物，例如ltc-ic培养物。将1
×
105个人间充质基质细胞(hmsc)接种于p6孔中，次日进行30gy照射。次日，向ltc-ic培养基中的hmsc添加5
×
104个hcd34
+
，ltc-ic培养基含：75％不含酚红的α-mem(生命技术公司(life technologies))、12.5％hyclone fbs(ge医疗公司(ge healthcare))、hs(生命技术公司)、β-巯基乙醇(生命技术公司)、0.5％ps和1
×
10-6
m氢化可的松(西格玛奥德里奇(sigma-aldrich))。将100μm的雌激素溶于乙醇，加入共培养物一周，然后收集细胞，并在添加了特定造血细胞因子(h4535，干细胞技术公司(stemcell technologies))和8u/ml hepo的半固体培养基中测定人造血祖细胞的数量。14天后，测定集落形成单位(cfu)并将其相对于对照组归一化：
[0097]
表7.归一化的人cfu(平均数的均值+/-标准误差和小鼠数量)
[0098][0099]
因此，雌激素处置令体外人骨髓样培养物中的人造血祖细胞频率提高高达98％。
[0100]
实施例5.雌四醇体外试验显示其对造血细胞的毒性低于其他天然雌激素
[0101]
进行体外(in vitro)研究来评估天然雌激素(e1、e2、e3和e4)对造血祖细胞的毒性。将5
×
104个hcd34
+
培养于无酚红培养基x-vivo 20(龙萨(lonza))中，其中存在100ng/ml scf、100ng/ml flt3l、100ng/ml tpo、0.5％ps、1％glutamax(赛默飞世尔(thermofisher))
和不同浓度的e1、e2、e3或e4(从10nm至500μm)。在第0天和培养4天后测定不同造血细胞亚群(cd34
+
/cd38-，hsc[cd34
+
/cd38-/cd45ra-/cd90
+
]，多能祖细胞[mpp，cd34
+
/cd38-/cd45ra-/cd90-]，多能淋巴组细胞[mlp，cd34
+
/cd38-/cd45ra
+
])的细胞增殖和免疫表型。
[0102]
e1、e2和e3对所有造血祖细胞亚群的毒性均大于e4。相反，似乎所有造血祖细胞亚群、主要是最原始的亚群(hsc)都对高浓度的e4有更好的耐受性。e4在体外试验中对造血祖细胞的毒性低于其他天然雌激素。
[0103]
表8.不同天然雌激素处置后造血祖细胞不同亚群的百分比
[0104][0105]
实施例6.雌激素受体在造血祖细胞中的不同表达水平
[0106]
为了解不同雌激素在造血祖细胞中触发的机制，对造血祖细胞分部中esrα(esr1)和esrβ(esr2)的mrna表达水平进行了研究。对hsc(cd34
+
/cd38-/cd45ra-/cd90
+
)、多能淋巴祖细胞[mlp，cd34
+
/cd38-/cd45ra
+
]和其余造血祖细胞(cd34
+
cd45ra-)进行分选；用tryzol试剂(赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific))纯化mrna。用vilo
tm
cdna合成试剂盒(赛默飞世尔科技公司)将mrna逆转录成cdna，并用green
(应用生物系统公司(applied biosystems))进行qrt pcr定量。根据pfaffl法，将两种雌激素受体的mrna表达水平均与hprt1表达对比，所有数值按各hsc亚群的esr归一化。分析中所用的具体引物为：esr1正向(atccacctgatggccaag：seq id no:1)和esr1反向(gctccatgcctttgttactca：seq id no:2)；esr2正向(gatgctttggtttgggtgat：seq id no:3)和esr2反向(agtgtttgagaggccttttctg：seq id no:4)；hprt1正向(atgatggggctgatgtgg：seq id no:5)和hprt1反向((ttctacgcatttcccctca：seq id no:6)。
[0107]
发现两种esr在不同造血祖细胞亚群中差异表达。esrα在mlp中的表达比在hsc中高4倍。出人意料地，esrβ在hsc中的表达是在其他祖细胞中的两倍。这些差异或可解释雌激素在各种造血祖细胞中的不同效果。
[0108]
实施例7.e4(雌四醇)对小鼠造血生态龛内msc的影响
[0109]
为了进一步了解雌激素对促进人造血移入的积极作用，我们对接受移植并用e2(雌二醇)或e4(雌四醇)处置后4个月小鼠bm生态龛中的间充质分部和血管内皮分部进行了研究。分析非造血分部中的小鼠msc(mcd140a+，亦称pdgfra+)的百分比和血管内皮细胞(mcd144+，亦称ve-钙粘素+)的百分比(图11)。出人意料的，e4处理的小鼠中，相比载剂处理的小鼠，mcd140a+细胞数量增加，但mcd144+细胞未见增加(图12a、12b)。
[0110]
然后，评估人间充质基质细胞是否与这些雌激素相互作用。为此，用rt-pcr(图12c)和免疫荧光(图12d)分析人bm-msc分部中esr1和esr2的表达。为此，细胞在重组人纤连接蛋白(retronectin)处理腔中培养一天。然后，用4％pfa固定10分钟，用pbs/1％bsa/10％fbs/0.3m甘氨酸/0.1％吐温20封闭和透化1小时。最后，细胞用兔抗-esr1(艾博抗(abcam))或抗-esr2(艾博抗)和小鼠抗hcd34-pe(becton dickinson pharmingen，bd)进行染色，然后清洗并用二抗即抗兔-alexa488(分子探针公司(molecular probes))染色，再用4’,6-二脒-2-苯基吲哚(dapi，罗氏(roche))复染显示细胞核。所有图像在146axioplan 2成像(蔡司(zeiss))荧光显微镜下可视化。
[0111]
两种雌激素受体都存在于人bm-msc中，表明雌激素的存在会影响这些基质细胞的行为，并间接影响人hspc的生物学和/或植入。
[0112]
总之，雌激素，更重要的是雌四醇，增强和有利于人祖细胞在免疫缺陷小鼠中的造血植入。
[0113]
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