一种用于检测蚕豆抗豆象品种的ssr标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测蚕豆抗豆象品种的ssr标记及其应用。


背景技术：

2.蚕豆(vicia faba l.)，一年生草本植物，又名胡豆、罗汉豆等。据宋《太平御览》记载，蚕豆由西汉杰出的旅行家、外交家张骞自西域引入中原地区。蚕豆在我国种植广泛，自古即是重要的食物资源，同时也是重要的出口资源。蚕豆营养价值丰富，含8种必需氨基酸，碳水化合物含量47％～60％，为粮食、蔬菜和饲料、绿肥兼用作物，在调整农业种植结构、发展畜牧业、提高土壤肥力、保持农田生态平衡中占有重要地位。
3.蚕豆象属于我国农业补充性检疫性有害生物，是蚕豆生产与贮藏中的一种重要害虫，在我国各蚕豆产区均有发生。据调查，如不采取任何防治措施，蚕豆象在贮藏期可造成50％～90％的豆粒穿孔。蚕豆被害后，食味变苦，重量减轻，且易发霉变质，发芽率降低20％以上。近年来，由于蚕豆象发生日益突出，严重影响了蚕豆品质、产量及种植面积，蚕豆象发生危害已成为影响蚕豆产业发展的最主要因素。
4.目前，生产上防治蚕豆象危害的主要方法为磷化铝熏蒸法，这不仅增加了蚕豆生产的成本，而且容易导致农药残留，造成环境污染，影响食用者身体健康。因此，培育抗豆象蚕豆品种成为避免蚕豆象侵害的首选。传统育种方法成本高，耗时长，具有较大的限制性。现代分子生物技术的发展，尤其是分子标记技术的发展极大地促进了作物新品种选育的进程。ssr标记具有重复性好、多态性高、共显性遗传、遍布整个基因组等优点，使得ssr标记成为广泛使用的分子标记。研究开发抗豆象基因紧密连锁标记，应用分子标记辅助选择育种技术培育抗豆象蚕豆新品种，是防治蚕豆象危害最为经济且环保的方法，对于减轻蚕豆象危害，保障我国蚕豆安全生产具有非常重要的意义。但蚕豆由于基因组过于庞大(约14gb)，且关注度不是很高，导致基因组序列没有测序，开发分子标记困难。目前蚕豆中公开发表的可用的ssr标记不多，直接导致通过分子标记辅助选育抗豆象品种比较困难。


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明的目的在于提出一种用于辅助选择抗豆象蚕豆的ssr标记引物对及其应用，该ssr标记引物对可用于辅助选择抗豆象蚕豆，对抗豆象性状具有显著的选择性。
6.本发明人采用pacbio三代全长测序技术结合rna-seq的方法，对蚕豆品种进行了全基因组测序，在此基础上，使用软件misa对转录组的所有unigene进行搜索，寻找包含ssr核心基序的unigene，并根据这些序列设计引物后通过实验方法进行验证，最终获得了本发明中包含(tc)10核心基序的核苷酸序列如seq id no.7所示，并根据seq id no.7序列开发了用于选择抗豆象蚕豆的ssr引物对核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2，以及开展ssr分子标记选择的实验方法。
7.本发明的目的之一在于提供一种包含ssr核心基序，用于开发蚕豆ssr标记的特异序列，其ssr核心基序为(tc)10，也就是含有10个连续tc重复的序列，核苷酸序列如seq id no.7所示：
[0008]5’‑
gttattgtcgtggagaaaggaaaacctctcccgccacgaaaattctattctctctctctctctctctctgtagtagccatatacacagctagcttcgcgtcacaatctcactctcatcaactcttcaaactaatggctgcaactcttcaaactctgcgacttccttttcatccatctatcacacccctaaattcatatcctttcccaacctctaccgtccattactcccccaaatcaagcaccttcaagggttcatctgtcgccacccgcaacaaaccagtaccttcttccaaagcttccaattcgcagtacagtcccactgttaccgaaaatctcgctgacattagcattttctcggccgccggtgagcccgtcatgttcaaagatctttgggaccaagaacaggaaaagccctgatctttatccatttcttatctgttttgggcacaaccattttgacctaaaattgtgctttttactctctggaatattaatttgaattagttgagttaatgggttgatcttaatttgtggtgggtgattagagtttattcttgcagggaatagctgtggttgcacttttaaggcactttggatgtccatgctgctgggaattggcttcaactttgaaagaatccaaatcaaggtttgattcggctggtgtgaagttaattgcagtgggtgtcggtgcccccaataaagcccgtctccttgcccaacga-3’。
[0009]
本发明的目的之二在于提供一种用于辅助鉴定抗豆象蚕豆的ssr标记引物对，该引物对用于对抗豆象蚕豆的ssr标记进行扩增，其核苷酸序列为：
[0010]
上游引物：核苷酸序列如seq id no.1所示：agaaaggaaaacctctcccg
[0011]
下游引物：核苷酸序列如seq id no.2所示：gtgcttgatttgggggagta
[0012]
本发明的目的之三在于提供所述的ssr标记引物对在辅助鉴定抗豆象蚕豆中的应用。
[0013]
本发明的目的之四在于提供一种辅助选择抗豆象蚕豆的方法，包括如下步骤：
[0014]
步骤1、以蚕豆基因组dna为模板，以如seq id no.1，seq id no.2所示的引物对进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；
[0015]
步骤2、将pcr扩增产物进行凝胶电泳，检测pcr产物的带型，若带型显示为a(250bp、240bp、235bp三条带)、b(250bp和235bp两条带)、c(248bp和240bp两条带)或d(240bp和235bp两条带)四种带型，则被检测的蚕豆材料鉴定为抗豆象蚕豆材料。
[0016]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0017]
(1)标记稳定：本研究鉴定了51份不同豆象抗性的蚕豆，在显示a带型的8个蚕豆品种(品系)中，8个为高抗豆象的材料，准确率达到100％；在显示b带型的15个蚕豆品种(品系)中，15个为高抗豆象的材料，准确率达到100％；在显示c带型的10个蚕豆品种(品系)中，10个为高抗豆象的材料，准确率达到100％；在显示d带型的7个蚕豆品种(品系)中，6个为高抗豆象的材料，准确率达到85％以上，对抗豆象性状具有显著的选择性。
[0018]
(2)快速准确：通过本发明提供的方法，只需提取蚕豆总dna进行pcr扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可有效的鉴定蚕豆抗豆象性状，实现筛选抗豆象蚕豆的第一步。因此，该分子标记在今后的抗豆象蚕豆辅助选择育种中具有巨大的应用前景。
[0019]
(3)对使用的仪器设备要求较低，一般的分子生物学实验室均可进行，无需复杂的技术步骤。
附图说明
[0020]
图1为本发明51份蚕豆材料的ssr聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果；注：泳道1-51分
别为编号1-51的蚕豆材料；a带型：泳道1-8；b带型：泳道9-23；c带型：泳道24-33；d带型：泳道34-39、49；e带型：泳道40、42；f带型：泳道41；g带型：泳道43-48、50、51；
[0021]
图2为本发明部分蚕豆基因组dna提取结果；注：a图为原ctab法提取dna的检测结果；b图为本发明改进的ctab法提取dna的检测结果；
[0022]
图3为本发明引物筛选及确定引物退火温度。
具体实施方式
[0023]
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
[0024]
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025]
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026]
实施例1-对ssr核心基序的获取
[0027]
改进蚕豆基因组dna提取方法，包括如下步骤：
[0028]
(1)取80mg蚕豆新鲜幼嫩叶片组织，加入700μl dna提取液以及1％的pvp，充分研磨，研磨液转入相对应的1.5ml离心管；聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，简称pvp)；
[0029]
(2)将离心管进行65℃水浴30分钟，每5min取出轻轻摇动混匀；
[0030]
(3)水浴完成后于通风橱中加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇(v/v/v为25：24：1)，颠倒混匀后，以12000rpm离心10min，取上清液转入新的离心管，然后加入等量氯仿/异戊醇(v/v为24:1)，上下颠倒混匀；
[0031]
(4)以12000rpm离心10min，取500μl上清液转入新的离心管，加入2倍体积预冷无水乙醇颠倒混匀后于-20℃静置30min；
[0032]
(5)以12000rpm离心10min，弃上清液，加入500μl 70％的乙醇洗涤，以12000rpm离心10min，弃上清液，用卫生纸擦干离心管边沿，用微量移液枪吸取离心管底部残余液体，室温放置干燥15min，加入40μl灭菌水，溶解dna沉淀，室温放置1天后，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna质量。
[0033]
原蚕豆基因组dna提取方法，包括如下步骤：
[0034]
(1)取80mg蚕豆新鲜幼嫩叶片组织，加入700μl dna提取液，充分研磨，研磨液转入相对应的1.5ml离心管；
[0035]
(2)65℃水浴30分钟左右，每5min取出轻轻摇动混匀；
[0036]
(3)水浴完成后于通风橱中加入500μl氯仿/异戊醇(v/v为24：1)，颠倒混匀后，以12000rpm离心10min，取500μl上清液转入新的离心管，加入等量异丙醇颠倒混匀后室温静置20min；
[0037]
(4)12000rpm离心10min，弃上清液，加入500μl 70％的乙醇洗涤；
[0038]
(5)12000rpm离心10min，弃上清液，用卫生纸擦干离心管边沿，用微量移液枪吸取离心管底部残余液体，室温放置干燥15min，加入40μl灭菌水，溶解dna沉淀，室温放置1天后，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna质量。
[0039]
如图2所示，a图为原ctab法提取dna的检测结果，b图为本发明改进的ctab法提取dna的检测结果，由图可见，本发明改进的ctab法提取的dna，提取质量较高，dna降解程度大幅度下降。
[0040]
实施例2-ssr核心基序核苷酸信息
[0041]
采用pacbio三代全长测序技术结合rna-seq的方法，对蚕豆进行了全基因组测序，将seq id no.7序列拷贝至misa在线软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)，采用默认参数进行分析，发现其5’端48bp～67bp核苷酸序列含有(tc)10的ssr核心基序，核苷酸序列如seq id no.7所示：
[0042]5’‑
gttattgtcgtggagaaaggaaaacctctcccgccacgaaaattctattctctctctctctctctctctgtagtagccatatacacagctagcttcgcgtcacaatctcactctcatcaactcttcaaactaatggctgcaactcttcaaactctgcgacttccttttcatccatctatcacacccctaaattcatatcctttcccaacctctaccgtccattactcccccaaatcaagcaccttcaagggttcatctgtcgccacccgcaacaaaccagtaccttcttccaaagcttccaattcgcagtacagtcccactgttaccgaaaatctcgctgacattagcattttctcggccgccggtgagcccgtcatgttcaaagatctttgggaccaagaacaggaaaagccctgatctttatccatttcttatctgttttgggcacaaccattttgacctaaaattgtgctttttactctctggaatattaatttgaattagttgagttaatgggttgatcttaatttgtggtgggtgattagagtttattcttgcagggaatagctgtggttgcacttttaaggcactttggatgtccatgctgctgggaattggcttcaactttgaaagaatccaaatcaaggtttgattcggctggtgtgaagttaattgcagtgggtgtcggtgcccccaataaagcccgtctccttgcccaacga-3’。
[0043]
实施例3-以ssr标记进行辅助鉴定抗豆象蚕豆品种
[0044]
步骤1、引物设计：根据含有ssr核心基序(tc)10的特异蚕豆基因组的核苷酸序列seq id no.7，用primer 3软件设计了3对ssr引物，序列为：
[0045]
seq id no.1：agaaaggaaaacctctcccg；
[0046]
seq id no.2：gtgcttgatttgggggagta。(第一对引物)
[0047]
seq id no.3：agaaaggaaaacctctcccg；
[0048]
seq id no.4：gagtgagattgtgacgcgaa。(第二对引物)
[0049]
seq id no.5：agaaaggaaaacctctcccg；
[0050]
seq id no.6：aaggtactggtttgttgcgg。(第三对引物)
[0051]
步骤2、pcr扩增：pcr条件摸索。
[0052]
根据引物合成单所给tm值降低3℃即得到引物初始退火温度。以部分待测蚕豆基因组dna为模板，用上述3对引物分别对所选dna模板进行pcr扩增；
[0053]
pcr反应总体系为15μl，其中primer f和primer r引物各0.6μl，模板dna为1.5μl，ddh2o为9.4μl，dntp为0.3μl，10
×
buffer为1.5μl，mg
2+
为0.9μl，热稳定dna聚合酶(taq酶)0.2μl。
[0054]
pcr扩增在tgreat gradient thermal cycler(96well)ose-gp-01型pcr仪上进行，盖温控制在105℃，先95℃恒温预变性5min；再进行35个循环的预变性(95℃，30s)、退火(温度随引物而不同30s)、延伸(72℃，45s)；然后在72℃下继续延伸10min；最后慢慢冷却至4℃。
[0055]
步骤3、凝胶检测
[0056]
以步骤2扩增产物加入1/2体积的变性剂(5
×
tbe 10ml，甲酰胺90ml，溴酚蓝0.05g，二甲苯青0.05g)，95℃恒温变性5min。取4μl利用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染检测，观察分析带型。
[0057]
如图3所示，三对引物在54℃退火温度初筛时，只有第一对引物扩增出特异性条
带，第二对引物非特异性扩增，第三对引物弥散现象严重，遂舍弃后两对引物。在55℃退火温度下，引物对seq id no.2和3扩增效果良好。于是选用第一对引物对51份蚕豆品种进行鉴定，结果如图1和表1所示。
[0058]
表1-51份蚕豆品种(品系)豆象抗性和ssr带型结果
[0059][0060][0061]
由图1可知，在显示a、b、c三种带型的33个蚕豆品种(品系)中，33个为高抗豆象蚕豆材料，准确率达到100％；在显示d带型的7个蚕豆品种(品系)中，6个为高抗豆象蚕豆材料，准确率达到85.7％以上，对抗豆象性状具有显著的选择性。
[0062]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。