1.本技术属于医药技术领域，尤其涉及一种黄酮化合物衍生物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.结直肠癌(crc)是世界上最致命和最普遍的恶性肿瘤之一，手术和化疗长期以来一直是癌症患者的首选。然而，crc的预后很差，尤其是对发生转移病变的患者。结直肠癌的5年生存率约为64％，但转移性结直肠癌的5年生存率降至12％，仍需进一步研究有效地防治手段。炎症性肠病(ibd)是一种慢性自身免疫性疾病，包括克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)，也被报道为crc的危险因素。炎症相关结直肠癌(cac)是结直肠癌的一种亚型，与散发性结直肠癌(s-crc)相比，cac在更年轻时被诊断，预后更差，5年生存率仅为50％，近年来备受关注，因此对cac进行有效地预防、发现和早期治疗具有非常重大的意义。
3.现在用于结直肠癌预防的主要手段是依赖于现有体检技术的早期发现和手术方法。由于炎症性肠病(ibd)患者具有发展为结直肠癌的高风险，结肠镜检查被认为是诊断发育异常和肿瘤变化的金标准。但是，由于这种风险取决于多种因素，如疾病持续时间或抗炎治疗，多达50-80％的炎症相关结直肠癌(cac)病变在结肠镜检查中是不可见的，预防性监测计划的作用仍有争议。虽然结直肠癌筛查降低了结直肠癌的发病率和死亡率，但药物预防策略有可能进一步降低结直肠癌的发病率和死亡率。用于结直肠癌预防的药物可以分为化学药物、生物制药和中药，但这些药物目前均处于试验的基础研究阶段，市场和临床尚未得到广泛推广应用。已经研究的结直肠癌化学预防剂包括阿司匹林、姜黄素、非甾体抗炎药(如5-asa)、他汀类药物、靶向代谢途径的药物以及维生素和矿物质。尽管阿司匹林和非甾体抗炎药显示出较大的前景，但将其用作化学预防剂的建议仅限于心血管疾病或结直肠癌易感综合征风险增加的个人，如林奇综合征或家族性腺瘤性息肉病综合征。因此临床上还未正式将它们用于炎症相关结直肠癌(cac)预防的适应症。总的来说，理想的结直肠癌化学预防剂仍需进一步研究。生物制药主要是益生菌，益生菌补充剂是单一相关的培养物或活微生物的混合，通过破坏潜在致癌物质，减少微生物基因毒性，改变微生物群，其代谢物产生抗肿瘤和抗基因突变等化合物，与病原菌竞争，增加肠道屏障，增加宿主的先天免疫反应和调节细胞增殖和抗凋亡途径来发挥防治炎症相关结直肠癌(cac)的功能。虽然这些通过调控肠道微生物显示出有希望的结果，但应该注意的是，它们伴随着可能导致临床并发症的风险和争议，这些肠道微生物制剂的抗炎症相关结直肠癌(cac)效果还有待更多确切的循证医学证据。此外，还有报道中药以及中药有效成分也对cac的防治有帮助，例如，乌梅丸通过调节肠道微生物群和il-6/stat3信号通路降低炎症相关结直肠癌(cac)发生发展，六神丸治疗aom/dss诱导小鼠炎症相关结直肠癌通过抑制β-catenin表达，但多数中药防治炎症相关结直肠癌(cac)有效的确切物质基础和循证医学证据还有待明确。到目前为止，临床上还没有用于cac防治的有效药物，因此亟需研究开发防治cac的新化学结构来源的潜在新药。
4.综上所述，虽然早期筛查和早期诊断使结直肠癌的发病率和死亡率有所降低，但仍需要额外的预防策略减轻肿瘤负担。目前，对炎症相关结直肠癌(cac)主要采用外科手术加内科保守治疗，改善营养，积极防治并发症等措施，仍未有针对cac的防治性药物。已研究的结直肠癌预防药物包括阿司匹林、其他非甾体类抗炎药(如5-asa)、肠道菌群以及维生素和矿物质(如维生素d和钙剂)等，虽然在实验研究中有所作用，但是与临床试验结果不一致，以及出现多种不良并发症等问题，至今临床上没有这方面的应用药物。2016年，美国预防工作组推荐在50岁至69岁的成年人中使用低剂量阿司匹林作为结直肠癌的一级预防。然而，长期服用阿司匹林治疗存在胃肠道和颅内出血并发症，同时阿司匹林在老年病人中癌症风险更高，阿司匹林的预防仅限于具有良好效益的患者。5-asa作为治疗ibd传统方法之一，此前研究报道5-asa对cac具有预防作用，同时亦有不少研究认为5-asa保护作用并不明显，因此5-asa作为cac预防药物存在很大争议。肠道菌群是预防和治疗结直肠癌的新策略，其目的是逆转微生物失调，尽管机械地通过纠正微生物群组成，调节先天免疫系统，增强肠道屏障功能，但其可能导致临床并发症。流行病学和临床前数据表明，较高的维生素d和钙剂摄入量可以降低结肠癌风险，然而，在一项随机对照试验(rcts)中，腺瘤切除患者每天摄入维生素d和钙补充剂在3-5年内没有显著降低结直肠癌发生率。研究还发现二甲双胍、熊去氧胆酸、他汀类药物等也可能具有预防作用，但同样存在rcts的结果不一致，尚需要进一步研究探讨。总之，现有的针对炎症相关结直肠癌(cac)的预防药物具有其相应的治疗弊端，还未在临床和市场得到应用，亟待研发新的安全有效的炎症相关结直肠癌(cac)化学预防药物。


技术实现要素：

5.基于此，本技术提供了一种具有良好抗炎症相关结直肠癌(cac)效果的黄酮化合物衍生物，本技术的黄酮化合物衍生物的化学结构单一，产品容易制备和提纯，其合成方法简单，副反应少，产率较高，原料易得，成本低，有利于工业化生产。
6.本技术第一方面提供了一种黄酮化合物衍生物，具有式一所示结构；
[0007][0008]
本技术第二方面公开了式一所示黄酮化合物衍生物的制备方法，合成路线如图2所示，包括：
[0009]
步骤1、将式二所示化合物与式三所示化合物在有机溶剂中混合反应，制得式四所示化合物；
[0010]
步骤2、将所述式四所示化合物与碱在有机溶剂中混合反应，制得式一所示黄酮化合物衍生物；
[0011][0012][0013]
另一实施例中，所述有机溶剂选自丙酮、四氢呋喃、乙腈、甲醇和乙醇中的一种或多种；所述碱选自氢氧化钠或/和氢氧化钾。
[0014]
另一实施例中，所述碱为体积百分比为30～40％的氢氧化钠。
[0015]
具体的，式一所示化合物的重均分子量mw为356.33；式二所示化合物的重均分子量mw为270.24；式三所示化合物的重均分子量mw为181.02；式四所示化合物的重均分子量mw为370.35。
[0016]
另一实施例中，步骤1具体包括式二所示化合物与式三所示化合物在有机溶剂中搅拌回流反应，薄层层析检测反应达到平衡，蒸去所述有机溶剂，残留物在二氯甲烷中混合，经洗涤、干燥、纯化后得到，得到式四所示化合物。
[0017]
具体的，将13.5g(50mmol)式二所示化合物、9.05g(50mmol)式三所示化合物、500ml丙酮加入1l单颈瓶中，升温至回流反应；薄层层析tlc(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)监控至原料消失，停止反应；然后，减压蒸除丙酮，残余物溶于二氯甲烷中，水洗涤二氯甲烷层3次；接着，二氯己烷层无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸除溶剂，得到黄色固体；将该黄色固体进行柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)获得5g的式四所示化合物，收率为37％。
[0018]
另一实施例中，步骤2具体包括将所述式四所示化合物与碱在有机溶剂中混合反应，薄层层析检测反应达到平衡，调节ph至酸性后，蒸去所述有机溶剂，残留物在二氯甲烷中混合，经洗涤、干燥、纯化后得到，得到式一所示黄酮化合物衍生物。
[0019]
具体的，将上述黄色的式四所示化合物溶于250ml甲醇中，加入150ml 30％氢氧化钠水溶液，室温搅拌；薄层层析tlc监控至原料消失，停止反应。然后往反应液中加入浓盐酸至ph＝2-3。接着，减压蒸除溶剂，残余物溶于500ml二氯甲烷中，水洗三次，无水硫酸钠干燥，抽滤。然后减压蒸除溶剂，往残余物中加入50ml异丙醚打浆，抽滤，得到黄色固体。最后将该黄色固体在50℃下真空干燥，得到3g式一所示黄酮化合物衍生物，收率为61％。
[0020]
本技术第三方面公开了所述黄酮化合物衍生物或所述制备方法制得的黄酮化合物衍生物在制备抗结直肠癌药物中的应用。
[0021]
另一实施例中，所述抗炎症相关结直肠癌药物中包含治疗有效量的黄酮化合物衍生物和制药学上可接受的药物辅剂。
[0022]
另一实施例中，所述抗炎症相关结直肠癌药物每单位制剂含黄酮化合物衍生物1
～3g。
[0023]
另一实施例中，所述抗炎症相关结直肠癌药物为口服制剂、注射制剂或局部给药制剂。
[0024]
本技术的目的在于提供一种针对炎症相关结直肠癌防治的新化学结构的黄酮醇类化合物衍生物及其制备方法和应用。从本技术的试验数据可知，本技术的黄酮醇类化合物衍生物具有良好效果的抗炎症相关结直肠癌作用，并且其安全性较好。本技术合成的黄酮醇类化合物衍生物结构单一，产品容易制备和提纯，合成方法比较简单，副反应少，产率较高，原料易得，成本低，有利于工业化生产，为靶向防治炎症相关肿瘤的应用奠定了基础。
附图说明
[0025]
为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。
[0026]
图1为本技术实施例提供了黄酮化合物衍生物治疗炎症相关结直肠癌小鼠模型的试验路线；
[0027]
图2为本技术实施例提供的式一所示黄酮化合物衍生物的合成路线图；
[0028]
图3为本技术实施例提供的式一所示黄酮化合物衍生物的hnmr氢谱；
[0029]
图4为本技术实施例提供的炎症相关结直肠癌小鼠模型的造模实验流程图；
[0030]
图5为本技术实施例2提供的不同处理后炎症相关结直肠癌小鼠的体重变化趋势和小鼠生存率曲线；
[0031]
图6为本技术实施例2提供的不同处理后炎症相关结直肠癌小鼠的瘤体外观；
[0032]
图7为本技术实施例2提供的不同处理后炎症相关结直肠癌小鼠的肿瘤负荷、肿瘤数量以及不同级别大小肿瘤数量分析；
[0033]
图8为本技术实施例2提供的不同处理后炎症相关结直肠癌小鼠的肿瘤炎性因子的基因水平和蛋白水平；
[0034]
图9为本技术实施例2提供的不同处理后炎症相关结直肠癌小鼠肝脏和肾脏组织的病理变化。
具体实施方式
[0035]
本技术提供了一种黄酮化合物衍生物及其制备方法和应用，用于解决现有技术中的技术缺陷。
[0036]
下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
[0037]
其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制。
[0038]
请参阅图1，图1为本技术实施例提供了黄酮化合物衍生物治疗结直肠癌小鼠模型的试验路线。
[0039]
图1的aom：氧化偶氮甲烷；dss：葡聚糖硫酸钠；i.g.：灌胃给药；elsia：酶联免疫吸附剂测定，指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性
和定量方法；rt-pcr：逆转录pcr，是将rna的反转录(rt)和cdna的聚合酶链式扩增(pcr)相结合的技术；tnf-α：肿瘤坏死因子-α；il-1β：白细胞介素1β；il-6：白细胞介素-6；il-4：白细胞介素-4；il-10：白细胞介素-10。
[0040]
本技术实施例的炎症相关结直肠癌小鼠模型的造模方法为现有常规的造模。
[0041]
实施例1
[0042]
本技术实施例提供了黄酮醇类化合物衍生物的制备工艺，具体包括：
[0043]
1、以下面的式二所示化合物为起始原料，式二所示化合物购买自上海源叶生物科技有限公司，式二所示化合物的化学结构式为：
[0044][0045]
2、制备式一所示黄酮化合物衍生物4-((3,5-dihydroxy-4-oxo-2-phenyl-4h-chromen-7-yl)oxy)butanoic acid(标记为fd2020713)的方法，具体合成路线如下：
[0046][0047]
1)将13.5g(50mmol)式二所示化合物(标记为no.ht210711)、9.05g(50mmol)式三所示化合物(即溴丁酸甲酯)、500ml丙酮加入1l单颈瓶中，升温至回流反应。
[0048]
2)薄层层析tlc(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)监控至原料消失，停止反应。
[0049]
3)减压蒸除丙酮，残余物溶于二氯甲烷中，水洗涤二氯甲烷层3次。
[0050]
4)二氯己烷层无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸除溶剂，得到黄色固体。
[0051]
5)柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)获得5g黄色固体(即式四所示化合物)，收率为37％。
[0052]
6)将上述黄色固体溶于250ml甲醇中，加入150ml 30％氢氧化钠水溶液，室温搅拌。
[0053]
7)薄层层析tlc监控至原料消失，停止反应。
[0054]
8)往反应液中加入浓盐酸至ph＝2-3。
[0055]
9)减压蒸除溶剂，残余物溶于500ml二氯甲烷中，水洗三次，无水硫酸钠干燥，抽滤。
[0056]
10)减压蒸除溶剂，往残余物中加入50ml异丙醚打浆，抽滤，得到黄色固体。
[0057]
11)50℃真空干燥，得到3g式一所示黄酮化合物衍生物(标记为fd2020713)，收率为61％。
[0058]
上述产物fd2020713经hnmr氢谱检测验证其结构，结果如图3所示，从图3可知，本技术实施例成功制备式一所示黄酮化合物衍生物，上述产物fd2020713经元素分析和hplc检测纯度98％以上。
[0059]
实施例2
[0060]
本技术实施例提供了炎症相关结直肠癌小鼠模型的建立、分组和干预试验，具体包括：
[0061]
(1)炎症相关结直肠癌(cac)小鼠模型建立方法：
[0062]
选取5-6周龄c57bl/6小鼠，随机分为3组，分别为模型组(标记为aom/dss)、黄酮醇类化合物衍生物组(标记为aom/dss+fd2020713)和阿司匹林组(标记为aom/dss+aspirin)，每组10只，请参阅图4，单次腹腔注射aom(10mg/kg)联合3个循环2.5％dss饮水建立c57bl/6小鼠cac模型，造模前一周开始灌胃干预，实验全程每天灌胃一次，第11周末予以小鼠安乐死。造模周期共11周。
[0063]
第1周：所有组在第一周腹腔注射aom(10mg/kg)，黄酮醇类化合物衍生物组和阿司匹林组分别注射对应的药物。
[0064]
模型组(aom/dss，aom/dss造模+0.9％氯化钠溶液)、黄酮醇类化合物衍生物组(aom/dss造模+40mg/kg fd2020713，aom/dss造模+80mg/kg fd2020713)和阿司匹林组(aom/dss造模+30mg/kgaspirin)；
[0065]
第2周：所有组自由正常饮水改2.5％dss特殊饮水，持续1周；【造模ⅰ期】；
[0066]
第3-4周：所有组换回自由正常饮水，持续2周；
[0067]
第5周：所有组自由正常饮水改2.5％dss特殊饮水，持续1周；【造模ⅱ期】；
[0068]
第6-7周：所有组换回自由正常饮水，持续2周；
[0069]
第8周：所有组自由正常饮水改2.5％dss特殊饮水，持续1周；【造模ⅲ期】；
[0070]
第9-10周：所有组换回自由正常饮水，持续2周；
[0071]
第11周末：所有组的小鼠禁食24h，处死小鼠并评估成瘤情况。
[0072]
(2)实验分组及干预方式：
[0073]
模型建立前1周开始预防给药，造模第1周至第11周结束，全程采用灌胃的给药方式，每天灌胃1次，具体分组如下：
[0074]
模型组：aom/dss造模+0.9％氯化钠溶液，aom/dss诱导小鼠成瘤，每天生理盐水灌胃给药；黄酮醇类化合物衍生物组：aom/dss造模+fd2020713(40mg/kg或80mg/kg)，aom/dss诱导小鼠成瘤，每天fd2020713(40mg/kg或80mg/kg)灌胃给药；阿司匹林组(为阳性对照组)：aom/dss造模+aspirin(30mg/kg)，aom/dss诱导小鼠成瘤，每天阿司匹林(30mg/kg)灌胃给药。每组小鼠有10只，每个统计数据有3个重复，定量数据以均数
±
标准差表示，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001vsaom/dss组。fd2020713：黄酮醇类化合物衍生物；aspirin：阿司匹林。
[0075]
然后测定所有组别小鼠的体重变化趋势和小鼠生存率曲线，结果如图5所示，图5可知，在炎症相关结直肠癌(cac)形成的过程中，黄酮醇类化合物衍生物组fd2020713与模型组相比，黄酮醇类化合物衍生物可缓解cac小鼠的体重变化、改善生存率，并且fd2020713(80mg/kg)药物组的防治效果更优于fd2020713(40mg/kg)药物组，故以下实施例选择fd2020713(80mg/kg)药物组开展后续实施例3～实施例6。
[0076]
实施例3
[0077]
本技术实施例提供了实施例2的三个组的小鼠处死、取材以及成瘤评估试验，包括：
[0078]
(1)至11周末，10％的水合氯醛按每10g注射0.4ml腹腔注射麻醉，麻醉后将小鼠断颈处死。
[0079]
(2)将小鼠固定于解剖台上，75％酒精消毒小鼠的腹部，用组织剪沿腹中线纵行剪开腹腔，解剖出全部结直肠，用无菌生理盐水冲洗干净，观察结直肠成瘤情况。
[0080]
(3)统计结肠部位肿瘤数量及肿瘤大小，测量肉眼可见肿瘤的长径并计算肿瘤负荷，具体计算方法为：小鼠肿瘤负荷＝该小鼠所有肿瘤长径之和。
[0081]
(4)最后，将结肠肿瘤组织经液氮冷冻后，于-80℃保存。
[0082]
观测cac小鼠瘤体，测定cac小鼠肿瘤负荷，cac小鼠肿瘤数量以及cac小鼠不同级别大小肿瘤数量，结果如图6～图7所示，图6～图7的aom/dss+fd2020713为fd2020713(80mg/kg)药物组。图6从左到右分别为模型组小鼠瘤体外观，给药组aom/dss+fd2020713小鼠瘤体外观，阳性对照组aom/dss+aspirin小鼠瘤体外观；图7从左到右分别cac小鼠肿瘤负荷，cac小鼠肿瘤数量以及cac小鼠不同级别大小肿瘤数量分析。
[0083]
从图6～图7可知，黄酮醇类化合物衍生物fd2020713与模型组相比，能够抑制肿瘤的大小，减少肿瘤数量，基于以上实验结果，表明本技术提供的黄酮醇类化合物衍生物fd2020713对炎症相关结直肠癌(cac)的形成和发展具有显著的抑制作用，并且其防治效果明显优于阿司匹林组。
[0084]
对比例1
[0085]
本技术对比例提供了采用式二所示化合物作用炎症相关结直肠癌(cac)小鼠模型的试验，包括：
[0086]
参照实施例2的黄酮醇类化合物衍生物组的干预方式，对小鼠给药aom/dss造模和80mg/kg的式二所示化合物，测定该组炎症相关结直肠癌(cac)小鼠肿瘤数量，该组的肿瘤数量为7.33
±
1.70，与图7中间图的炎症相关结直肠癌(cac)小鼠肿瘤数量结果相比，模型组aom/dss组小鼠的肿瘤数量为12
±
1.41，aom/dss+式二所示化合物组小鼠的肿瘤数量为7.33
±
1.70，给药组aom/dss+fd2020713(80mg/kg)组小鼠的肿瘤数量的肿瘤数量为5.67
±
0.71，阳性对照组aom/dss+aspirin组小鼠的肿瘤数量为7.67
±
1.08。虽然aom/dss+式二所示化合物组较aom/dss组肿瘤数量减少，与aom/dss+aspirin组抑瘤效果相近，但本技术提供的黄酮醇类化合物衍生物fd2020713的防治效果明显优于式二所示化合物。
[0087]
实施例4
[0088]
本技术实施例提供了酶联免疫吸附实验(elisa)和实时荧光定量pcr(realtime pcr)检测实施例2的三个组的肿瘤组织内细胞因子蛋白表达水平，具体包括：
[0089]
将实施例3样品和对照等三组处理后的炎症相关结直肠癌(cac)小鼠安乐死后，收集其肿瘤组织，提取蛋白后利用酶联免疫吸附实验(elisa)检测tnf-α、il-1β、il-6、il-4、il-10的表达情况。结果如图8的a-e图。
[0090]
将实施例3样品和对照等三组处理后的cac小鼠安乐死后，收集其肿瘤组织，提取rna后利用实时荧光定量pcr(realtime pcr)检测tnf-α、il-1β、il-6、il-4、il-10的表达情况。结果如图8的f-j图。
[0091]
一、酶联免疫吸附实验(elisa)检测肿瘤组织内细胞因子基因表达水平试验包括：
[0092]
(1)组织蛋白提取后，采用bac法测定蛋白浓度。
[0093]
(2)elisa检测目的样品中的免疫因子的表达，根据每个细胞因子的elisa试剂盒
说明书进行调整。
[0094]
1)包被捕获抗体(capture antibody)：用包被液按照说明书上的稀释倍数稀释捕获抗体，混匀，100μl/孔，铺到96孔板中，盖上锡箔纸，湿盒中4℃冰箱过夜孵育后，弃液，洗液洗3次(洗液体积》250μl)，摇床振荡洗涤1min/次，最后一次尽量拍干残留的液体。
[0095]
2)封闭：试剂稀释液，200μl/孔，湿盒中，室温孵育1h后，弃液，洗液洗3次，摇床振荡洗涤1min/次，最后一次尽量拍干残留的液体。
[0096]
3)标准品和样本准备：(封闭期间)。
[0097]
①
标准品：每个标准品浓度准备2个复孔，梯度选择用试剂稀释液按1:1梯度稀释标准品。1号孔取500μl的标准品原液，2-8号孔分别添加250μl的试剂稀释液，取1号孔的标准品原液250μl加入到2号孔，混匀，取混匀的2号孔中的250μl标准品到3号孔，依次类推的操作到第7孔，则标准品浓度从1号到7号依次稀释了2倍。
[0098]
②
样品：每个样品准备3个复孔。肿瘤组织蛋白，根据需要用试剂稀释液按适宜的比例稀释样本，以保证样本中免疫因子的浓度在检测范围之内。
[0099]
3)加标准品和样本：根据96孔板布局，在相应的孔中加标准品和样本，100μl/孔，摇床上混匀，湿盒中，室温孵育2h后，弃液，洗液洗5次，摇床振荡洗涤1min/次，最后一次尽量拍干残留的液体。
[0100]
4)加检测抗体(detection antibody)：用试剂稀释液按说明书上的稀释倍数稀释检测抗体，100μl/孔，湿盒中，室温孵育1h后，弃液，洗液洗5次，摇床振荡洗涤1min/次，最后一次尽量拍干残留的液体。
[0101]
5)加酶(streptavidin-hrp)：用试剂稀释液按说明书上的稀释倍数稀释streptavidin-hrp，100μl/孔，湿盒中，室温孵育30min，弃液，洗液洗7次，摇床振荡洗涤1min/次，最后一次尽量拍干残留的液体。
[0102]
6)显色：底物tmb，100μl/孔，湿盒中室温，避光，显色时间不超过30分钟。
[0103]
7)终止：终止液(2n h2so4)，50μl/孔，摇床上混匀，波长λ＝450nm读板。
[0104]
8)数据处理和作图。
[0105]
二、实时荧光定量pcr(realtime pcr)检测肿瘤组织内细胞因子基因表达水平试验包括：
[0106]
(1)总rna提取
[0107]
1)将肿瘤组织(约30～100mg)块放入液氮中速冻，取出充分剪碎研磨后每个肿瘤样品加入1mltotal rnaextraction reagent，肿瘤样品体积一般不要超过total rnaextraction reagent体积的10％。
[0108]
2)将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置5min以使核蛋白体完全解离。在4℃条件下，12000rpm，离心10min，取上清。
[0109]
3)向上述裂解液中加入1/5体积的氯仿。盖紧离心管盖，剧烈震荡15s，室温静置2-3min。在4℃条件下，12000rpm，离心15min，离心后混合物可分3层：上层无色水样层，中间层，下层红色有机苯酚氯仿层，rna存在于水样层中。如用1ml total rna extraction reagent提取，上层水相约为500-600μl。建议吸取400-500μl，不要吸得太完全，以防吸到中间层导致基因组污染。
[0110]
4)小心吸取上层水相至一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇。颠倒混匀后室
温放置10min。在4℃条件下，12000rpm，离心10min，弃上清。
[0111]
5)加入1ml用depc水配制的75％乙醇。充分洗涤管盖和管壁，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来。每使用1mltotal rnaextraction reagent用1ml 75％乙醇对沉淀进行洗涤。在4℃条件下，12000rpm，离心5min，弃去上清，注意不要丢失rna沉淀。重复该步骤一遍。
[0112]
6)室温放置1h左右晾干，加入30-100μl depc水(可在60℃水浴中预热)，待完全溶解后，取少量检测，其余在-80℃保存。
[0113]
(2)rna逆转录成cdna
[0114]
该步骤参照takara公司的prime script
tm rt master mix(货号rr036a)说明书操作。
[0115]
1)配制逆转录反应体系(反应体系需在冰上配置)
[0116]5×
primescript rt master mix2μltotal rnaxμl*rnase free ddh2o补足至10μl
[0117]
上述表格中*反应体系可按需求相应放大，10μl反应体系可最大使用500ng的total rna。
[0118]
2)轻柔混匀后，合成cdna，反应程序如下：
[0119]
37℃15min85℃5sec
[0120]
3)检测基因表达变化情况
[0121]
该步骤参照takara公司的tb green
tm premix ex taq
tm
(货号rr420a)说明书操作。
[0122]
1、反应体系配制(反应液配置在冰上操作)
[0123]
试剂体积tb green premix ex taq(2
×
)12.5μlforward primer(10μm)0.5μlreverse primer(10μm)0.5μl模板dnaxμl无菌超纯水补足至25μl
[0124]
2、反应程序步骤
[0125][0126]
[0127]
3、分析数据
[0128]
反应结束后确认real time pcr的扩增曲线及熔解曲线，进行标准曲线制作等。
[0129]
4、基因引物序列信息如下：
[0130]
引物引物(forward)引物(reverse)tnf-αcaggcggtgcctatgtctccgatcaccccgaagttcagtagil-1βgaaatgccaccttttgacagtgtggatgctctcatcaggacagil-6ctgcaagagacttccatccagagtggtatagacaggtctgttggil-4ggtctcaacccccagctagtgccgatgatctctctcaagtgatil-10cttactgactggcatgaggatcagcagctctaggagcatgtgg
[0131]
图8为elisa和rt-pcr对炎性因子的基因水平和蛋白水平的分析，图8可知，本技术的黄酮醇类化合物衍生物fd2020713与模型组相比，能够减少炎症因子tnf-α、il-1β、il-6的表达水平，增加抑炎因子il-4、il-10的表达水平，基于以上实验结果，表明本技术的黄酮醇类化合物衍生物fd2020713能够明显抑制炎症因子的释放，并且其抗炎效果显著优于阿司匹林组。
[0132]
实施例6
[0133]
本技术实施例提供了实施例2的三个组的肝脏和肾脏组织的病理变化试验，包括：
[0134]
将实施例2三个组的不同处理后的炎症相关结直肠癌(cac)小鼠安乐死后，收集其肝脏和肾脏组织进行石蜡包埋，通过he染色观察炎症相关结直肠癌(cac)小鼠肝脏和肾脏组织的病理学变化，结果如图9所示。
[0135]
其中，图9中，aom/dss组(模型组)：aom/dss诱导小鼠成瘤，每天生理盐水灌胃给药；aom/dss+fd2020713(给药组)：aom/dss诱导小鼠成瘤，每天fd2020713(80mg/kg)灌胃给药；aom/dss+aspirin(阳性对照组)：aom/dss诱导小鼠成瘤，每天阿司匹林(30mg/kg)灌胃给药。每组小鼠有10只，每个统计数据有3个重复。fd2020713：flavonol derivant 2020713，黄酮醇类化合物衍生物2020713；aspirin：阿司匹林。
[0136]
图9的组织病理学检测显示，各实验组肝小叶轮廓清晰完整，肝细胞索排列整齐，未见明显变性和坏死，肝窦清晰可见，未见明显淤血扩张；肾小球细胞未见增生，细胞形态正常，肾小管细胞未见水肿；肝脏和肾脏组织结构正常，未见明显病理学改变。
[0137]
综上所述，本技术实施例的黄酮化合物衍生物的合成原料来自于天然产物，制备合成方法简单，安全性高，产率较高，有利于工业化生产，具有应用推广的价值；本技术发现黄酮化合物衍生物fd2020713对炎症相关结直肠癌的防治效果显著优于现有的代表性阳性对照药阿司匹林，得到了本技术记载的详细的完整的实验数据，对于其他的肿瘤如：肝癌、胃癌(包括慢性萎缩性胃炎诱导的癌前病变)、肠癌(包括微卫星稳定和微卫星不稳定型)等也做了研究，但尚未形成详细的完整的实验数据，根据已有的数据表明，黄酮化合物衍生物fd2020713对防治肝癌、胃癌、肠癌等消化道肿瘤也有一定的效果，拥有良好的开发应用前景。
[0138]
以上所述仅是本技术的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本技术的保护范围。