专利名称：：环五肽人弹性蛋白酶抑制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一类环肽化合物，特别涉及一类具有抑制人弹性蛋白酶活性的环五肽化合物及其制备方法。技术背景自然界存在不同结构的环肽，大多环肽具有良好的生物活性，按成环的特点不同，不仅使其性质不同，也表现出不同的活性。以天然环肽作为结构模板，近年来人工合成出了结构和生物、生理活性不同的环肽类似物。环肽的活性主要表现为抗肿瘤、抗微生物、免疫抑制和酶抑制等活性。由于环肽结构中，没有确切的碳端和氮端，在体内不易降解，有较长的半衰期，表现出良好的酶稳定性，所以研究具有药用活性环肽化合物是目前发现新药的一种新的重要途径。人弹性蛋白酶是多形核白细胞因受炎症刺激而释放出的一种破坏性丝氨酸蛋白酶，由于能水解弹性蛋白、胶原蛋白以及粘蛋白等组织连接成分，破环胶原纤维及组织基底，从而可能与风湿性关节炎和肿瘤等疾病的形成相关。所以发现人弹性蛋白酶抑制剂就显得特别有价值。
发明内容本发明的目的之一是提供一类环五肽人弹性蛋白酶抑制剂。本发明的另一目的是提供该类环五肽人弹性蛋白酶抑制剂的制备方法。本发明所述的具有人弹性蛋白酶抑制活性的环五肽，由五个氨基酸彼此之间以肽键连接成环状结构，所述五个氨基酸选自芳基氨基酸、脂肪基氨基酸和环状氨基酸；且五个氨基酸相互独立，并非完全相同，按随机顺序排列。本发明所述的环五肽所包含的五个氨基酸中，一个为芳基氨基酸，一个环状氨基酸，其他为脂肪基氨基酸。所述五个氨基酸可以为D-型氨基酸。所述芳基氨基酸包括取代芳基氨基酸，所述芳基选自苯基、联苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、噻吩基、吡咯基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、吲哚基或苯并呋喃基等芳杂环所述取代芳基氨基酸的取代基选自^素、烷基、氨基、磺酰基、羟基、烷氧基、糖基、苄氧基，其中所述烷基选自6碳以下的垸基、环烷基、糖基、二甲氨基乙基、二乙氨基乙基、吡咯基乙基或哌啶基乙基；所述脂肪基氨基酸选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸等天然氨基酸或D-型非天然氨基酸；所述环状氨基酸选自脯氨酸、羟脯氨酸的一个。作为本发明的优选，所述芳基氨基酸中的芳基为喹啉基、苯基、4-卤代苯基、吲哚基；所述4-卤代苯基中的卤代基选自氟、氯、溴或碘；所述的环状氨基酸为脯氨酸，甲硫基脯氨酸。本发明所述的环五肽人弹性蛋白酶抑制剂，具有式(I)结构，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(I)其中:Ar为芳基或取代芳基，芳基包括苯基、联苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、噻吩基、吡咯基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、吲哚基或苯并呋喃基等芳杂环基;取代芳基中的取代基包括卤素、烷基、烷硫基、氨基、硝基、酰基、磺酰基、羟基、烃氧基、糖苷基、二甲氨基乙氧基、二乙氨基乙氧基等；R,R4各自为独立的异丙基、异丁基、仲丁基、甲基、羟基烷基、氨基烷基、胍基烷基、羧基垸基、氨甲酰垸基、羧甲基或等；R、R、各自为独立氢、甲基或乙基等。Y为氢、甲氧基本发明所述环五肽人弹性蛋白酶抑制剂的制备采用液相合成方法实现的，其策略为Boc保护技术，合成路线为2+3的会聚式，肽链的增长使用HBTU或HATU或HCTU或PyBOP等作为縮合剂。以喹啉丙-亮-亮-缬-脯环五肽为例，其合成过程包括如下步骤(1)三肽片段的合成(3)五肽的合成和环合反应:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本发明所述的环五肽人弹性蛋白酶抑制剂对人弹性蛋白酶显示出良好的性。表l给了出几个代表化合物的ICs。值。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。实例1亮-亮-缬-脯-喹啉丙环五肽的合成1)脯-喹啉丙氨酸二肽甲酯的合成。将2腿olBoc-脯氨酸和2咖olHBTU、4raraolDIPEA加入到盛有30mLTHF和6mLDMF溶液的100mL单口瓶中搅拌溶解，然后再加入1臓olL-喹啉丙氨酸甲酯，于室温下搅拌反应过夜。反应液浓縮除去大部分溶剂，残余物用乙酸乙酯溶解后，分别用水、5%NaHC03、饱和NaCl各洗2次，有机相用无水Na2S04干燥。过滤，浓縮，重结晶得类白色固体产物，产率为89%。然后将此溶解到30mL二氯甲垸和30mL三氟醋酸中，于室温下搅拌反应45min。减压除去DCM和TFA，即得产物脯-喹啉丙氨酸二肽甲酯粗产品。2)Boc-亮-亮-缬三肽的合成。在盛有30mLTHF和5mLDMF溶液的100mL单口瓶中，加入2ramolBoc-亮氨酸和2ramolHBTU以及4mmolDIPEA，搅拌15min,而后再加入lmmol的缬氨酸甲酯，并于室温搅拌过夜。反应液浓縮，在所得残余物中加入50mL水，用乙酸乙酯萃取，合并有机相。分别用水、5%NaHC0:1、2%HC1、饱和NaCl各洗有机相2次，无水^2504干燥。过滤，浓縮。在剩余物中加入30mLDCM和20mLTFA，室温下搅拌反应45min。减压除去DCM和TFA，得亮-缬氨酸甲酯三氟醋酸盐。将此盐溶于30mLTHF和5mLDMF，此后加入2mmolBoc-亮氨酸和2mmolHBTU以及4mmol的DIPEA，搅拌过夜。反应液浓縮，在所得残余物中加入水，用80mL乙酸乙酯萃取5次，有机相分别用水、5%NaHC03、2%HC1、饱和NaCl各洗2次，无水Na2S04干燥。过滤、浓縮，产物经重结晶纯化，得固体产物，收率83.5%。用17.5mLTHF溶解所得固体，并转移到盛有5腿olLiOH与2.5mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌反应8h。减压除去THF，加入20mL水，用2。/。稀盐酸调节溶液的pH至4.5-6，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水Na2S04干燥。过滤，浓縮，即得Boc-亮-亮-缬三肽粗产品，无需纯化既可用于下一步反应。3)亮-亮-缬-脯-喹啉丙五肽的合成。在盛有1.lmmolBoc-亮-亮-缬三肽的30mLTHF和6mLDMF溶液中，先加入2.5mmolHATU以及5咖ol的DIPEA，搅拌10min后，再加入1mmol脯-喹啉丙氨酸二肽甲酯，于室温条件下搅拌反应过夜，用TLC检测反应。减压浓縮，浓縮残余物中加水80mL，用乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。依次用水、5%NaHC03、2%盐酸和饱和食盐水各洗两次，无水硫酸钠干燥。抽滤，减压除去溶剂，重结晶得Boc-亮-亮-缬-脯-喹啉丙氨酸五肽甲酯，收率83.8%。用30mLTHF溶解所得固体，并转移到盛有5mmolLiOH与4mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌反应8h。用TLC跟踪反应，待反应结束后减压除去THF。在残余物中加水30mL，用稀盐酸调pH二34，300mL乙酸乙酯萃取四次，合并有机相，无水硫酸钠干燥。减压浓縮获得Boc-亮-亮-缬-脯-喹啉丙五肽后，溶解到30mL二氯甲垸和30mL三氟乙酸的溶液中，常温搅拌反应2h。减压除去二氯甲烷和三氟乙酸，即得亮-亮-缬-脯-喹啉丙五肽。4)亮-亮-缬-脯-喹啉丙环五肽的合成。0.5mmol脯-亮-缬_亮-喹啉丙五肽加入到单口瓶中，溶解于30mLN,N-二甲基甲酰胺和270mL二氯甲烷中。随着搅拌，加入2.5ramolPyB0P、0.5,olHATU、6mmol二异丙基乙胺，常温搅拌反应39h，用TLC检测反应。减压除去溶剂，残余液用乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。依次用水、5%NaHC03、2%盐酸和饱和食盐水各洗两次，无水硫酸钠干燥。抽滤，浓縮除去溶剂。经硅胶柱层析纯化，得到脯-亮-缬-亮氨酸-喹啉丙氨酸环肽，收率58.5%。'H丽R(500MHz,CDC13)50.90—0.92(m，6H),0.96(d,J=7,5Hz，6H)，1.05—1.08(d，J=7.0Hz，6H)，1.40-1.42(m，1H),1.45-1.48(m，2H)，1.56-1.58(m，2H)，1.73—1.76(m，1H)，1.94—1.96(m，1H)，1.90(m,1H)，1.98(ddd，J=3.4Hz，1H)，2.10—2.12(m，1H),2.26(m，1H)，3.22(dd，J=13.OHz，5.5Hz,1H)，3.32(t，J二7.5Hz，1H),3.62(dd，J=5.0Hz，2H)，4.06(t，J=7.5Hz，1H)，4.15(dd,J=6.5Hz，1H)，4.38(dd,J=10.5Hz，6Hz，1H)，4.40(t，J=8.0Hz，1H)，4.81(dd,J二9.OHz,3.OHz，1H)，6.68(brs，1H),6.92(brs，1H)，7.28(d，lH)，7.53(t,1H)，7.71(d，1H),7.80(d，1H)，7.98(d，1H)，8.13(d，lH)，8.35(m，2H);HRMS(ESI，M+l)匚凡晶05，计算值为620.3686,实测值为620.3678。实例2脯-亮-缬-亮-色环五肽的合成1)亮-色氨酸二肽甲酯的合成。将2mmolBoc-亮氨酸和2mmolHBTU、4腿olDIPEA加入到盛有30mLTHF和6mLDMF溶液的100mL单口瓶中搅拌溶解，然后再加入1mmolL-色氨酸甲酯，于室温下搅拌反应过夜。反应液浓縮除去大部分溶剂，残余物用乙酸乙酯溶解后，分别用水、5%NaHC03、饱和NaCl各洗2次，有机相用无水Na2S04干燥。过滤，浓縮，重结晶得类白色固体产物，产率为89%。然后将此溶解到40mL二氯甲烷和40mL三氟醋酸中，于室温下搅拌反应45min。减压除去DCM和TFA，即得产物亮-色氨酸二肽甲酯粗产品。2)Boc-脯-亮-缬三肽的合成。在盛有30mLTHF和5mLDMF溶液的100mL单口瓶中，加入2mmolBoc-亮氨酸和2腿olHBTU以及4mmolDIPEA，搅拌15min，而后再加入lmmol的缬氨酸甲酯，并于室温搅拌过夜。反应液浓縮，在所得残余物中加入50mL水，用乙酸乙酯萃取，合并有机相。分别用水、5%NaHCO:,、2%HC1、饱和NaCl各洗有机相2次，无水化2504千燥。过滤，浓縮。在剩余物中加入30mLDCM和20mLTFA，室温下搅拌反应45min。减压除去DCM和TFA，得亮-缬氨酸甲酯三氟醋酸盐。将此盐溶于30mLTHF和5mL匿F，此后加入2mmolBoc-脯氨酸和2mmolHBTU以及4mmol的DIPEA，搅拌过夜。反应液浓縮，在所得残余物中加入水，用80mL乙酸乙酯萃取5次，有机相分别用水、5%NaHC0:、、2%HC1、饱和NaCl各洗2次，无水Na2S0,干燥。过滤、浓縮，产物经重结晶纯化，得固体产物，收率80.5%。用30mLTHF溶解所得固体，并转移到盛有5mmolLiOH与2.5mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌反应8h。减压除去THF，加入20mL水，用2y。稀盐酸调节溶液的pH至4.5-6，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水Na2S0^干燥。过滤，浓縮，即得Boc-脯-亮-缬三肽粗产品，无需纯化既可用于下一步反应。3)脯-亮-缬-亮-色五肽的合成。在盛有l.lmmolBoc-脯-亮-缬三肽的30mLTHF和6mLDMF溶液中，先加入2.5mmolHATU以及5mmol的DIPEA，搅拌lOmin后，再加入1mmol亮-色氨酸二肽甲酯，于室温条件下搅拌反应过夜，用TLC检测反应。减压浓縮，浓縮残余物中加水80mL，用乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。依次用水、5%NaHC03、2%盐酸和饱和食盐水各洗两次，无水硫酸钠干燥。抽滤，减压除去溶剂，重结晶得Boc-脯-亮-缬-亮-色氨酸五肽甲酯，收率86%。用30mLTHF溶解所得固体，并转移到盛有5mmolLiOH与4mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌反应9h。用TLC跟踪反应，待反应结束后减压除去THF。在残余物中加入30mL水，用稀盐酸调pH=4，300mL乙酸乙酯萃取四次，合并有机相，无水Na2S0^干燥。减压浓縮获得Boc-脯-亮-缬-亮-色五肽后，溶解到40mL二氯甲垸和30mL三氟乙酸的溶液中，常温搅拌反应2h。减压除去二氯甲烷和三氟乙酸，即得脯-亮-缬-亮-色五肽。4)脯-亮-缬-亮-色环五肽的合成。0.5mmol脯-亮-缬-亮-色五肽加入到单口瓶中，溶解于30mLN，N-二甲基甲酰胺和270mL二氯甲烷中。随着搅拌，加入2.5mmolPyB0P、0.5mmolHATU、6mmol二异丙基乙胺，常温搅拌反应39h，用TLC检测反应。减压除去溶剂，残余液用乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。依次用水、5%NaHC03、2°/。盐酸和饱和食盐水各洗两次，无水Na2S04干燥。抽滤，浓縮除去溶剂。经硅胶柱层析纯化，得到脯-亮-缬-亮-色环肽，收率54.4%。画R(500MHz,CDC13)50.84-0.90(m,6H)，0.93(m，6H)，0.98(m，6H),1.43-1.46(m，1H),1.48-1.51(m,2H),1.53-1.55(m,2H),1.75-1.780(m,1H),1.89(m,1H)，1.95(m,1H)，2.01(m,1H),2.06(m，1H),2.26(m,1H),3.16(m，1H),3.42(m,1H)，3.53(m,1H),4.02-4.11(m,1H)，4.23(br,1H)，4.44(t,J=6Hz,1H),4.95(m,1H)，5.24(dd，J=9.0Hz,3.0Hz,1H)，7.19(br,lH)，7.23(m,2H),7.30(m,3H),7.47(d，1H),7.58(d，1H)，7.91(d，1H)，8.13(d，1H)，8.60(d，1H);HRMS(ESI,M+l)C33H48N605，计算值为608.3686,实测值为608.3669。实例3人体白细胞弹性蛋白酶抑制活性实验以化学标记的多肽-nitroanilide为底物，利用水解后的产物nitroanilide在405nm处特征吸收，通过测定酶反应前后广吸收值的变化，确定人体白细胞弹性蛋白酶的活性。作用过程为多lfciiitroan.iBifc-*.多妝+践if微錢'nilide样品抑制活性测试过程在96孔板的样品空中加入样品的DMS0溶液、白细胞弹性蛋白酶液和缓冲溶液100ia，对照孔用DMSO代替样品溶液；空白孔用DMSO代替溶液，用缓冲液代替酶液。使用Victo1420多功能测定仪在410nm波长下，读取每孔的A值(本底A1)。各孔加入底物溶液IOOy1，37°C反应2h后，再次读取每孔的A值(A2)，并计算样品的抑制率。公式样品擁率,H:^lg:比mil",显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。权利要求1、环五肽人弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，其由五个氨基酸彼此之间以肽键连接成环状结构，所述五个氨基酸选自芳基氨基酸、脂肪基氨基酸和环状氨基酸；且五个氨基酸相互独立，并非完全相同，按随机顺序排列。2、如权利要求1所述的环五肽人弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述五个氨基酸中，一个芳基氨基酸，一个环状氨基酸，其他为脂肪基氨基酸和官能团取代的脂肪基氨基酸。3、如权利要求2所述的环五肽人弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述五个氨基酸为D-型氨基酸。4、如权利要求2所述的环五肽人弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述芳基氨基酸包括取代芳基氨基酸；所述芳基选自苯基、联苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、噻吩基、吡咯基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、吲哚基或苯并呋喃基等芳杂环基；所述取代芳基氨基酸的取代基选自卤素、垸基、氨基、磺酰基、羟基、烷氧基、糖基、苄氧基，其中所述烷基选自6碳以下的垸基、环烷基、糖基、二甲氨基乙基、二乙氨基乙基、吡咯基乙基或哌啶基乙基；所述脂肪基氨基酸或官能团取代的脂肪基氨基酸选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸等天然氨基酸或D-型非天然氨基酸；5、如权利要求2所述的环五肽人弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述环状氨基酸选自脯氨酸、羟脯氨酸的一个。6、如权利要求4所述的环五肽人弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述芳基氨基酸中的芳基为喹啉基、苯基、4-卤代苯基、H引哚基；所述4-卣代苯基中的卤素选自氟、氯、溴或碘；所述的环状氨基酸为脯氨酸，甲硫基脯氨酸。7、如权利要求4所述的环五肽人弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，其具有式(I)结构，其中Ar为芳基或取代芳基，芳基包括苯基、联苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、噻吩基、吡咯基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、吲哚基或苯并呋喃基等芳杂环基；取代芳基中的取代基包括卤素、烷基、垸硫基、氨基、硝基、酰基、磺酰基、羟基、烃氧基、糖苷基、二甲氨基乙氧基、二乙氨基乙氧基；R广R4各自为独立的异丙基、异丁基、甲基、氨基烷基、胍基烷基、羧基烷基、氨甲酰烷基、羧甲基或羟基烷基中的一种；R、R、各自为独立氢、甲基或乙基中的'种；Y为氢或甲氧基。8、如权利要求7所述的环五肽人弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，其具有以下结构9、如权利要求7所述的环五肽人弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，表现出良好的抑制人体弹性蛋白酶的活性。10、一种如权利要求1至9所述的环五肽人弹性蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)三肽片段的合成:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(2)二肽片段的合成:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(3)五肽的合成和环合反应:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage5</image>其中-Ar为芳基或取代芳基，芳基包括苯基、联苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、噻吩基、吡咯基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、吲哚基或苯并呋喃基等芳杂环基中的一种；取代芳基中的取代基包括卤素、烷基、烷硫基、氨基、硝基、酰基、磺酰基、羟基、烃氧基、糖苷基、二甲氨基乙氧基、二乙氨基乙氧基中的一种;R广R4各自为独立的异丙基、异丁基、甲基、氨基烷基、胍基烷基、羧基烷基、氨甲酰垸基、羧甲基或羟基烷基中的一种；R、广R、5各自为独立氢、甲基或乙基中的一种。全文摘要本发明公开了一类环五肽人弹性蛋白酶抑制剂，该类环五肽人弹性蛋白酶抑制剂由五个氨基酸彼此之间以肽键连接成环状结构，其中五个氨基酸选自芳基氨基酸、脂肪基氨基酸和环状氨基酸，且五个氨基酸相互独立，并非完全相同，按随机顺序排列。本发明所述的环五肽人弹性蛋白酶抑制剂对人弹性蛋白酶显示出良好的活性。文档编号C07K1/06GK101575362SQ20091007428公开日2009年11月11日申请日期2009年5月6日优先权日2009年5月6日发明者刘守信,王江超,霞田,胡素坤,亮陈,韩建荣申请人:河北科技大学