1.本发明涉及干细胞与再生医学领域，具体涉及一种用于牙髓干细胞分离的试剂盒及其应用。


背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是一种成体干细胞，可以在体外培养扩增，具有多向分化潜能，在临床上具有广阔的应用前景，是再生医学和组织工程领域中最重要、并极具研究潜力的种子细胞。间充质干细胞最早被发现于骨髓组织中，随着研究的深入，在人体多种组织中也相继被发现，如牙髓、脐带、胎盘、脂肪等。
3.牙髓干细胞(dental pulp stem cells，dpscs)作为一种间充质干细胞，不仅具有与其他间充质干细胞一样的良好增殖分化能力和多向分化潜能，同时无胚胎干细胞的致瘤性，并且来源丰富、取材过程中避免了对人体的二次创伤和伦理法律问题。
4.然而，现有的牙髓干细胞分离方法存在许多不足。牙齿位于口腔中，而口腔中的细菌种类繁杂，牙髓干细胞在分离制备及培养过程中极易污染，导致牙髓干细胞细胞纯度和分离效率较低，分离提取出来的牙髓干细胞数量较少，细胞增殖缓慢，从而导致牙髓干细胞分离制备困难，这也是目前存储牙髓干细胞遇到的最大难题。因此，在分离制备牙髓干细胞的过程中通常选择加入抗生素以抑制细菌的繁殖，减少牙髓干细胞的污染。在牙髓干细胞的分离制备以及培养中常使用由青霉素和链霉素组成的双抗，但是双抗的应用并不能确保牙髓干细胞不被污染。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种用于牙髓干细胞分离的试剂盒及其应用，以降低牙髓干细胞分离制备过程中被污染的风险，提高了牙髓干细胞的纯度和获得率。
6.根据本发明的第一方面，提供一种用于牙髓干细胞分离的试剂盒，该试剂盒至少包括牙髓组织保护液和牙髓组织清洗液；
7.牙髓组织保护液含有psn抗生素组合物、血小板裂解液、l-谷氨酰胺、d-葡萄糖、丙酮酸钠、碳酸氢钠和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，且该牙髓组织保护液的ph值为7.2
±
0.2；
8.牙髓组织清洗液为含有psn抗生素组合物的生理盐水。
9.psn(penicillin-streptomycin-neomycin)抗生素组合物是一种由青霉素、链霉素和新霉素组成的抗生素组合物。青霉素属于β-内酰胺类抗生素，其分子中含有青霉烷，能够破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用，但青霉素的抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效。链霉素是一种氨基糖苷类抗生素，分子式为c
21h39
n7o
12
，主要针对革兰氏阴性菌，其对革兰氏阳性菌的抑制作用较差，此外，链霉素还能够在一定程度上影响支原体蛋白质的合成，对支原体具有一定的抑制作用。新霉素也是一种氨基糖苷类抗生素，其抗菌谱较广，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌皆有较好的抑制效果。
10.血小板裂解液中含有很多不同种类的细胞生长因子，有利于促进牙髓干细胞的生长。
11.l-谷氨酰胺则有利于维持牙髓干细胞的生长，在缺少谷氨酰胺时，细胞会因生长不良而死亡。本发明提供的试剂盒中，牙髓组织保护液含有l-谷氨酰胺有利于牙齿的保存和运输，使得牙髓干细胞能够保持较好的活性。
12.d-葡萄糖则能够为牙髓干细胞提供营养，有效减轻牙髓干细胞在运输过程中的细胞损伤。
13.丙酮酸钠主要起到替代碳源的作用，参与牙髓干细胞的营养代谢，有利于保持牙髓干细胞在运输过程中的细胞活性。
14.碳酸氢钠和hepes(主要成分为羟乙基哌嗪乙硫磺酸)同时使用则使得牙髓组织保护液具有良好的缓冲能力，防止牙髓组织保护液的ph波动，使其维持在恒定的范围，有利于牙髓干细胞运输过程中细胞活性的维持。
15.本发明提供的用于牙髓干细胞分离的试剂盒，该试剂盒中包括牙髓组织保护液和牙髓组织清洗液。牙髓组织保护液中含有psn抗生素组合物、血小板裂解液、l-谷氨酰胺、d-葡萄糖、丙酮酸钠、碳酸氢钠和hepes，能够有效地避免了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌污染，在一定程度上还能降低真菌或支原体污染的风险，同时还能减少运输过程中的细胞损伤，维持牙髓干细胞在运输中的细胞活性。牙髓组织清洗液中含有的psn抗生素组合物，对牙髓组织进行清洗时能够对细菌进行抑制；而生理盐水的渗透压与牙髓干细胞内外渗透压一样，使得牙髓干细胞能够维持合适的渗透压，避免出现由于吸水或脱水导致的细胞破裂，有利于在牙髓组织清洗过程中维持牙髓干细胞的生理活性。因此，本发明提供的用于牙髓干细胞分离的试剂盒能够降低牙髓干细胞在运输以及分离制备过程中被污染的风险，提高牙髓干细胞的纯度和分离效率，使得分离提取出来的牙髓干细胞数量增加，并有利于后续牙髓干细胞培养过程中快速增殖，为有效分离制备和存储牙髓干细胞提供了一定的理论指导。
16.优选地，牙髓组织保护液中psn抗生素组合物的体积分数为0.5～2％。
17.优选地，牙髓组织清洗液中psn抗生素组合物的体积分数为0.5～2％。
18.优选地，牙髓组织保护液中血小板裂解液的体积分数为5～20％。
19.优选地，牙髓组织保护液中l-谷氨酰胺的浓度为350～400mg/l。
20.优选地，牙髓组织保护液中d-葡萄糖的浓度为3000～3200mg/l。
21.优选地，牙髓组织保护液中丙酮酸钠的浓度为50～60mg/l。
22.优选地，牙髓组织保护液中碳酸氢钠的浓度为1200mg/l。
23.优选地，牙髓组织保护液中hepes的浓度为15mm。
24.根据本发明的第二方面，提供一种牙髓干细胞的分离制备方法，包括以下步骤：
25.(1)牙齿的采集和保存：采集牙齿，在4℃条件下保存于上述组织保护液中；
26.(2)消毒清洗：利用消毒液对牙齿进行消毒，随后将消毒后的牙齿用上述牙髓组织清洗液进行清洗；
27.(3)分离：破开牙冠，取出牙髓组织，并用上述牙髓组织清洗液清洗牙髓组织；
28.(4)消化：将清洗后的牙髓组织移入牙髓干细胞组织消化液中，将组织切碎，消化至肉眼看不到明显的组织块为止，组织消化液含有胶原酶ⅰ和中性蛋白酶ⅱ；
29.(5)收集和洗涤：收集单个细胞，并利用上述牙髓组织保护液洗涤以除去胶原酶ⅰ和中性蛋白酶ⅱ，得到所述牙髓干细胞。
30.优选地，上述步骤(2)中，消毒液为稀释50倍的84消毒液。本方案使用的84消毒液能够杀灭牙齿中的部分细菌，同时相对较温和。
31.优选地，上述步骤(4)中，消化的温度为37℃，消化的时间为2h。
32.优选地，上述步骤(4)中，组织消化液由0.3％胶原酶ⅰ和0.4％中性蛋白酶ⅱ的按照1:1的比例混合配制而成。本方案采用胶原酶和中性蛋白酶的联合使用，优化这两种酶的最佳浓度和混合比，使得利用这两种酶进行消化后得到的组织块体积较小，酶解时间相对较短，有利于提高牙髓组织的消化效率，保留更高的细胞活力。
33.本发明的有益效果为：本发明提供了一种用于牙髓干细胞分离的试剂盒，将该试剂盒用于牙髓干细胞的分离制备中，同时通过对牙齿消毒清洗方法的调整，使用胶原酶和中性蛋白酶对牙髓组织进行消化，能够有效降低牙髓干细胞分离制备过程中被污染的风险，有利于促进牙髓干细胞的爬出，提高牙髓干细胞的纯度和获得率，有利于后续牙髓干细胞培养过程中的增殖，为工业上高效分离制备牙髓干细胞提供了理论指导。
附图说明
34.图1为本发明分离制备得到的牙髓干细胞原代培养细胞刚贴壁时的状态图。
35.图2为本发明分离制备得到的牙髓干细胞原代培养融合度达到90％时的贴壁状态图。
具体实施方式
36.下面结合具体实施方式对本发明提供的技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.实施例1-3
38.一种牙髓组织保护液，其成分如表1所示，制备方法包括以下步骤：将350～400mg/l l-谷氨酰胺、3000～3200mg/l d-葡萄糖、50～60m/l丙酮酸钠、1200mg/l碳酸氢钠和15mm hepes(ph7.2
±
0.2)混合均匀，向其中添加0.5～2％(体积分数)psn抗生素组合物(青霉素-链霉素-新霉素)、5～20％(体积分数)血小板裂解液，混合均匀，并用0.22μm滤膜过滤除菌，得到牙髓组织保护液。
39.表1牙髓组织保护液的组分
40.41.实施例4-6
42.一种牙髓组织清洗液，其成分如表2所示，制备方法包括以下步骤：向生理盐水中添加0.5～2％psn抗生素组合物(青霉素-链霉素-新霉素)，混合均匀，并用0.22μm滤膜过滤除菌，得到牙髓组织清洗液。
43.表2牙髓组织清洗液的组分
44.组别psn抗生素组合物(％)实施例40.5实施例51实施例62
45.实施例7
46.一种牙髓干细胞的分离制备方法，具体包括以下步骤：
47.(1)牙齿的采集和保存：针对脱落乳牙的青少年或者需要拔出智齿的成年人进行捐献或保存宣传，采集志愿者外周血样本进行病毒学检测，确定合格后采集健康志愿者牙齿，保存于实施例1所得到的组织保护液中4℃冷藏运输至无菌实验室；
48.(2)消毒清洗：在无菌实验室中用手术刀片刮掉牙齿表面黏连的组织和杂质，将牙齿用稀释50倍的84消毒液消毒三次，消毒总时长为1min，随后将消毒后的牙齿用实施例4所得到的组织清洗液清洗三次；
49.(3)分离将消毒后的牙齿放入无菌袋中，用医用小锤子破开牙冠，暴露牙髓腔，取出牙髓组织，用实施例4所得到的组织清洗液清洗牙髓组织三次：
50.(4)消化：将清洗后的牙髓组织置于空培养皿中，加入几滴组织消化液，用手术刀片将牙髓组织尽可能切碎，然后转移到15ml离心管中，于37℃培养箱中消化2h，每隔20min摇晃一次，直至肉眼看不到明显的组织块为止，其中，组织消化液由0.3％胶原酶ⅰ和0.4％中性蛋白酶ⅱ的按照1:1的比例混合配制而成。
51.(5)收集和洗涤：消化完毕后，离心管于1000rpm下离心5min，舍弃上清，收集单个细胞和少量消化不完全的牙髓组织，向离心管中加入实施例1所得到的组织保护液，于1000rpm下离心5min，以彻底除去消化酶，重复洗涤步骤一次，得到牙髓干细胞。
52.实施例8
53.一种牙髓干细胞的分离制备方法，具体包括以下步骤：
54.(1)牙齿的采集和保存：针对脱落乳牙的青少年或者需要拔出智齿的成年人进行捐献或保存宣传，采集志愿者外周血样本进行病毒学检测，确定合格后采集健康志愿者牙齿，保存于实施例2所得到的组织保护液中4℃冷藏运输至无菌实验室；
55.(2)消毒清洗：在无菌实验室中用手术刀片刮掉牙齿表面黏连的组织和杂质，将牙齿用稀释50倍的84消毒液消毒三次，消毒总时长为1min，随后将消毒后的牙齿用实施例5所得到的组织清洗液清洗三次；
56.(3)分离将消毒后的牙齿放入无菌袋中，用医用小锤子破开牙冠，暴露牙髓腔，取出牙髓组织，用实施例5所得到的组织清洗液清洗牙髓组织三次：
57.(4)消化：将清洗后的牙髓组织置于空培养皿中，加入几滴组织消化液，用手术刀片将牙髓组织尽可能切碎，然后转移到15ml离心管中，于37℃培养箱中消化2h，每隔20min摇晃一次，直至肉眼看不到明显的组织块为止，其中，组织消化液由0.3％胶原酶ⅰ和0.4％
中性蛋白酶ⅱ的按照1:1的比例混合配制而成。
58.(5)收集和洗涤：消化完毕后，离心管于1000rpm下离心5min，舍弃上清，收集单个细胞和少量消化不完全的牙髓组织，向离心管中加入实施例2所得到的组织保护液，于1000rpm下离心5min，以彻底除去消化酶，重复洗涤步骤一次，得到牙髓干细胞。
59.实施例9
60.一种牙髓干细胞的分离制备方法，具体包括以下步骤：
61.(1)牙齿的采集和保存：针对脱落乳牙的青少年或者需要拔出智齿的成年人进行捐献或保存宣传，采集志愿者外周血样本进行病毒学检测，确定合格后采集健康志愿者牙齿，保存于实施例3所得到的组织保护液中4℃冷藏运输至无菌实验室；
62.(2)消毒清洗：在无菌实验室中用手术刀片刮掉牙齿表面黏连的组织和杂质，将牙齿用稀释50倍的84消毒液消毒三次，消毒总时长为1min，随后将消毒后的牙齿用实施例6所得到的组织清洗液清洗三次；
63.(3)分离将消毒后的牙齿放入无菌袋中，用医用小锤子破开牙冠，暴露牙髓腔，取出牙髓组织，用实施例6所得到的组织清洗液清洗牙髓组织三次：
64.(4)消化：将清洗后的牙髓组织置于空培养皿中，加入几滴组织消化液，用手术刀片将牙髓组织尽可能切碎，然后转移到15ml离心管中，于37℃培养箱中消化2h，每隔20min摇晃一次，直至肉眼看不到明显的组织块为止，其中，组织消化液由0.3％胶原酶ⅰ和0.4％中性蛋白酶ⅱ的按照1:1的比例混合配制而成。
65.(5)收集和洗涤：消化完毕后，离心管于1000rpm下离心5min，舍弃上清，收集单个细胞和少量消化不完全的牙髓组织，向离心管中加入实施例3所得到的组织保护液，于1000rpm下离心5min，以彻底除去消化酶，重复洗涤步骤一次，得到牙髓干细胞。
66.对比例1
67.一种牙髓干细胞分离制备用组织保护液，制备方法包括以下步骤：将365mg/l l-谷氨酰胺、3151mg/l d-葡萄糖、55m/l丙酮酸钠、1200mg/l碳酸氢钠和15mm hepes(ph7.2
±
0.2)混合均匀，向其中添加1％(体积分数)双抗(青霉素-链霉素)、10％(体积分数)血小板裂解液，混合均匀，并用0.22μm滤膜过滤除菌，得到牙髓组织保护液。
68.对比例2
69.一种牙髓组织清洗液，制备方法包括以下步骤：向生理盐水中添加1％双抗(青霉素-链霉素)，混合均匀，并用0.22μm滤膜过滤除菌，得到牙髓组织清洗液。
70.对比例3
71.一种牙髓干细胞的分离制备方法，具体包括以下步骤：
72.(1)牙齿的采集和保存：针对脱落乳牙的青少年或者需要拔出智齿的成年人进行捐献或保存宣传，采集志愿者外周血样本进行病毒学检测，确定合格后采集健康志愿者牙齿，保存于对比例1所得到的组织保护液中4℃冷藏运输至无菌实验室；
73.(2)消毒清洗：在无菌实验室中用手术刀片刮掉牙齿表面黏连的组织和杂质，将牙齿用稀释50倍的84消毒液消毒三次，消毒总时长为1min，随后将消毒后的牙齿用对比例2所得到的组织清洗液清洗三次；
74.(3)分离将消毒后的牙齿放入无菌袋中，用医用小锤子破开牙冠，暴露牙髓腔，取出牙髓组织，用对比例2所得到的组织清洗液清洗牙髓组织三次：
75.(4)消化：将清洗后的牙髓组织置于空培养皿中，加入几滴组织消化液，用手术刀片将牙髓组织尽可能切碎，然后转移到15ml离心管中，于37℃培养箱中消化2h，每隔20min摇晃一次，直至肉眼看不到明显的组织块为止，其中，组织消化液由0.3％胶原酶ⅰ和0.4％中性蛋白酶ⅱ的按照1:1的比例混合配制而成。
76.(5)收集和洗涤：消化完毕后，离心管于1000rpm下离心5min，舍弃上清，收集单个细胞和少量消化不完全的牙髓组织，向离心管中加入对比例1所得到的组织保护液，于1000rpm下离心5min，以彻底除去消化酶，重复洗涤步骤一次，得到牙髓干细胞。
77.在t25培养瓶中加入3ml matrigel胶溶液(matrigel胶溶液由含有1％matrix的dmem培养基组成)，放入37℃培养箱中孵育30min，成为牙髓干细胞专用培养瓶。
78.牙髓干细胞培养基为添加如下成分的dmem培养基：1％抗生素组合物(青霉素-链霉素)、10％血小板裂解液、0.2％egf溶液(100ng/ml)、0.2％bfgf溶液(100ng/ml)和0.5％glutamax
tm
(含有l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的添加剂)。
79.表3牙髓干细胞的污染情况统计表
[0080][0081][0082]
将实施例7-9和对比例3所得到的牙髓干细胞用5ml牙髓干细胞培养基进行重悬，转移到上述铺好胶的t25培养瓶中，置于37℃培养箱中进行培养(牙髓干细胞刚贴壁时的状态如图1所示)，待原代培养达到融合度90％时进行传代培养(牙髓干细胞原代培养融合度达到90％时的状态如图2所示)，由图1和图2可知，分离制备得到的牙髓干细胞和经过原代培养的牙髓干细胞大小均匀、呈长梭型，鲜少见到分支状细胞，符合干细胞的形态特征，说明分离制备得到的牙髓干细胞并没有出现体积变大等异常现象，活性较强。随后每3天传代一次，传代比例为1:3，进行培养观察，观察细胞是否发生污染，结果如表3所示。由表3的污染情况统计结果可知，利用不同浓度的psn抗生素组合物制备组织保护液和组织清洗液，用于分离制备牙髓干细胞，能够有效降低牙髓干细胞被污染的风险，有利于提高牙髓干细胞的纯度和获得率，还有利于牙髓干细胞后续培养过程中的快速增殖。
[0083]
表4牙髓干细胞的表面标记物分析结果
[0084][0085]
此外，取第3代(p3)的牙髓干细胞，利用流式细胞技术对牙髓干细胞的表面标记物cd73、cd105、cd90、cd44、cd34、cd19、hla-dr、cd45、cd11b进行分析鉴定，结果如表4所示。由表4的表面标记物分析结果可知，本发明实施例7-9和对比例3培养至第3代的牙髓干细胞纯度高，牙髓干细胞表面标志cd73、cd105、cd90、cd44阳性指标表达率均在95％以上，阴性指标表达率低于2％，符合国际间充质干细胞的标准，对工业化生产牙髓间充质干细胞具有指导作用，并且实施例7-9的牙髓干细胞纯度高于对比例3的牙髓干细胞纯度。
[0086]
同时检测实施例7-9和对比例3的活细胞数量、总细胞数量，每组试验重复3次，取平均值，结果如表5所示。根据以下公式计算细胞活率：细胞活率＝(活细胞数量/总细胞数量)
×
100％。由表5的牙髓干细胞活率检测结果可知，实施例7-9的活细胞数量及细胞活率显著高于对比例3，牙髓干细胞活率在96％以上。虽然对比例3的细胞活率也较高，但其活细胞数量及总细胞数量均较低。
[0087]
表5牙髓干细胞活率检测结果
[0088]
组别活细胞数量(
×
107)总细胞数量(
×
107)细胞活率(％)实施例74.324.4696.9实施例84.604.7397.2实施例94.454.6196.5对比例33.143.6586.0
[0089]
综上所述，将本发明提供的用于牙髓干细胞分离的试剂盒，用于牙髓干细胞的分离制备中，能够有效降低牙髓干细胞被污染的风险，从而提高牙髓干细胞的获得率和纯度，有利于提高培养过程中牙髓干细胞的细胞活率。
[0090]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。