一种nk细胞扩增用培养基及培养方法
技术领域
1.本发明涉及免疫细胞领域，尤其涉及一种nk细胞扩增用培养基及培养方法。


背景技术：

2.自然杀伤细胞( natural killer cell，nk细胞)来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。nk细胞自产生具备能够准确区分自身和外界的能力，及时找出非自身之物并去除，因此称作自然杀伤(nk)细胞。nk细胞不同于t、b细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。nk细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、 抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。同时对人体内的t淋巴细胞及b淋巴细胞具有一定的调节作用。
3.nk细胞不仅可以清除人体内寄生菌、病毒及老化变异细胞，对癌细胞也具有极强的清除作用，目前在临床上利用nk细胞过继性免疫治疗成为了肿瘤细胞免疫治疗的重要手段。nk细胞数量与nk细胞对肿瘤细胞的杀伤效果有关。
4.目前制约nk细胞的临床应用的主要障碍之一就是难以得到足够数量的nk细胞。如何在体外实现nk细胞大规模扩增是目前nk细胞治疗的关键问题。外周血中nk细胞仅占很小的部分。而肿瘤病人的外周血中往往nk细胞的数量和活性有明显的下降。现有的培养过程往往存在培养时间长，细胞收率低的问题。培养基中往往需要添加胎牛血清或者自体血浆，血液制品由于其成分的不明确性，存在一定的安全隐患，并且存在个体差异。因此，如何优化nk细胞体外培养的培养基、提高nk细胞增殖活性对nk细胞的临床应用有重大意义。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种nk细胞扩增用培养基，不添加胎牛血清和其他血液制品，成分安全明确，有效提高nk细胞的体外扩增效率。
6.本发明的目的之二在于提供一种nk细胞的扩增方法。
7.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种nk细胞扩增用培养基，由以下成分组成，基础培养基、钨酸铋微粉、洋蓟素、橄榄苦甙、甘油磷脂、葡萄糖、il-2、il-4、il-15、谷氨酸、精氨酸。
8.优选地，各成分在培养基中的终浓度为：钨酸铋微粉5.2-6.5ng/ml、洋蓟素2.2-3.4 ng/ml、橄榄苦甙3.5-4.5 ng/ml、甘油磷脂1-4μg/ml、葡萄糖10-15μg/ml、il-2 5-10μg/ml、il-4 10-15μg/ml、il-15 2-5μg/ml、谷氨酸12-18μg/ml、精氨酸20-25μg/ml。
9.优选地，各成分在培养基中的终浓度为：钨酸铋微粉5.7ng/ml、洋蓟素2.9 ng/ml、橄榄苦甙4 ng/ml、甘油磷脂3μg/ml、葡萄糖12μg/ml、il-2 8μg/ml、il-4 13μg/ml、il-15 3μg/ml、谷氨酸15μg/ml、精氨酸22μg/ml。
10.优选地，所述钨酸铋微粉的平均粒径为3-9μm。
11.优选地，所述基础培养基为rpmi-1640培养基。
12.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：一种nk细胞的扩增培养方法，采用上述的培养基培养。
13.优先地，所述nk细胞的扩增培养方法包括以下步骤：采集待培养的nk细胞接种至上述培养基中，置于5%co2、37℃培养箱中培养10天。
14.优先地，培养基中nk细胞的密度为2-5
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106个/ml。
15.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种nk细胞扩增用培养基，添加钨酸铋微粉能有效促进nk细胞的活化，提高细胞活力，促进nk细胞的分裂增殖。培养基中还添加洋蓟素、橄榄苦甙减少nk细胞在培养过程中的损伤，起到修复细胞作用，添加甘油磷脂保护细胞膜，提高nk细胞的保水增殖能力。上述成分和培养基中葡萄糖、il-2、il-4、il-15、谷氨酸、精氨酸等成分共同作用有效提高nk细胞的扩增效率，培养得到的nk细胞对肿瘤细胞的杀伤活性较好。
具体实施方式
16.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
17.实施例1一种nk细胞扩增用培养基，由rpmi-1640培养基和添加在培养基中以下成分组成：平均粒径为3-9μm钨酸铋微粉5.2ng/ml、洋蓟素2.2ng/ml、橄榄苦甙3.5 ng/ml、甘油磷脂1μg/ml、葡萄糖10μg/ml、il-2 5μg/ml、il-4 10μg/ml、il-15 2μg/ml、谷氨酸12μg/ml、精氨酸20μg/ml。
18.一种nk细胞的扩增培养方法，包括以下过程：取健康人外周血采用密度离心法分离外周血单个核细胞，将细胞用rpmi-1640培养基重悬，采用磁珠筛选，获得nk细胞，将nk细胞转移至含有10ml扩增培养基的t75培养瓶中，调整细胞密度为2
×
106个/ml，将培养瓶置于5%co2、37℃培养箱中培养，每隔2天补充一次培养基，培养10天。
19.实施例2一种nk细胞扩增用培养基，由rpmi-1640培养基和添加在培养基中以下成分组成：平均粒径为3-9μm钨酸铋微粉5.7ng/ml、洋蓟素2.9 ng/ml、橄榄苦甙4 ng/ml、甘油磷脂3μg/ml、葡萄糖12μg/ml、il-2 8μg/ml、il-4 13μg/ml、il-15 3μg/ml、谷氨酸15μg/ml、精氨酸22μg/ml。
20.一种nk细胞的扩增培养方法，包括以下过程：取健康人外周血采用密度离心法分离外周血单个核细胞，将细胞用rpmi-1640培养基重悬，采用磁珠筛选，获得nk细胞，将nk细胞转移至含有10ml扩增培养基的t75培养瓶中，调整细胞密度为3
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106个/ml，将培养瓶置于5%co2、37℃培养箱中培养，每隔2天补充一次培养基，培养10天。
21.实施例3一种nk细胞扩增用培养基，由rpmi-1640培养基和添加在培养基中以下成分组成：平均粒径为3-9μm钨酸铋微粉6.5ng/ml、洋蓟素3.4 ng/ml、橄榄苦甙4.5 ng/ml、甘油磷脂4μg/ml、葡萄糖15μg/ml、il-2 10μg/ml、il-4 15μg/ml、il-15 5μg/ml、谷氨酸18μg/ml、精氨酸25μg/ml。
22.一种nk细胞的扩增培养方法，包括以下过程：取健康人外周血采用密度离心法分
离外周血单个核细胞，将细胞用rpmi-1640培养基重悬，采用磁珠筛选，获得nk细胞，将nk细胞转移至含有10ml扩增培养基的t75培养瓶中，调整细胞密度为5
×
106个/ml，将培养瓶置于5%co2、37℃培养箱中培养，每隔2天补充一次培养基，培养10天。
23.对比例1对比例1提供一种nk细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为省去钨酸铋微粉，其余均和实施例1相同。
24.对比例2对比例2提供一种nk细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为省去洋蓟素，其余均和实施例1相同。
25.对比例3对比例3提供一种nk细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为省去橄榄苦甙，其余均和实施例1相同。
26.对比例4对比例4提供一种nk细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为省去洋蓟素，将橄榄苦甙的用量调整为5.7 ng/ml，其余均和实施例1相同。
27.对比例5对比例5提供一种nk细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为省去橄榄苦甙，将洋蓟素的用量调整为5.7 ng/ml，其余均和实施例1相同。
28.对比例6对比例6提供一种nk细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为省去甘油磷脂，其余均和实施例1相同。
29.采用台盼蓝染色法分别对实施例1至3，对比例1至6中培养10天后的细胞进行染色，计数，统计各组细胞的数量并计算增殖倍数，结果如表1所示。
30.表1样品nk细胞总数（
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107个）增殖倍数实施例137.5218.76实施例258.5319.51实施例396.4519.29对比例117.188.59对比例227.8213.91对比例326.4713.24对比例428.0614.03对比例524.9112.46对比例632.1716.09由表1可以看出实施例1至3的增殖的倍数高于对比例1至5，nk细胞的增殖活性更好。对比例1中省去了钨酸铋微粉，经培养后nk细胞的数量降低明显，说明在省去培养基中的钨酸铋微粉后，nk细胞的增殖活性下降。
31.对比例2至5中分别省去了洋蓟素和橄榄苦甙中的一种，或者在省去其中一种成分后增加剩余成分的用量，所得的培养基用于nk细胞的培养后，细胞的增殖活性也有不同程
度的下降，这说明添加洋蓟素、橄榄苦甙减少nk细胞在培养过程中的损伤，起到修复细胞作用，进而提高细胞的增殖活性。对比例6中省去了甘油磷脂，nk细胞的增殖活性和实施例1相比也有一定程度的下降，这是因为添加甘油磷脂可以保护细胞膜保水能力，减少细胞凋亡，提高nk细胞的增殖能力。
32.检测实施例1至3，对比例1至6培养得到的nk细胞对hepg2细胞的杀伤作用，在96孔板中设置靶细胞组、效应细胞组和空白培养基对照组，以效靶比40:1接种细胞， 在37℃、5%co2的培养箱中培养6h，采用cck-8显色法测定各组吸光度值（a），每组设3个孔，并计算杀伤活性，结果如表2所示，杀伤活性计算公式如下：杀伤活性（%）=[1-（实验孔a值-效应细胞孔a）]/（靶细胞孔a值-空白孔a值）
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100%表1样品杀伤活性实施例184.79%实施例288.03%实施例385.57%对比例161.44%对比例272.36%对比例370.21%对比例478.81%对比例567.61%对比例681.33%由表2可以看出实施例1至3中得到的细胞杀伤活性更好。对比例1中省去了钨酸铋微粉，培养得到的 nk细胞在杀伤活性上不及实施例1。
[0033]
对比例2至5中分别省去了洋蓟素和橄榄苦甙中的一种，或者在省去其中一种成分后增加剩余成分的用量，所得的培养基用于nk细胞的培养后，细胞的杀伤活性也有不同程度的下降，这说明添加洋蓟素、橄榄苦甙有助于提高细胞的杀伤活性。对比例6中省去了甘油磷脂，nk细胞的杀伤活性和实施例1相比也有一定程度的下降。
[0034]
综上可知，本技术的培养基中通过添加钨酸铋微粉、洋蓟素、橄榄苦甙、甘油磷脂等成分，不仅提高nk细胞的增殖活性，在短时间同时有助于nk细胞保持较好的杀伤活性，在短时间内可收获大量具有杀伤活性的nk细胞，为nk细胞的临床应用提供了保障。
[0035]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。