环状rna circnfib在肝内胆管细胞癌诊断、治疗及预后中的用途
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及环状rna circnfib在诊断、治疗肝内胆管细胞癌，以及肝内胆管细胞癌预后中的应用。


背景技术：

2.肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，icc)是第二常见的原发性肝脏恶性肿瘤。由于非酒精性脂肪性肝病和丙型肝炎患病率的增加，肝内胆管细胞癌的发病率在全球范围内呈增长态势，过去10年平均每年增长4.4％。icc在早期通常是无症状的，大多数患者诊断出icc时已处于晚期，可选用的治疗手段有限，造成临床效果不佳。
3.当前，根治性切除仍是治愈icc的主要手段，但60％的手术患者存在复发或转移性疾病。因此，迫切需要进一步探寻icc转移的分子机制，确定能够抑制转移的新治疗靶点以改善icc患者的生存结果。
4.环状rna(circrnas)是共价键形成的环形结构的非编码rna，通常由pre-mrna的外显子反向剪切产生。深度rna测序和生物信息学已证明环状rna在转录物组中大量存在。环状rna呈封闭式的环状结构，不易被rnase r酶消化，相较于线性rna能够更稳定地存在于生物体中。越来越多的研究证明环状rna在肝细胞癌、结直肠癌、胶质母细胞癌、胆管癌的肿瘤发生和进展中发挥着重要的作用。从机制上讲，一些环状rna通过吸附微小rna或结合蛋白来调控基因表达，一些环状rna用作蛋白质相互作用的平台，一些环状rna可编码功能肽。但是，目前关于环状rna在icc转移中的作用研究甚少。
5.环状rna cnfib(circbase id:hsa_circ_0086376)包含基因nfib的第3个至第6个外显子，其环化的核苷酸序列有363个碱基，目前尚未有任何关于环状rna cnfib在诊断、治疗肝内胆管细胞癌，以及肝内胆管细胞癌预后中应用的报道。


技术实现要素：

6.丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，mark)包括三个主要的亚家族：细胞外调节蛋白激酶(erk)，c-jun氨基末端激酶(jnk)或应激活化蛋白激酶(sapk)，以及丝裂原活化蛋白激酶14(mark14)。其中，erk信号通路包括激酶ras、raf、mek和erk，是一个三层或四层的磷酸化级联，将上游信号从膜受体传递到一系列下游效应基质中。ras/raf/mek/erk通路的失调激活或者依赖性增强是包括icc在内的许多人类癌症的共同特征。
7.cnfib(circbase id:hsa_circ_0086376)，也即circnfib，其cdna序列如seq id no：1所示，cnfib的序列如seq id no：2所示。cnfib的结构为seq id no：2所示的核苷酸序列首尾连接而成的环状结构。
8.发明人通过机理研究发现，环状rna cnfib与双特异性丝裂原活化蛋白激酶1(mek1)竞争性地相互作用，诱导了mek1与细胞外调节蛋白激酶erk2分解，阻碍了erk2的磷
酸化和转录活性，从而抑制了erk信号通路和肿瘤转移。
9.通过分析cnfib表达与icc患者临床病理特征之间的关系发现，较低的cnfib表达与更多的肿瘤数量、更高的ca19-9水平，更晚的肿瘤分期、淋巴结转移、微血管侵犯相关，表明cnfib参与了icc进展，且cnfib表达较低的患者的总生存期(overall survival，os)和无复发生存率(recurrence-free survival，rfs)更短，通过单因素和多因素分析发现，cnfib的表达降低被认为是os和rfs的独立危险因素，表明低cnfib表达水平可以作为icc患者的重要的预后指标之一。功能性研究表明，cnfib在体外和体内抑制了icc细胞的增殖和转移。其中，体外实验表明，cnfib的过表达能够显著地抑制细胞的生长、迁移和侵袭能力，体内实验表明，cnfib过表达将抑制肿瘤的生长、肝内转移和肺转移。不仅如此，发明人还发现曲美替尼(trametinib)，一种mek抑制剂，与编码cnfib的慢病毒载体共同治疗相比于仅采用曲美替尼进行治疗，显示出了更强的肿瘤抑制作用，表明cnfib的外源性过表达能够增强曲美替尼的抗肿瘤作用。
10.以上，实验结果及机理研究均表明环状rna cnfib在icc细胞的生长与转移中发挥至关重要的作用，可作为治疗肝内胆管细胞癌的潜在的药物作用靶点。
11.本发明的目的在于基于发明人对环状rna cnfib在肝胆管癌细胞生长和转移中的功能和机制研究，提供一种诊断肝内胆管细胞癌的试剂盒、治疗肝内胆管细胞癌的药物组合物，以及环状rna cnfib作为治疗靶点在肝内胆管细胞癌的预后、诊断和治疗中的应用。
12.本发明的上述目的通过下述技术方案实现：
13.一种用于诊断肝内胆管细胞癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括定量检测环状rna的试剂，所述环状rna的circbase id为hsa_circ_0086376。
14.进一步地，所述定量检测环状rna的试剂包括用于扩增所述环状rna的引物。
15.作为本发明中用于扩增所述环状rna cnfib的一种优选引物，所述引物包括如下引物对：
16.正向引物：5'-cgaaagagatcaagattctggac-3'(seq id no：3)
17.反向引物：5'-cctgggttatgggcgttct-3'(seq id no：4)。
18.进一步地，所述试剂盒还包括肝组织rna提取试剂、逆转录反应体系。所述rna提取试剂为trizol试剂，所述逆转录反应体系包括逆转录酶、缓冲液、rnase抑制剂、oligo、dntps等。
19.本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括环状rna和/或增加所述环状rna表达量的试剂，以及药物学上可接受的载体，所述环状rna的circbase id为hsa_circ_0086376。本技术方案中，药物组合物可以包含该环状rna，环状rna的过表达载体，其他能够增加所述环状rna表达量的试剂，或者任意组合。
20.本发明进一步提供上述任一种药物组合物在制备用于抑制肝胆管癌细胞增殖、迁移的药物或治疗肝内胆管细胞癌的药物中的应用。
21.本发明还提供定量检测环状rna cnfib的试剂在制备用于诊断肝内胆管细胞癌的试剂盒中的用途，所述环状rna cnfib的circbase id为hsa_circ_0086376。
22.本发明还提供环状rna cnfib在制备或筛选治疗肝内胆管细胞癌的药物中的用途，所述环状rna cnfib的circbase id为hsa_circ_0086376。
23.本发明还提供一种增加环状rna cnfib的表达量的试剂在制备治疗肝内胆管细胞
癌的药物中的用途，所述环状rna cnfib的circbase id为hsa_circ_0086376。
24.本发明还提供环状rna cnfib过表达载体在与曲美替尼共同治疗肝内胆管细胞癌中的应用。
25.本发明还提供环状rna cnfib的表达量在肝内胆管细胞癌患者预后中的应用，所述环状rna cnfib的circbase id为hsa_circ_0086376。
26.本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
27.1、本发明通过研究cnfib的表达水平与临床病理特征、以及患者预后之间的关系，证明了cnfib参与了icc进展，并且cnfib表达较低的患者的总生存期和无复发生存率更短，cnfib的表达降低被认为是os和rfs的独立危险因素，故cnfib的表达水平可以作为icc患者的一个重要预后指标；
28.2、本发明通过cck-8增殖实验发现cnfib过表达能够显著地抑制icc细胞的增殖能力，通过transwell迁移与侵袭实验证实cnfib过表达后，icc细胞迁移与侵袭能力受到明显抑制，表明cnfib能够作为治疗靶点应用于icc的治疗；
29.3、本发明通过构建裸鼠皮下肿瘤模型、裸鼠肝癌原位模型和裸鼠肺转移模型，检验了cnfib过表达对裸鼠体内icc细胞增殖、侵袭和转移的影响，证明了cnfib的过表达在动物体内起到抑制icc细胞增殖、侵袭和转移的作用；
30.4、本发明发现，cnfib过表达的icc细胞中，曲美替尼的ic50显著下降，表明cnfib可以增强曲美替尼的抗肿瘤活性，同时，皮下异种移植瘤模型显示，cnfib过表达与曲美替尼的组合相较于单独过表达cnfib或单独使用曲美替尼，能够进一步抑制肿瘤的生长。
附图说明
31.此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
32.图1为本发明具体实施例中cnfib的特征结构图、以及cnfib扩增产物拼接位点的一代测序图；
33.图2为本发明具体实施例中rnase r对cnfib和mnfib的消化对比图；
34.图3为本发明具体实施例中在指定时间点利用放线菌素d处理rbe细胞后，通过qrt-pcr检测的cnfib和mnfib的相对rna表达水平；
35.图4为本发明具体实施例中qpcr检测肿瘤组织和匹配的非肿瘤组织中cnfib的表达结果对比图；
36.图5示出了本发明具体实施例中kaplan-meier生存分析显示icc患者的cnfib表达水平与总生存期(overall survival)、无复发生存率(recurrence-free survival)之间的相关性；
37.图6为本发明具体实施例中过表达cnfib的hccc9810细胞和rbe细胞中的细胞增殖曲线示意图，其中横坐标为天数，纵坐标为酶标仪检测的450nm的吸光值；
38.图7示出了本发明具体实施例中过表达cnfib的hccc9810细胞和rbe细胞的细胞侵袭(invasion)和迁徙能力(migration)；
39.图8示出了本发明具体实施例中过表达cnfib对裸鼠体内肝癌肿瘤生长的影响，其中(a)为裸鼠皮下注射过表达cnfib的rbe细胞后裸鼠皮下成瘤情况；(b)为裸鼠皮下肿瘤体
积增长曲线；
40.图9示出了本发明具体实施例中过表达cnfib对裸鼠体内肿瘤肝内转移的影响，其中(a)为荧光视野，展示了裸鼠肝包膜下注射过表达cnfib的rbe细胞的肝内转移瘤结果；(b)为裸鼠肝脏转移瘤he染色照片；(c)为肝内成瘤实验量化分析图，其中纵坐标为荧光视野下的肿瘤个数；
41.图10示出了本发明具体实施例中过表达cnfib对裸鼠体内肿瘤的肺转移的影响，其中(a)为荧光视野，展示了裸鼠尾静脉注射过表达cnfib的rbe细胞的肺转移瘤结果；(b)为裸鼠肺转移肿瘤he染色照片；(c)为肺转移实验量化分析图，其中纵坐标为荧光视野下的肿瘤个数。
42.图11示出了本发明具体实施例中cnfib过表达的icc细胞曲美替尼的ic50，表明cnfib可以增强曲美替尼的抗肿瘤活性；
43.图12为本发明具体实施例中稳定表达载体或cnfib的rbe细胞的皮下异种移植瘤模型，当皮下肿瘤体积达到100～130mm3时，连续15天，每天一次以1mg/kg的剂量给小鼠口服曲美替尼，图中示出了实验结束时切除肿瘤的具有代表性的图像；其中，vector+vehicle为没有喂曲美替尼的对照载体，oe-cnfib+vehicle为没有喂曲美替尼的cnfib过表达载体，vector+trametinib为喂曲美替尼的对照载体，oe-cnfib+trametinib喂曲美替尼的cnfib过表达载体。
具体实施方式
44.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
45.本发明所涉及的技术为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、试剂以及反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。
46.除非另有说明，实施例中各实验方法采用现有的实验方法步骤，并严格按照试剂盒制造商说明执行。
47.本发明的各实施例中，经华西医院伦理审查委员会批准，根据委员会的政策向每位患者提供书面知情同意书，在患者完全知情并签署知情同意书后，纳入2010年10月至2017年12月在四川大学华西医院接受根治性手术的120例icc患者。选择含有30例组织进行环状rna测序，其中包含15例术后出现肝外转移的原发性icc组织和15例无术后转移或复发的原发性icc组织。随访期定义为手术至死亡或复发的时间间隔。总生存期(os)定义为从手术到死亡的时间间隔。无复发生存率(rfs)定义为从手术到检测到任何类型的复发的时间间隔。
48.本发明的各实施例中，所有人类icc细胞系(hucct1、hccc9810、rbe)均购自上海生命科学研究院，细胞系在含有10％胎牛血清的rpmi-1640培养基中，在37℃和5％co2的加湿培养箱中培养。
49.本发明的各实施例中，统计分析采用spss 23.0和prism version 7.0完成。数据
显示为平均值
±
标准偏差(sd)。采用x-tile软件确定icc组织中相对cnfib表达量的最优截断值。生存数据采用kaplan-meier法测量，采用时序检验分析。p值小于0.05表示具有统计学意义。
50.【实施例1】
51.本实施例中，发明人设计能够扩增环状rna cnfib的特异性引物对，并利用该引物对扩增cnfib，通过一代测序的方法证实了该环状rna的拼接位点(back-splice site)，之后通过rnase r消化实验，确定了cnfib为具有闭合环状结构的环状rna分子，通过放线菌素d实验证明了cnfib的稳定性。
52.本实施例的实验方案如下：
53.使用trizol试剂从rbe细胞中提取总rna，采用超微量核酸测定仪检测细胞总rna纯度和浓度。在冰上进行逆转录反应体系配制，配制完成后加入已准备好的细胞总rna进行逆转录，所述逆转录反应体系为：
[0054][0055]
逆转录反应条件如下：
[0056]
在37℃下反应15分钟，之后在85℃下反应5秒。降温至4℃后，将反应得到的cdna稀释5倍，之后置于-20℃冰箱保存。
[0057]
采用下述设计的引物对扩增逆转录得到的cdna：
[0058]
正向引物：5'-cgaaagagatcaagattctggac-3'(seq id no：3)
[0059]
反向引物：5'-cctgggttatgggcgttct-3'(seq id no：4)
[0060]
利用上述引物对扩增逆转录得到的cdna后，对扩增产物进行一代测序。如图1所示，cnfib源自基因nfib的第3个至第6个外显子，一代测序的结果证明cnfib存在反向剪切连接，且准确地显示了扩增产物的拼接位点，表明cnfib的形成不是由于基因组的重组错配。
[0061]
1.rnase r消化实验：
[0062]
使用trizol试剂从rbe中提取总rna，将3μg的总rna进行rnase r处理(epicentre，10u，37℃，30min)，之后于70℃下孵育10分钟以使rnase r酶失活，随后通过实时pcr分析比较cnfib和mnfib的相对rna表达水平。实验结果如图2所示，线性的mnfib经rnase r酶消化后表达显著降低，而cnfib耐受rnase r酶的消化作用，证实cnfib具有环状结构。
[0063]
2.放线菌素d实验：
[0064]
rbe细胞经放线菌素d(2μg/ml)处理0、4、8、12、24小时，通过实时pcr检测cnfib和mnfib的表达水平，并通过0小时组的值进行归一化。实验结果如图3所示，表明cnfib的半衰期比mnfib的半衰期更长，证明了环状rna cnfib的稳定性。
[0065]
【实施例2】
[0066]
本实施例中，通过荧光定量pcr检测cnfib在肿瘤组织和对应的非肿瘤组织中的表达差异，发现cnfib在肿瘤组织中的表达明显高于对应的非肿瘤组织，表明可以利用检测cnfib的表达量来诊断肝内胆管细胞癌。
[0067]
本实施例的实验方案如下：
[0068]
使用总rna分离试剂盒根据制造商的说明提取细胞和肿瘤组织的总rna，采用chamq
tm sybr@qpcr master mix进行实时pcr分析。rna的相对表达通过β-肌动蛋白或u6标准化，并通过2-δδct法定量。
[0069]
具体地，采用实施例1中的cdna逆转录反应进行组织rna逆转录。
[0070]
在冰上进行pcr反应体系配制(以20μl体系为例)，配制完成后再加入已逆转录得到的cdna模板。其中，pcr反应体系为：
[0071][0072]
用于扩增环状rna的引物对采用实施例1中优选的引物对：
[0073]
正向引物：5'-cgaaagagatcaagattctggac-3'(seq id no：3)
[0074]
反向引物：5'-cctgggttatgggcgttct-3'(seq id no：4)
[0075]
反应条件包括：
[0076]
第一步：预变性
[0077]
95℃，5分钟；
[0078]
第二步：pcr反应(40个循环)
[0079]
95℃，20秒；60℃，20秒；72℃，20秒。
[0080]
第三步：融解曲线分析
[0081]
65℃，5秒；95℃，5秒。
[0082]
pcr扩增后进行定量分析。目标基因的相对表达量计算公式为：2
‑△△
ct＝2-【(
△
ct)test-(
△
ct)control】。其中，
△
ct＝ct目的-ct管家，ct目的为目标基因ct值，ct管家为管家基因ct值，
△
ct表示各样本目的基因相对管家基因的相ct值，
△△
ct＝(
△
ct)test-(
△
ct)control，表示处理组相对对照组进行归一化，2
‑△△
ct表示处理组相对对照组的相对表达量，表示目标基因相对表达倍数。
[0083]
上述qpcr实验结果如图4所示。从图4可以看出，cnfib在肿瘤组织中的表达水平明显高于非肿瘤组织，表明cnfib在icc发生发展中有重要意义，能够在icc诊断中产生积极作用。
[0084]
【实施例3】
[0085]
本实施例中，利用icc组织中相对cnfib表达量的中位值，将120名icc患者分为cnfib低表达组(n＝60)和cnfib高表达组(n＝60)，β-肌动蛋白或者u6用作内源性对照。
[0086]
如图5所示，通过kaplan-meier生存分析表明，cnfib表达水平较低的icc患者在治
愈性切除后，总生存期和无复发生存率更短。
[0087]
表1示出了单因素cox比例风险回归模型的总生存期和无复发生存率的预后因素。在单因素分析中，血清ca19-9的水平、肿瘤数量、肿瘤体积、肿瘤分化、微血管侵犯、淋巴结转移、tnm分期和cnfib表达水平与总生存期、无复发生存率相关。
[0088]
表1：
[0089][0090]
在多因素分析中，cnfib的低表达与较差的肿瘤分化、更多的肿瘤数量和更大的肿瘤体积被确认为总生存期的独立危险因素。而cnfib的低表达与较差的肿瘤分化、更晚的tnm分期、存在微血管侵犯一同被确认为无复发生存率的独立危险因素(表2)。
[0091]
表2：
[0092][0093][0094]
综上，cnfib的表达水平降低为总生存期和无复发生存率的独立危险因素，表明cnfib的表达水平可以作为icc患者的理想的预后标志物，且cnfib在icc转移中具有肿瘤抑制作用。
[0095]
【实施例4】
[0096]
本实施例中，为了评估cnfib在icc进展中的生物学功能，检查了细胞系hccc9810和rbe的内源性cnfib表达水平，且cnfib通过hccc9810和rbe中的慢病毒表达载体过表达。cnfib过表达(oe-cnfib)及其对照载体(vector)根据标准程序进行稳定感染，慢病毒载体由汉恒生物科技(上海)有限公司合成。
[0097]
通过cck-8增殖实验发现，cnfib过表达的hccc9810、rbe的icc细胞增殖能力受到明显抑制。通过transwell迁移与侵袭实验可证实，cnfib过表达将显著抑制细胞的迁移和侵袭能力。上述实验表明，cnfib能够作为治疗靶点应用于icc的治疗。
[0098]
1.cck-8细胞增殖实验
[0099]
通过cck-8测定检查细胞活性。具体地，将悬浮于100μl培养基中的1.5
×
103个细胞接种于96孔板中，指定时间点向每个孔加入10μl的cck-8试剂，在37℃孵育2小时，之后使用酶标仪在450nm处测量每个孔的吸光度。
[0100]
cck-8细胞增殖实验结果见图6，cnfib过表达后，icc细胞增殖能力受到明显抑制，icc细胞增殖速度明显减慢。
[0101]
2.细胞迁移与侵袭实验
[0102]
使用涂有(侵袭实验)或未涂有(迁移实验)基质胶的transwell小室(8.0μm孔径，corning costar，kennebunk，usa)。对于细胞迁移实验，将悬浮于500μl无血清1640培养基中的2
×
104个细胞接种到24孔板的上室。对于基质胶侵袭实验，将悬浮在500μl无血清1640培养基中的4
×
104个细胞接种到24孔板的上室，将含有10％fbs的1640培养基加入下室，24或48小时后，将迁移或侵入下室下表面的细胞用多聚甲醛固定并染色，之后于显微镜下观察。
[0103]
实验结果见图7，证明过表达cnfib的hccc9810细胞和rbe细胞中，icc细胞的迁移与侵袭能力受到明显抑制。
[0104]
【实施例5】
[0105]
本实施例中，为研究cnfib在体内的影响，通过构建裸鼠皮下肿瘤模型、裸鼠肝癌原位移植模型和裸鼠肺转移模型，通过慢病毒转染建立了rbe细胞中的cnfib(oe-cnfib)，检验了过表达cnfib的rbe细胞中的cnfib对裸鼠体内icc细胞增殖、侵袭和转移的影响。
[0106]
体内动物实验得到了四川大学华西医院动物伦理委员会的批准。采用5至6周龄balb/c裸鼠。对于裸鼠皮下肿瘤模型，将悬浮于100μl pbs中的5
×
106个稳定转染的icc细胞皮下注射到裸鼠右侧腋窝，接种后，每周记录肿瘤的长度和宽度，并计算肿瘤体积(v＝1/2
×a×
b2，a为长轴，b为短轴)。五周后处死裸鼠，测量皮下肿瘤的重量。对于裸鼠肝癌原位移植模型，麻醉后将2
×
106个细胞植入到肝左叶，六周后，腹腔注射d-荧光素后，通过ivis@lumina ii系统观察肿瘤形成和转移。对于裸鼠肺转移模型，通过尾静脉注射2
×
106个细胞，八周后在注射d-荧光素后通过ivis系统扫描肺中的肿瘤转移，ivis测量后处死小鼠，切除肿瘤组织用于进一步检测。
[0107]
实验结果如图8至图10所示，cnfib过表达后，肿瘤的生长受到了明显的抑制，在肝脏中观察到的肝内转移灶明显减少，且cnfib的过表达抑制了肺转移的形成。
[0108]
【实施例6】
[0109]
曲美替尼是一种可口服的高特异性mek抑制剂，已被批准用于晚期黑色素瘤、甲状腺未分化癌和非小细胞肺癌的临床治疗。本实施例中，应用曲美替尼抑制mek并研究了cnfib对曲美替尼ic50(半抑制浓度)的影响。如图11所示，在cnfib过表达的icc细胞中，曲美替尼的ic50显著降低，表明cnfib可以增强曲美替尼的抗肿瘤活性。
[0110]
在体内实验中，使用稳定转染的rbe细胞建立了裸鼠皮下肿瘤模型，当皮下肿瘤体积达到100-130mm3时，小鼠随机接受对照组(vehicle)或曲美替尼(trametinib)治疗。小鼠
每日一次口服曲美替尼，剂量为1mg/kg，连续治疗15天，每3天测量一次肿瘤体积。如图12所示，曲美替尼与cnfib过表达载体共同治疗相比于仅采用曲美替尼或cnfib过表达载体进行治疗，显示出了更强的肿瘤抑制作用，表明cnfib的外源性过表达能够增强曲美替尼的抗肿瘤作用。
[0111]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。