一种硫酸软骨素酶b、其编码基因以及其构建方法
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种硫酸软骨素酶b、其编码基因以及其构建方法。


背景技术：

2.硫酸软骨素裂解酶(chondroitinase或chondroitin sulfate lyase，简称为“chsase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖。硫酸软骨素酶b仅特异性降解硫酸软骨素b及透明质酸，该酶在基础研究、生物医药等领域具有潜在的应用价值。
3.相关技术中，硫酸软骨素酶b的热稳定性和酸碱条件下的ph稳定性有限，这使得硫酸软骨素酶b在硫酸软骨素b生物资源开发的过程中受限制。因此发现新型的耐热、耐酸碱的硫酸软骨素酶b对工业生产具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。
5.为此，在本发明的第一个方面中，本发明提出了一种硫酸软骨素酶b，具有如seq id no：1所示的氨基酸。
6.根据本发明的实施例的硫酸软骨素酶b，其能有效地将硫酸软骨素b底物消化成双糖，其最适ph为8.0，最适温度为40℃；具有良好的热稳定性，在60℃处理2h后，其残余活力约为50％；重组酶在ph 4.0～10.0范围内具有良好的稳定性。重组酶对受试的非离子表面活性剂(triton x-100、tween 20和tween 80)和阳离子表面活性剂ctab表现出极好的稳定性。通过对硫酸软骨素b的酶解，提高了硫酸软骨素b作为羟自由基清除剂的抗氧化能力。该酶的活性和稳定性使其成为进一步基础研究、医学、工业和生物技术应用的有竞争力的候选者。
7.可选地，所述硫酸软骨素酶b从海洋微泡菌(microbulbifer sp.)中克隆出。
8.在本发明的第二方面中，提供了一种编码上述硫酸软骨素酶b的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.在本发明的第三个方面中，提供了一种构建体，其包含编码硫酸软骨素酶b的基因。
10.在本发明的第四个方面中，提供了一种构建上述硫酸软骨素酶b的方法，包括以下步骤：
11.(1)以微泡菌(microbulbifer sp.)的基因组dna为模板，seq id no：3和seq id no：4所示的序列为引物，pcr扩增出硫酸软骨素酶b的基因；
12.(2)将硫酸软骨素酶b基因插入pet-28a(+)载体中，获得重组质粒；
13.(3)将重组质粒导入大肠杆菌bl21(de3)中，获得重组菌；
14.(4)利用培养基培养重组菌并诱导表达，获得所述硫酸软骨素酶b。
15.在本发明的第五个方面中，提供了上述的硫酸软骨素酶b的用途，其用于酶解硫酸软骨素b获得羟自由基清除剂。
16.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
17.图1为硫酸软骨素酶b在大肠杆菌中的表达；
18.图2为硫酸软骨素酶b的底物特异性；
19.图3为硫酸软骨素酶b在不同温度下的酶活性；
20.图4为硫酸软骨素酶b的热稳定性；
21.图5为硫酸软骨素酶b在不同ph条件下的酶活性；
22.图6为硫酸软骨素酶b的ph稳定性；
23.图7为底物浓度与反应初速度的lineweaver-burk双倒数拟合曲线；
24.图8为金属离子对硫酸软骨素酶b稳定性的影响；
25.图9为化学试剂对硫酸软骨素酶b稳定性的影响；
26.图10为硫酸软骨素b酶解产物的ms分析；
27.图11为硫酸软骨素b酶解产物对羟基自由基的清除活性。
具体实施方式
28.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
29.下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5
′
至3
′
的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
30.下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。
31.实施例1硫酸软骨素酶b的体外表达
32.(1)基因克隆
33.用引物f(5
′‑
cgcggatccgcggaattcctggtgcacaaccagc-3
′
，下划线为bamhi位点，seq id no：3)和引物r(5
′‑
ccgctcgagattcgtgacttcgttattggcgagg-3
′
，下划线为xhoi位点，seq id no：4)，从微泡菌(microbulbifer sp.)的基因组中扩增出硫酸软骨素酶b的基因。扩增子长度为2181bp，编码成熟硫酸软骨素酶b，不包括信号肽。
34.pcr反应体系为：加入10
×
taq dna聚合酶缓冲液5μl，10mmol/l的4种dntps混合液4μl，基因特异性上游引物1μl，基因特异性下游引物1μl，primer star enzyme 0.5μl，基因
组模板2μl，加无菌水补足至50μl。
35.pcr扩增程序为：预变性(95℃，5min)；变性(94℃，55s)，退火(55℃，45s)，延伸(72℃，90s)，30个循环；延伸(72℃，10min)。得到的pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测产物的大小。利用dna纯化试剂盒回收目的基因片段。
36.将上述扩增子插入pet-28a(+)载体中(novagen，germany)，转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，利用pcr筛选阳性克隆子，重组质粒经测序验证目的基因序列的保真性，获得含有硫酸软骨素酶b基因的基因工程菌。
37.(2)重组酶的表达和纯化
38.将上述基因工程菌在含卡那霉素50μg/ml的培养基中培养过夜，温度为37℃，转速为180rpm。过夜培养物以1：100比例转接到含有卡那霉素的lb培养基中继续培养，600nm处测od值达到0.6～0.8，然后加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度0.1mmol/l，在18℃下诱导蛋白表达20h。将细胞悬液在4℃下以5000
×
g离心15min，进行细胞回收，弃上清液。将细胞悬浮于15ml缓冲液(50mmol/l nah2po4，300mmol/l nacl，15mmol/l咪唑，ph 8.0)中。重组酶参照ge healthcare life sciences公司的金属镍螯合琼脂糖凝胶6ff使用说明书程序，通过亲和层析进行分离纯化。蛋白质的浓度测定采用bca蛋白定量试剂盒(pierce，usa)，以牛血清白蛋白为标准。采用12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析目的蛋白的纯度和分子量，结果如图1所示，图1中泳道m：蛋白质分子量标记；泳道1：未诱导的含重组质粒的大肠杆菌；泳道2：诱导的含重组质粒的大肠杆菌；泳道3：纯化的重组硫酸软骨素酶b。利用iptg诱导后，观察到具有预期大小的融合蛋白的像样条带(泳道2)，而在未诱导细胞中则没有(泳道1)。使用亲和层析纯化后，在凝胶上清晰地观察到分子量为86.2kda的单一条带(泳道3)。
39.实施例2硫酸软骨素酶b的活力测定
40.利用50mmol/l na2hpo
4-nah2po4缓冲液(ph 8.0)配制2mg/ml硫酸软骨素b(soiarbio，中国)底物溶液。取680μl底物溶液，加入15μl纯化的重组酶溶液(0.6mg/ml)，在40℃下反应20min后，于沸水浴中终止反应10min。将混合物冷却至室温后，在232nm处测定紫外吸收值。1个酶活力单位定义为在上述条件下每分钟产生1μmol不饱和碳键所需的酶量。
41.实施例3硫酸软骨素酶b的酶学性质
42.(1)硫酸软骨素酶b的底物特异性
43.采用实施例2的活力测定方法，分别测定使用不同底物的酶活性，包括硫酸软骨素a(csa)、硫酸软骨素b(csb)、硫酸软骨素c(csc)和透明质酸(ha)，研究酶的底物特异性。结果如图2所示，重组酶对csb和ha有活性，说明该酶属于硫酸软骨素酶b。
44.(2)温度和ph对硫酸软骨素酶b活性和稳定性的影响
45.硫酸软骨素酶b的最适反应温度在4～60℃的范围内测定，具体操作：采用实施例2的活力测定方法，分别在4、10、20、30、40、50和60℃条件下反应，测定酶的活性。结果如图3所示，酶的最适温度为40℃，并在4℃至50℃的温度下呈现超过60％的相对活性，当温度达到60℃时，酶的相对活性为52.3％。
46.酶的热稳定性分析在30、40、50和60℃下进行测定。具体操作为：将纯化后的酶液在不同温度下处理2～10h。热处理后将样品放在冰上立即冷却。通过所述的标准方法测量
酶的剩余活力，以未经处理的酶活性定义为100％。结果如图4所示，在30℃处理不同时间，硫酸软骨素酶b的残余活性逐渐降低。当处理温度升高至40℃时，硫酸软骨素酶b分别处理2h和10h后的残余活性分别为68.2％和34.0％。当温度升至50℃和60℃时，酶处理2h残余活性分别为61.0％和49.7％，处理10h几乎消除了硫酸软骨素酶b活性。这些结果表明，硫酸软骨素酶b可以在相对宽的温度范围内有活性，且具有相对良好的热稳定性。
47.硫酸软骨素酶b的最适反应ph在4.0～11.0的范围内测定，具体操作：采用实施例2的活力测定方法，分别在不同ph条件下反应，测定酶的活性。结果如图5所示，硫酸软骨素酶b的最适反应ph为8.0，在ph为7.0-10.0时显示出超过55％的相对活性。
48.酶的ph稳定性分析在ph4.0-11.0条件下测定。具体操作为：将纯化后的酶液在不同ph下37℃处理1h，通过所述的标准方法测量酶的剩余活力，以未经处理的酶活性定义为100％。结果如图6所示，硫酸软骨素酶b在ph 4.0-10.0范围内具有好的稳定性，酶的残余活力在60％以上。当ph为11.0时，酶的ph稳定性急剧下降，残余活力仅为27.8％。
49.(3)硫酸软骨素酶b的动力学参数
50.分别以不同浓度硫酸软骨素b(0.01-0.5mg/ml)为底物，测定了硫酸软骨素酶b的动力学参数。用lineweaver-burk双倒数作图法测得km值为7.85μg/ml，v
max
为1.21u/mg(图7)。
51.(4)化学试剂对硫酸软骨素酶b稳定性的影响
52.测定化学试剂对酶稳定性的影响。具体操作为：将纯化后的酶利用不同化学试剂在37℃处理1h，通过所述的标准方法测量酶的剩余活力，以未经处理的酶活性定义为100％。金属离子对硫酸软骨素酶b稳定性的影响结果如图8所示，在测试的浓度下，na
+
和k
+
对硫酸软骨素酶b活性没有显着影响。其他测试的金属离子抑制酶的活性，包括ag
+
，ba
2+
，ni
2+
，mn
2+
，hg
2+
，fe
2+
，cu
2+
，ca
2+
，mg
2+
，zn
2+
和fe
3+
，其中cu
2+
和fe
3+
具有显着的负面影响。
53.其他化学添加剂对酶稳定性的影响结果如图9所示，以10mmol/l的螯合剂edta显示轻微的抑制作用，酶对还原试剂dtt和β-me表现出良好的稳定性。triton x-100在低浓度(0.1％)时促进酶的活性，在高浓度(1％)时对酶活性基本没有影响。其它非离子型表面活性剂吐温20和吐温80可增强硫酸软骨素酶b的活性。阳离子表面活性剂ctab在0.1％浓度时增加硫酸软骨素酶b的活性，而阴离子表面活性剂sds抑制酶的活性。酶对表面活性剂的良好稳定性将有利于它的工业利用。此外，变性剂尿素和盐酸胍对酶活性表现出抑制作用，浓度为在1mol/l时，分别抑制91.1％和54.5％的活性。
54.实施例4硫酸软骨素b的酶解产物分析
55.将100u硫酸软骨素酶b加入100ml硫酸软骨素b溶液(5mg/ml)中，在40℃下反应。每30min取样一次，通过dns法确定释放的还原糖量。反应3h后，添加30u硫酸软骨素酶b到反应混合物中，在40℃下继续反应3h。此时释放的还原糖量达到稳定状态。将反应混合物在100℃下加热10min，使酶失活，然后以12,000
×
g离心10min，收集上清液作为酶解产物，利用labconco freezone 6 plus(thermofisher，usa)冻干成粉末。
56.在负离子模式下对酶解产物进行质谱分析。结果如图10所示，质谱分析结果表明，硫酸软骨素b的酶解产物主要为二糖(m/z为458.0)。硫酸软骨素b双糖由一分子d-葡萄糖醛酸和一分子n-乙酰半乳糖胺组成。
57.实施例5硫酸软骨素b酶解产物的抗氧化活性分析
58.通过羟基自由基清除能力测定硫酸软骨素b酶解产物的抗氧化活性。将硫酸软骨素b酶解产物的粉末重新溶解在去离子水中，配制不同浓度的样品，用于抗氧化活性测定。反应溶液由0.2ml酶解产物样品溶液、0.1ml 9mmol/l feso4、0.1ml 9mmol/l水杨酸(溶于乙醇)、0.1ml 8.8mmol/l h2o2和0.6ml h2o组成。混合物在37℃下反应10min，在510nm处测定吸光度。结果如图11所示，硫酸软骨素b的清除活性没有显着变化，而酶解产物的清除活性与未酶解的硫酸软骨素b相比显著改善。酶解产物的羟基自由基清除活性基本上随着其浓度的增加而增强，酶解产物范围为0.1-0.5mg/ml时，自由基清除率介于27.6％-75.9％。这些结果表明，硫酸软骨素b通过酶解后显著提高了硫酸软骨素b聚合物的抗氧化活性。
59.综上，根据本发明的实施例，从海洋细菌microbulbifer sp.中成功克隆了一种属于pl6家族的硫酸软骨素酶b。对其进行表征可知，硫酸软骨素酶b能有效地将硫酸软骨素b底物消化成双糖，最适ph为8.0，最适温度为40℃。硫酸软骨素酶b具有良好的热稳定性，在ph 4.0-10.0范围内稳定。硫酸软骨素酶b对受试的非离子表面活性剂和阳离子表面活性剂ctab表现出极好的稳定性。通过硫酸软骨素酶b对硫酸软骨素b底物的酶解，提高了其作为羟自由基清除剂的抗氧化能力。硫酸软骨素酶b的活性和稳定性使其成为进一步基础研究、医学、工业和生物技术应用的有竞争力的候选者。
60.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
61.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。