1.本发明属于微生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种用于幽门螺旋杆菌的培养基及其制备方法与应用。


背景技术：

2.幽门螺旋杆菌(hp)是一种定植在胃黏膜上皮与粘液之间的革兰氏阴性螺旋状杆菌，大量的研究表明，其与慢性胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤的发生密切相关，在病原学上具有重要的意义。自1983年首次被分离以来，检测油门螺旋杆菌的技术有了很大的进展，主要分为两大类，一类是侵入式检测技术，包括活组织切片染色法、快速尿素酶法、细菌培养法以及pcr的方法；另一类是非侵入式检测技术，包括
13
c或
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c-尿素酶呼气试验、血清免疫学检验以及粪便抗原检测等。其中细菌培养法是最准确可靠的检测技术，被认为是诊断的“金标准”，同时它也是后续研究的先决条件，可以开展想致病性、药敏实验、不同株的毒力等级分型及其他研究，进而筛选出有效的幽门螺旋杆菌治疗方案。因此，对幽门螺旋杆菌分离培养技术进行研究，并且提高从临床标本中分离的幽门螺旋杆菌的阳性检出率就显得尤为重要。
3.但是，幽门螺旋杆菌是一种挑剔的微需氧菌，在体外培养时，除了对气体环境有严苛的要求外，对于培养基的要求也相当严格。培养基不仅要满足幽门螺旋杆菌的营养需求，还要提供局部的微需氧条件以及合适的ph耐受范围。传统的分离培养基并不能适应幽门螺杆菌的分离培养要求，常用的培养基如哥伦比亚琼脂培养基、脑心浸液琼脂培养在培养幽门螺旋杆菌上均没有优势，且阳性检出率极低。此外，在实际工作中，培养基的质量优劣对检测结果的可靠程度有着直接的影响，因此，需要一种培养效果好、促使幽门螺旋杆菌快速增殖同时能够避免杂菌感染的培养基。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的在于提供一种效果好、能够促使幽门螺旋杆菌快速繁殖，同时又能够避免杂菌感染的培养基。
5.为了实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
6.一种用于幽门螺旋杆菌的培养基，其中，每1000ml所述用于幽门螺旋杆菌的培养基中含有：
7.琼脂3-10g、半胱氨酸5-10g、抗菌素0.3-0.8mg、可溶性淀粉3-10mg、乳酸0.1-1ml和马全血1-10g；其中：
8.所述抗菌素由万古霉素、两性霉素b和多粘菌素组成；所述抗菌素中，万古霉素、两性霉素b和多粘菌素的质量分数分别为：
9.万古霉素：30％-60％；
10.两性霉素b：30％-80％；
11.多粘菌素：0.1％-10％。
12.优选地，每1000ml所述用于幽门螺旋杆菌的培养基中含有：
13.琼脂5-8g、半胱氨酸6-8g、抗菌素0.5-0.8mg、可溶性淀粉3-6mg、乳酸0.1-0.3ml和马全血3-8g；
14.所述抗菌素中，万古霉素、两性霉素b和多粘菌素的质量分数分别为：
15.万古霉素：30％-60％；
16.两性霉素b：30％-80％；
17.多粘菌素：0.1％-10％。
18.进一步优选地，每1000ml所述用于幽门螺旋杆菌的培养基中含有：
19.琼脂5g、半胱氨酸8g、抗菌素0.5mg、可溶性淀粉6mg、乳酸0.1ml和马全血8g；
20.所述抗菌素中，万古霉素、两性霉素b和多粘菌素的质量分数分别为：
21.万古霉素：49％；
22.两性霉素b：49％；
23.多粘菌素：2％。
24.根据本发明具体的实施方案，本发明中，所述培养基中还包括幽门螺旋杆菌脂多糖提取物。
25.进一步优选地，每1000ml所述用于幽门螺旋杆菌的培养基中含有幽门螺杆菌脂多糖提取物1-3mg。
26.此外，本发明还提供了一种本发明所述的培养基的制备方法，其包括以下步骤：
27.s1：制备抗菌素，备用；
28.s2：制备可溶性淀粉水溶液，备用；
29.s3：向琼脂中加入半胱氨酸，灭菌后加入马全血、抗菌素和可溶性淀粉水溶液，得到所述培养基。
30.根据本发明的具体实施方案，本发明提供的制备方法中，还包括向琼脂中添加幽门螺旋杆菌脂多糖提取物的过程。
31.根据本发明的具体实施方案，进一步地，本发明提供的制备方法包括以下步骤：
32.s1：按照配方量取万古霉素、两性霉素b和多粘菌素溶解于适量的无菌水中，混合均匀，在紫外线下照射1-3h，备用；
33.s2：按照配方量称取可溶性淀粉，溶解于适量的无菌水中，按配方量加入乳酸，煮沸10-20min，备用；
34.s3：按配方量量取琼脂，待温度降至45-50℃时加入半胱氨酸、幽门螺杆菌脂多糖提取物，灭菌后依次加入马全血以及步骤s1和步骤s2中制备的抗菌素和可溶性淀粉水溶液，加完后搅拌均匀，冷却，制得所述培养基。
35.本发明还提供了本发明所述培养基在培养幽门螺旋杆菌中的应用。
36.综上所述，本发明提供了一种新的幽门螺旋杆菌用的培养基及其制备方法和应用。本发明提供的培养基中，马全血能够为幽门螺旋杆菌提供所需的营养物质(如氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等)，还可以提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子，能够促进幽门螺旋杆菌的快速生长。抗菌素的加入不但能够减少枯草杆菌、革兰氏阳性球菌、霉菌等杂菌的污染，同时也能够提供hp生长所需的胸腺嘧啶脱氧核苷。可溶性淀粉的加入可以吸收培养过程中幽门螺旋杆菌产生的毒性离子和细菌代谢产生的毒性产
物，防治幽门螺旋杆菌过早处于胁迫条件下，进而增加了幽门螺旋杆菌在培养过程中的快速生长性，减少培养的难度。
37.半胱氨酸的加入可以将氧化还原电位降低到一定程度，保持幽门螺旋杆菌所偏好的微需氧环境。
38.同时，本发明提供的培养基中，还添加了幽门螺旋杆菌脂多糖提取物，其对于杂菌有较好的抑制作用，可以减少抗生素的加入，从而减少了抗生素对幽门螺旋杆菌的胁迫作用。此外，幽门螺旋杆菌脂多糖提取物是幽门螺旋杆菌细胞壁中的一种成分，位于细胞壁的最外层，并覆盖与细胞壁的粘肽上。发明人发现，幽门螺杆菌脂多糖提取物具有广谱抗菌作用，可以替代部分抗生素，在幽门螺杆菌的分离培养中起到抑制杂菌生长的作用。并且幽门螺杆菌脂多糖提取物可在幽门螺杆菌菌体的细胞壁上形成一定的附着，对幽门螺杆菌提供一定的保护作用，抵抗培养环境中的抗生素和毒性次生代谢产物。
具体实施方式
39.为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
40.实施例1本实施例提供了一种用于幽门螺旋杆菌的培养基及其制备方法
41.1.1培养基配方：
42.琼脂5g、半胱氨酸8g、抗菌素0.5mg、可溶性淀粉6g、乳酸0.1ml和马全血8g；
43.所述抗菌素中，万古霉素、两性霉素b和多粘菌素的质量分数分别为：万古霉素：49％；两性霉素b：49％；多粘菌素：2％。
44.1.2试剂材料来源：
45.琼脂：北京陆桥技术有限责任公司；半胱氨酸、可溶性淀粉：安耐吉化学有限公司；万古霉素、多黏霉素、两性霉素b：biosharp公司；乳酸：国药集团；马全血：吉林大学医学院动物中心。
46.1.3制备方法：
47.s1：按照配方量取万古霉素0.245mg、两性霉素b 0.245mg和多粘菌素0.01mg溶解于适量的无菌水中，混合均匀，在紫外线下照射1h，备用；
48.s2：按照配方量称取可溶性淀粉6g，溶解于适量的无菌水中，按配方量加入乳酸0.1ml，煮沸20min，备用；
49.s3：按配方量量取琼脂5g，加热溶解，待温度降至45-50℃时加入半胱氨酸8g，灭菌后依次加入马全血8g以及步骤s1和步骤s2中制备的抗菌素和可溶性淀粉水溶液，加完后搅拌均匀，冷却，制得所述培养基。
50.实施例2本实施例提供了一种幽门螺旋杆菌用培养基及其制备方法
51.1.1培养基配方：
52.琼脂5g、半胱氨酸8g、抗菌素0.5mg、可溶性淀粉6g、乳酸0.1ml、幽门螺旋杆菌脂多糖提取物3mg和马全血8g；
53.所述抗菌素中，万古霉素、两性霉素b和多粘菌素的质量分数分别为：万古霉素：49％；两性霉素b：49％；多粘菌素：2％。
54.1.2幽门螺杆菌脂多糖提取物的制备
55.首先对幽门螺杆菌nctc11639(中国幽门螺杆菌菌株管理与保藏中心馈赠)进行活化、筛选、扩大培养，收集生长旺盛期的细菌，制成细菌悬液。细菌悬液经5000rpm离心10min，得沉淀。沉淀用pbs缓冲液洗涤后，5000rpm离心10min，重复2次。沉淀物(菌体)用pbs缓冲液重悬，调节菌体浓度为2.0
×
10
10
个/ml，制成浓菌液。超声处理浓菌液20min，超声功率300w，超声处理间歇进行，超声10s后停止10s，如此循环直至20min结束。超声处理后的浓菌液经3000rpm离心30min，收集上清液。收集所有上清液置于透析袋中，流水透析24h(每5-6h换一次水)，经冷冻干燥得到幽门螺杆菌脂多糖粗提的样品。
56.取10ml的100mmol/l tris-hcl(ph 8)复溶粗提的样品，加终浓度为100μg/ml的dnaseⅰ和50μg/ml的rnase，37℃消化过夜，而后加入终浓度为100μg/ml的蛋白酶k，65℃作用2h。然后加入水饱和酚，混匀，4000rpm离心30min取上清液，将上清液置于透析袋中蒸馏水透析12h(每5-6h换一次水)，收集透析袋中溶液，再加入10倍体积95％乙醇，-20℃过夜沉淀，然后4000r/min离心30min，取沉淀冷冻干燥称重，得幽门螺杆菌脂多糖提取物固体(hplps)，-20℃保存备用。
57.1.3培养基的制备
58.s1：按照配方量取万古霉素0.245mg、两性霉素b 0.245mg和多粘菌素0.01mg溶解于适量的无菌水中，混合均匀，在紫外线下照射1h，备用；
59.s2：按照配方量称取可溶性淀粉6g，溶解于适量的无菌水中，按配方量加入乳酸0.1ml，煮沸20min，备用；
60.s3：按配方量量取琼脂5g，加热溶解，待温度降至45-50℃时加入半胱氨酸8g，幽门螺旋杆菌脂多糖提取物3mg，灭菌后依次加入马全血8g以及步骤s1和步骤s2中制备的抗菌素和可溶性淀粉水溶液，加完后搅拌均匀，冷却，制得所述培养基。
61.对比例1本对比例提供了一种幽门螺旋杆菌常用的培养基及其制备方法
62.1.1培养基配方：
[0063][0064][0065]
1.2制备方法
[0066]
按配方取牛心浸出物250ml；牛脑浸出物200ml；na2hpo410g；蛋白胨5g；nacl 1g，混合后加热溶解，然后用滤纸过滤，调整ph值到7.2左右，灭菌后加入琼脂粉25g，待培养基温
度降至45℃-50℃左右，加入10mg万古霉素、5mg两性霉素、5mg多粘菌素和5mg甲氧氨苄嘧啶的浓度加入各种抗生素的原液，加入后混合均匀，冷却，得到培养基。
[0067]
验证实验：
[0068]
取实施例1-2和对比例1制备的培养基平板各三只，每只平皿中各加入104的稀释度的菌悬液0.1ml，用l棒涂布均匀(将菌悬液推干)。
[0069]
将平板置于37℃，混合气体(85％n2、10％co2、5％o2)，湿度90％的环境下培养72h后检测计数菌落、测量菌落的直径和杂菌菌落数。实验结果如下表1所示：
[0070]
表1实验结果表
[0071] 菌落数菌落直径(mm)杂菌菌落数实施例1962.02610实施例2982.099-对比例1881.996
[0072]
将实施例1和对比例1发现，实施例1中幽门螺旋杆菌的菌落数和菌落直径均大于对比例1，发明人推测其中的原因可能在于是因为实施例1中添加了马全血，动物的全血能够为幽门螺旋杆菌提供所需的营养物质(如氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等)，还可以提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子，能够促进幽门螺旋杆菌的快速生长。但是，实施例1中的培养基中的杂菌菌落数也明显多于对比例1，因为对比例1中的培养基中添加的抗生素明显多于实施例1，因此也能够更好的抑制杂菌的生长，同时，也因为大量的抗生素的存在，也抑制了幽门螺旋杆菌的生长，这也是导致对比例1中的幽门螺旋杆菌的菌落数和菌落直径小于实施例1和实施例2的原因。
[0073]
将实施例2和对比例1对比发现，实施例2中没有杂菌的生长，说明幽门螺旋杆菌脂多糖提取物能够代替抗生素进一步抑制杂菌的生长。同时，将实施例1和实施例2对比发现，实施例2中的菌落数量和菌落直径相比实施例1都有提升，说明幽门螺旋杆菌脂多糖对于幽门螺旋杆菌的生长也有一定的促进作用。
[0074]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在不偏离本发明要求保护的精神和实质的前提下，可以对本发明的各个技术特征进行替代、修改和组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。