一种降解典型氟喹诺酮类抗生素的豚鼠气单胞菌w3及其应用
技术领域
1.本发明属于豚鼠气单胞菌技术领域。更具体地，涉及一种降解典型氟喹诺酮类抗生素的豚鼠气单胞菌w3及其应用。


背景技术：

2.诺氟沙星(norfloxacin，nor)和环丙沙星(ciprofloxacin，cip)是第三代喹诺酮类抗生素，常用于临床和畜禽养殖业，主要通过家庭废水、医院废水和养殖废水进入环境，城市污水处理厂不能完全去除喹诺酮类抗生素，仍然存在于污水处理厂的污水和污泥中，可以转移至地表水和地下水中，对非目标生物产生负面影响，导致某些微生物种群及其生态功能消失，甚至经由食物链累积对人体造成健康隐患。此外，抗生素残留可促进环境中抗生素耐药菌和抗生素抗性基因的进化和转移，进一步危害环境健康。毫无疑问，喹诺酮类抗生素污染已经成为社会发展、环境保护的巨大难题。
3.氟喹诺酮属于喹诺酮类，又称吡啶酮酸类，属化学合成抗菌药。关于氟喹诺酮类抗生素污染治理的方法有物理法、化学法、生物法和高级氧化法等，而微生物法降解具有经济、高效并且降解彻底的优势，因此利用好氧污泥富集驯化，并纯化分离出能够高效降解nor的菌株，并研究其特性，对于氟喹诺酮类抗生素的环境污染处理具有重要的科学意义和应用价值。然而目前针对降解氟喹诺酮类抗生素的高效菌种却十分缺乏，这无疑给nor环境污染治理带来巨大障碍。
4.现有文献报道的具有降解氟喹诺酮类抗生素能力的菌株包括大肠杆菌、微杆菌、分枝杆菌、芽孢杆菌和labrys portucalensis。专利cn110591948a采用复合微生物菌降解土壤中喹诺酮类抗生素，专利cn113023906a使用大肠杆菌废菌体对废水中的钯离子、铂离子吸附、还原，制备得到的纳米级生物-金属催化剂对左氧氟沙星和诺氟沙星进行降解。但目前为止，尚没有文献报道豚鼠气单胞菌 (aeromonas caviae)具有降解氟喹诺酮类抗生素的能力。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种降解典型氟喹诺酮类抗生素的豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3及其应用，该豚鼠气单胞菌(aeromonascaviae)w3在好氧条件下对典型氟喹诺酮类抗生素——诺氟沙星和环丙沙星具有较强的降解能力，该菌株适用于环境中治理典型氟喹诺酮类抗生素的污染，能够达到环境修复的目的。
6.本发明的第一个目的在于提供一种豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3。
7.本发明的第二个目的在于提供一种豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)的应用。
8.本发明的第三个目的在于提供一种降解典型氟喹诺酮类抗生素的制剂。
9.本发明的第四个目的在于提供一种降解典型氟喹诺酮类抗生素的方法。
10.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
11.一种豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3，所述豚鼠气单胞菌(aeromonas
caviae)w3保藏编号为cctcc m 2021633，已于2021年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心。
12.一种豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)在降解典型氟喹诺酮类抗生素和/或制备降解典型氟喹诺酮类抗生素的制剂中的应用，所述典型氟喹诺酮类抗生素为诺氟沙星和环丙沙星中的一种或两种。
13.优选地，所述豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)为豚鼠气单胞菌(aeromonascaviae)w3，所述豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3保藏编号为cctcc m 2021633，已于2021年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心。
14.一种降解典型氟喹诺酮类抗生素的制剂，其特征在于，所述制剂中包含豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)，所述典型氟喹诺酮类抗生素为诺氟沙星和环丙沙星中的一种或两种。
15.优选地，所述豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)为豚鼠气单胞菌(aeromonascaviae)w3，所述豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3保藏编号为cctcc m 2021633，已于2021年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心。
16.优选地，所述制剂为降解水体中典型氟喹诺酮类抗生素的制剂。
17.一种降解典型氟喹诺酮类抗生素的方法，采用豚鼠气单胞菌(aeromonascaviae)进行降解，所述典型氟喹诺酮类抗生素为诺氟沙星和环丙沙星中的一种或两种。
18.优选地，所述豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)为豚鼠气单胞菌(aeromonascaviae)w3，所述豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3保藏编号为cctcc m 2021633，已于2021年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心。
19.优选地，所述降解温度为25～35℃，ph为7.0～7.5，初始接菌量为 od600＝0.5～0.8。
20.更优选地，所述降解温度为28℃，ph为7.3，初始接菌量为od600＝0.68。
21.优选地，所述方法为降解水体中典型氟喹诺酮类抗生素的方法。
22.本发明通过从添加了诺氟沙星(nor)的好氧反应器中分离出一株在好氧条件下具有降解典型诺氟沙星功能的豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3，该菌株能在单一碳源基质环境下对诺氟沙星进行有效地降解，降解效率可达90％以上。对环丙沙星的降解效率可达46％。
23.本发明提供的豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3在单一碳源下，能有效降解典型氟喹诺酮类抗生素。
24.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
25.本发明首次确定了具有降解典型氟喹诺酮类抗生素的豚鼠气单胞菌 (aeromonas caviae)w3，所述豚鼠气单胞菌在msm平板上生长，菌落为圆形，表面光滑，颜色为透明至白色，革兰氏染色为阴性。豚鼠气单胞菌(aeromonascaviae)w3的主要理化特性为：菌株生长温度10～40℃，ph范围6～8，兼性厌氧生长，氧化酶阳性，接触酶阳性。本发明提供的豚鼠气单胞菌(aeromonascaviae)w3具有较强的降解典型氟喹诺酮类抗生素的能力，尤其是降解诺氟沙星的能力，在诺氟沙星的浓度为75mg/l，好氧条件下，降解8天，降解率可达 90％以上。在环丙沙星的浓度为65mg/l，好氧条件下，降解9天，降解率为46％。在本发明提供的豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3尤其适用于环境中治理典型氟喹诺酮类抗生素的污染，
能够达到环境修复的目的。
附图说明
26.图1为豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3的系统发育树；
27.图2为豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3生长曲线；
28.图3为诺氟沙星对豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3生长情况的影响。
29.图4为环丙沙星对豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3生长情况的影响。
30.图5为恩诺沙星对豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3生长情况的影响。
31.图6为氧氟沙星对豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3生长情况的影响。
具体实施方式
32.下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
33.实施例1豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3的分离和鉴定
34.1.菌种的富集与分离
35.在广州沥滘污水处理厂取好氧污泥，按以下步骤清洗：
①
筛除大颗粒，静置沉淀30min，弃上清液；
②
加入pbs(phosphate buffer saline)溶液再悬浮，涡旋振荡10min，弃上清液。取20ml纯泥加入200ml营养液(成分与含量见表1)，添加诺氟沙星(nor)至10mg/l、醋酸钠0.3g/l。在转子均匀搅拌下取0.1ml 菌悬液(稀释101～104倍)涂布在以诺氟沙星为唯一碳源的msm固体平板培养基上37℃避光培养，直到平板上出现单一的纯菌落。挑选生长状态较好、边缘规则的菌落进行多次纯化。该msm培养基含有诺氟沙星0.05g/l，琼脂粉1.5g/l，其他添加成分与含量见表1。
36.表1：营养液成分与含量
[0037][0038]
2.菌株鉴定
[0039]
分子标记鉴定：采用细菌dna提取试剂盒提取细菌的总dna，采用细菌的16s rrna通用引物，pcr扩增上述菌株的16s rrna序列，然后进行blast比对，再用mega x软件构建系统发育树，得到该菌株的系统发育关系树。
[0040]
所述pcr扩增的条件如下：
[0041]
通用引物：
[0042]
27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'(seq id no:1)
[0043]
1492r：5'-ggctaccttgttacgactt-3'(seq id no:2)
[0044][0045]
pcr扩增程序：
[0046][0047]
对其16s rrna进行测序，blast比对的结果显示，该菌株的16s rrna序列与豚鼠气
单胞菌(aeromonas caviae)同源性高达100％。因此，我们可以判断，该菌株属于豚鼠气单胞菌，命名为豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3，并于 2021年5月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccm 2021633，保藏地点为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏名称为豚鼠气单胞菌 w3(aeromonas caviae w3)。
[0048]
驯化后得到的菌株经16s rrna测序鉴定，blast比对并用mega x软件构建其系统进化关系树，可参看图1，鉴定其为豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)，革兰氏阴性。测序结果见seq id no:3。
[0049]
(3)菌株的生理生化特性
[0050]
豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3为革兰氏阴性菌，在msm平板培养基上菌落呈圆形，表面光滑，湿润易挑起，略有粘连，颜色为透明至白色。菌株生长温度为10～40℃，ph范围6～8，兼性厌氧生长，氧化酶阳性，接触酶阳性。豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3的生长曲线见图2。
[0051]
3.菌株生长曲线的测定
[0052]
用紫外可见分光光度计测量600nm波长下培养液的光密度值，od600的值见图2，细菌接种至培养基后，0～4h曲线平坦稳定，细菌繁殖较少，对新环境有一个短暂适应过程；4h后进入对数期，生长曲线上活菌数直线上升，细菌以稳定的几何级数极快增长，持续约6h；第10h后细菌生长速度放缓，于第22h 左右进入稳定期，生长菌群总数处于平坦阶段。
[0053]
实施例2豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3在好氧条件下对诺氟沙星(nor) 的降解试验
[0054]
1.对实施例1分离纯化的豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3在好氧条件下进行诺氟沙星降解的锥形瓶实验，检测诺氟沙星的降解率及菌株的生长情况 od600。以温度(10～40℃)、ph(6～8)和初始od600(0.2～0.8)为自变量，降解率为因变量，进行三因素三水平响应面分析，设计方案为box-behnken，拟合模型为quadratic。实验数据如下表所示：
[0055]
表1响应面数据结果
[0056][0057][0058]
2.在以诺氟沙星为单一碳源条件下，豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)的生长情况od600总体呈下降趋势。相应面分析模型adjusted r2为0.9558，拟合方程如下：
[0059]
removal(％)＝-861.89+1.06a+238.40b+121.20c+0.96a
×
b+0.57a
×
c+10.92b
ꢀ×
c-0.15a
2-18.47b
2-114.68c2[0060]
其中a为温度(℃)，b为ph，c为初始od600。因此最优实验条件选择温度为27.493℃，ph为7.336，初始od600为0.681，经design expert 11软件拟合，拟合降解率可达到100％。在实际操作中，控制温度为28℃，ph为7.3，初始od600为0.67～0.69。
[0061]
实施例3不同的氟喹诺酮类抗生素对豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3生长情况的影响
[0062]
在装有100ml实施例1所述营养液的锥形瓶中，分别投加四类氟喹诺酮类抗生素药物，分别使诺氟沙星(nor)的初始浓度为75mg/l，环丙沙星(cip) 的初始浓度为65mg/l，恩诺沙星(enr)初始浓度为37.5mg/l，氧氟沙星(ofl) 初始浓度为75mg/l。取对数生长期的菌液于4℃下6000rpm离心6min，弃上清液，加入适量pbs溶液洗涤，离心后取沉淀菌体加少量pbs溶液制备成菌悬液。根据实施例2的实验结果，以初始od600＝0.68接入一定量菌悬液，28℃ph7.3 避光培养，考察不同的氟喹诺酮药物对菌株w3生长情况的影响。
[0063]
结果表明，豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3的生长会受到氟喹诺酮类药物的抑制，且对诺氟沙星和环丙沙星有降解效果，图3为诺氟沙星对豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3生长情况的影响，在诺氟沙星的浓度为75mg/l，好氧条件下，降解8天，降解率可达90％以上。图4为环丙沙星对豚鼠气单胞菌 (aeromonas caviae)w3生长情况的影响，在环丙沙星的浓度为65mg/l，好氧条件下，到实验的第9天，环丙沙星降解率为46％。降解率计算方式如下：
[0064]
诺氟沙星降解率：
[0065]
环丙沙星降解率：
[0066]
图5和图6表明，豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3对恩诺沙星和氧氟沙星没有降解效果。因此豚鼠气单胞菌(aeromonas caviae)w3仅对两类氟喹诺酮类抗生素药物——诺氟沙星和环丙沙星有较好的降解效果，且对诺氟沙星的降解效果最好。
[0067]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。