血清淀粉样蛋白a抗体的重链和轻链可变区、抗体及运用
技术领域
1.本技术涉及抗体生物工程技术领域，具体涉及血清淀粉样蛋白a抗体的重链和轻链可变区、抗体及运用。
背景技术：
2.血清淀粉样蛋白a（serum amyloid a，以下简称saa）是一类多基因编码的多形态蛋白家族，属于急性时相反应蛋白。根据体内表达情况，saa分为急性期saa（acute saa，a-saa）和组成型saa（constiutive saa，c-saa）两类。
3.正常情况下，c-saa 在人体中占saa 总量的＞90%，约占载脂蛋白的1%~2%。大部分c-saa 与高密度脂蛋白3 亚型（hdl3）结合，但并不转移胆固醇。其余约5%的c-saa 结合极低密度脂蛋白（vldl）。在发生急性时相反应时，机体大量释放促炎因子，使a-saa 大量合成，a-saa释放入血液后迅速与hdl3结合，取代载脂蛋白a1（apoa1）成为hdl3上的主要载脂蛋白，从而增发hdl 颗粒。
4.hdl 与saa 结合后可达到hdl 载脂蛋白总量的＞80%。与hdl3 上a-saa 结合时，载脂蛋白a1、a2 的代谢不受影响。而c-saa与hdl3 的结合仍然较低，不会受到a-saa表达水平升高的影响。a-saa 的结构中存在一些氨基酸序列结构能使a-saa 与hdl 结合等，其二级机构则是典型的球蛋白分子结构，含有脂质、钙离子的结合位点，有α螺旋和β折叠。c-saa 与a-saa 相同均是由氨基酸构成的多肽链，但其氨基酸数量与a-saa 不同，多达112 个，主要是由于c-saa 有一个包含非结构蛋白（nss）三肽序列的前两个氨基酸，可与n 末端连接形成糖基化位点的八肽序列插入。a-saa具有多种生物学功能，参与内毒素、胆固醇的代谢转移、抑制免疫反应、淋巴细胞和血管内皮细胞的增值，诱导金属蛋白酶表达、细胞粘附以及迁移等多种生理、病理学过程。
5.在细菌感染或病毒感染中，saa的指标均有明显的升高，因此现在普遍认为，saa相较于cpr（仅在细菌感染过程中指标升高，在病毒感染过程中则无明显变化），具有更好的灵敏度和更广的适用范围，对疾病的尽早诊断并赢得治疗时间具有重要的实践意义。另外，对于淀粉样变性病、肾移植排斥反应、肝癌、乳腺癌、肺癌等疾病症状，saa均可以作为重要的诊断指标。
6.目前，用于临床血清saa检测的方法主要包括放射性免疫测定法（ ria） 、酶联免疫吸附试验（ elisa） 、免疫速率散射比浊法、微球捕获酶免疫法（ meia） 等。这些方法均具有较好的敏感性和特异性，可应用于自动化仪器，大大提高了saa 在临床疾病监测中的应用价值。然而尽管如此，目前国内商品化saa 检测试剂较少，还没有广泛地应用于临床。随着即时检验（ poct） 等快速检测技术的建立，将有助于saa 检测在各级医院门急诊检验中的广泛应用。
7.商品化saa检测试剂盒质量最主要制约因素就是生物活性原材料的质量。从方法学上来说，血清淀粉样蛋白a检测试剂盒大多采用双抗体夹心法，其生物活性原材料就是血清淀粉样蛋白a单克隆抗体。而市场现有的血清淀粉样蛋白a单克隆抗体质量水平参差不
齐，严重限制了试剂盒的质量。另外由于各个生产厂家选取的抗原表位不尽相同，由此免疫得到的小鼠单克隆抗体存在筛选配对困难，时间周期长，形成天然构象困难、易降解、易聚集、通用性不强等问题，限制了saa的应用及推广，给检测试剂研发造成困难，不利于相关疾病的早期诊断及预后，也不利于整个即时检验（ poct） 等快速检测技术的建立。另外，采用来源于小鼠的抗体运用于人体时，作为异源蛋白的单克隆抗体会引起人抗小鼠抗体反应（hama）。hama反应不仅会改变药物的药代动力学和药效学特性，还会干扰免疫测定，造成假阳或假阴现象，影响免疫诊断和疾病治疗。
技术实现要素：
8.为了提高对saa检测的准确率，减少假阳性或假阴性的现象，本技术提供了血清淀粉样蛋白a抗体的重链和轻链可变区、抗体及运用。
9.首先，本技术公开了血清淀粉样蛋白a抗体的重链和轻链可变区，重链可变区中的三个互补决定区如下：vh-cdr1：gfsltsy；vh-cdr2：waggt；vh-cdr3：erngmdy；轻链可变区中的三个互补决定区如下：vl-cdr1：sasssitymh；vl-cdr2：dtsklas；vl-cdr3：qqwrsdppt。
10.可选的，重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.2所示。
11.通过上述方法得到的重链、轻链可变区，既适配于鼠源恒定区，又适配于人源恒定区。
12.可选的，重链可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示。
13.可选的，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.4所示。
14.上述重链、轻链可变区通过如seq id no.1和seq id no.2所示的重链、轻链可变区突变得到，具有更好的亲和性能。
15.另外，本技术还提供了血清淀粉样蛋白a基因工程抗体，抗体重链的氨基酸序列如seq id no.5所示，轻链的氨基酸序列如seq id no.6所示。
16.可选的，抗体的重链氨基酸序列如seq id no.7所示，轻链的氨基酸序列如seq id no.8所示。
17.可选的，抗体的重链氨基酸序列如seq id no.9所示，轻链的氨基酸序列如seq id no.10所示。
18.另外，本技术还提供了上述血清淀粉样蛋白a基因工程抗体的运用，运用于血清淀粉样蛋白a基因工程抗体的运用。
19.本技术的有益效果如下：本技术中所公开的血清淀粉样蛋白a基因工程抗体重链、轻链可变区序列，为构建高亲和力、高质量、特异性强的saa基因工程抗体提供了基础，相较于市面上的各种抗体，在
效价方面具有明显的优势。且通过人源恒定区替换鼠源恒定区后，抗体具有良好的临床符合性且能够有效减少hama效应，有利于相关疾病的早期诊断及预后，在临床即时检验等检测领域有着重要的意义。
附图说明
20.图1为实施例1中抗体检测试剂与市场现行抗体检测试剂符合性检测图。
21.图2为实施例3中抗体检测试剂与市场现行抗体检测试剂符合性检测图。
具体实施方式
22.实施例1，血清淀粉样蛋白a抗体的重链和轻链可变区及抗体，制备方法如下：s1、获取可变区基因：1. 设计重链引物和轻链引物，并进行相应免疫球蛋白g基因序列的合成：选取与saa结合的单克隆抗体之轻链可变区氨基酸序列与重链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列中包括seq id no：1之序列，所述重链可变区氨基酸序列可包括seq id no：2之序列，根据seq id no：1序列和seqid no：2之序列可变区的v基因和ch区、cl区的保守序列特征，分别设计重链引物和轻链引物，并利用杂交瘤细胞进行相应免疫球蛋白g基因序列的合成，得到rna逆转录模板。
23.2. 从杂交瘤细胞总rna逆转录模版中钓取清淀粉样蛋白a基因工程抗体的重链、轻链可变区基因，具体步骤如下：（1） 取一个0.2ml的离心管，在离心管中分别加入10μl的5хtaq buffer试剂、4μl的dntp mixture（10mm each）试剂、1μl本步骤1中得到的杂交瘤细胞总rna逆转录模版、5μl的重链引物、5μl的轻链引物、24.75μl的ddh20试剂和0.25μl的taq dna polymerase（5u/μl）试剂，然后将离心管中的混合物振荡混匀后，放置在离心机上离心；（2） 将步骤（1）中的离心管放置在基因扩增仪模块中进行扩增: 94℃的温度下扩增90min；按照94℃的温度下30s、56℃的温度下30s和72℃的温度下10min的顺序，循环扩增30次；72℃的温度下扩增1min；4℃的温度下扩增直到完成。
24.3.将步骤2中钓取得到的淀粉样蛋白a基因工程重链、轻链可变区基因进行测序，具体步骤如下：（1）在离心管中加入t载体1μl、钓取出来的基因序列片段3μl、10
×
dna ligase buffer试剂1μl、连接酶0.5～1μl和水，将离心管中的混合液混匀并在离心机上离心，使得样品全部沉于管底；（2）离心之后，将离心管置于16℃的温度条件下孵育1～3h，或将离心管置于4℃的温度条件下孵育过夜；（3）将孵育完成之后的样品进行测序，并利用抗体数据库和/或ncbi对测序反馈回来的序列进行分析，确定是否属于需要的抗体序列。
25.s2、血清淀粉样蛋白a抗体的重链和轻链可变区插入表达质粒pcdna3.1中，具体步骤如下：（1）取xbal和agei酶切酶双酶切后的saa抗体重链、轻链及载体质粒pcdna3.1；（2）按照如下公式进行移取saa抗体重链、轻链及载体质粒pcdna3.1所需量：
a.移取量=0.02pm*载体长度/载体浓度；b.移取量=0.04pm*插入片段长度/片段浓度；（3）20ul链接反应体系进行pcr；（4）纯化pcr产物既得插入重链、轻链可变区的质粒。
26.s3、将插入有上述重链和轻链可变区的质粒转化到感受态细胞中，具体步骤如下：（1） 取出多管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；（2） 取出三根ep管100μl感受态细胞，并在其中加入表达质粒20ng 、加入标准超螺旋质粒20ng dna和不加入任何dna的方式形成对照组，然后使用移液器吸打均匀，并在冰上放置30分钟；（3） 将三根ep管分别放置在42℃的水中，水浴热击90秒；然后再将三根ep管快速转移至冰水中，冰浴1～2min（4） 冰浴之后在每根ep管中加900μl无抗lb培养基，并在37℃的摇床上温和摇动，温育45分钟，使细菌复苏；（5） 取适量体积的复苏细菌，均匀涂布于含有抗生素的lb平板上，倒置lb平板，并于37℃的温度中培养12～16小时完成转化。
27.s4、在上述转化完毕的细胞中，提取去内毒素的表达质粒，具体步骤如下：（1）离心获得13ml复苏细菌中的菌体，在菌体中加入260ul buffer n3试剂后放冰上预冷30～60min；（2）预冷后加入500ul solution i/rnasea混和试剂，漩涡振荡使菌体完全悬浮后移到ep管中；（3）在ep管中加入500ul solution ii试剂，颠倒混合后，放冰上冷却2min；（4）在ep管中加入250ul冰预冷的buffer n3试剂，颠倒混合，放冰上冷却1～5min后，在4℃的温度下15000
×
g离心30min；（5）将步骤（4）中ep管内的上清液转移到新的ep管中，加入0.1倍上清液体积的etr后混合，将混合液在冰上放置10min，在放置期间颠倒多次；（6）将步骤（5）中的ep管在42℃的温度环境中放置5min后，在25℃的温度下12000
×
g离心3min；（7）在步骤（6）中的ep管内加入200ul gps试剂，在室温放置3～5min，12000
×
g离心3min后，弃废液；（8）将步骤（7）中的上层清液转移到2个新的ep管内，在每个ep管内均添加0.5倍清液体积的乙醇，混合后，室温放置2min；（9）将步骤（8）中2个ep管内的混合液体全部转移到吸附柱内，10000
×
g离心1min，循环多次；（10）在步骤（9）中的吸附柱内加入500ul buffer hb试剂，10000
×
g离心1min；（11）在步骤（10）中的吸附柱内加入700ul dna wash buffer试剂，10000
×
g离心1min，重复两次；（12）步骤（11）中的吸附柱13000
×
g离心5min；（13）将步骤（12）中的吸附柱架在一个新ep管内，在所述吸附柱内加入125ulelution buffer试剂后，静置5min，然后将ep管10000
×
g离心洗脱2～3min；
（14）不更换ep管，重复步骤（13）；（15）在步骤（14）中的ep管内加入1/10管内液体体积的3m naac 25ul试剂，颠倒混合；（16）在步骤（15）中的ep管内添加0.7倍异丙醇193ul，颠倒混合，室温放置5min，然后在4℃的温度下15000
×
g离心30min，弃上清液；（17）在步骤（16）中的ep管内添加70％乙醇，上下颠倒，在4℃的温度下15000
×
g离心10～30min，无菌环境下弃上清，然后干燥15～20min；（18）在步骤（17）中的干燥物中加入50ul无菌水，在4℃的温度下过夜重溶，完成提取。
28.s5、通过瞬时转染对hek293细胞进行转染。
29.1. 从液氮罐中取出hek293细胞或取出用干冰运输的hek293细胞，进行细胞复苏和培养；传代后的细胞密度控制在0.3
×
10 6 个/毫升，每隔4天传代1次；或传代后的细胞密度控制在0.6
×
10 6 个/毫升，每隔3天传代1次；细胞存活率控制在95％以上，直到完成整个传代培养过程。
30.2.按照0.5x10
6 cells/ml 的接种量往1l的摇瓶的300ml培养基中接种细胞。
31.3.上述细胞于37℃，120rpm，5%二氧化碳浓度的摇床培养箱中孵育24h，直到细胞密度达到1x10
6 cells/ml。
32.4.吸取300ug的dna加到30ml的pbs中，然后涡旋混合3秒，充分混匀。
33.5. 将1.2ml过滤除菌的0.5mg/mlpei溶液加入到pbs/dna的混合液中。
34.6. pei-dna 混合液室温下静置20min。
35.7.将dna/pei混合液加到细胞里，细胞密度必须达到1x10
6 cells/ml。
36.8.转染后，于37℃，120rpm,5%二氧化碳浓度的摇床培养箱中孵育5-6天。
37.s6.对转然后的细胞进行纯化，提取其中的抗体，具体步骤如下：（1）将纯化仪a泵放入结合缓冲液pbs 溶液中平衡柱子，结合缓冲液至少平衡5个柱体积；（2）样品上样：将a泵放入待纯化抗体溶液中，当a280开始上升时收集流川液，待a280下降至基线后停止收集，上样完成a280下降至基线后恢复工作流速4ml/min，用结合液pbs 冲洗4个柱体积至平衡；（3）洗脱：将a泵放入洗脱缓冲液中，洗脱液选用浓度为0.1m的 glycine-hcl，ph=3.2，待a280吸光值增大至50mau时，开始收集洗脱抗体，为保护抗体活性，边收集边滴加中和液（100ul 1m tris-hcl ph8.2），轻轻晃动收集管，点样法用ph试纸检测将抗体溶液ph调至7.0-7.5；（4）透析：用30倍样品体积的1
×
pbs 缓冲液4℃透析，中间换液2次，收集透析后抗体备用，标记为1号抗体。
38.在本实施例中，得到的抗体重链序列如seq id no.5所示，轻链序列如seq id no.6所示。
39.实施例2，血清淀粉样蛋白a抗体的重链和轻链可变区及抗体，与实施例1的区别在于，重链可变区的序列如seq id no.3所示，轻链可变区的序列如seq id no.4所示。重链的序列如seq id no.7所示，轻链序列如seq id no.8所示。
40.本实施例制备得到的抗体，重链恒定区和轻链恒定区均为鼠源型，得到抗体标记为2号抗体。
41.实施例3，血清淀粉样蛋白a抗体的重链和轻链可变区及抗体，与实施例2的区别在于，抗体的重链序列如seq id no.9所示，轻链序列如seq id no.710所示。在本实施例中，重链和轻链的恒定序列均为人源性。
42.对上述抗体进行实验如下。
43.实验1，将1号抗体和2号抗体与shishou2主流saa抗体进行效价对比，具体包括如下步骤：（1）包被：用cb对抗原进行稀释，包被96孔检测板，包被浓度为0.5ug/ml，包被量为100u/孔，置于冰箱4℃包被过夜，pbst洗板3次，并甩干；（2）封闭：将bsa溶于pbs中，配成1%溶液，对酶标板进行封闭，200ul/孔，37℃孵育2h，洗板并甩干；（3）加待测样品：用pbs对待测抗体稀释10ug/ml，然后5倍稀释、稀释7个梯度，留一孔加pbs做阴性对照，并设复孔，37℃孵育30min，洗板并甩干；（4）加二抗：hrp标记羊抗鼠igg进行5000倍稀释，用pbst稀释，100ul/孔加入酶标板，37℃孵育30mim，洗板。
44.（5）显色：按照等体积混合a/b酶联反应显色液（现用现配），加入100ul/孔，37℃显色10min。
45.（6）显色终止：加入终止液50ul/孔。
46.（7）读数：在酶标仪上以450nm单波长测定各孔od值。
47.实验1的实验结果如表1所示。
48.通过上述实验数据可知，1号抗体与市售的主流saa抗体效价接近，2号抗体则具有明显的优势。
49.实验2，对实施例1和3进行符合性检测，从浙江省某医院集临床全血样本50例，采用现有包被抗体，制成试剂盒进行免疫荧光干式定量法，并与广州万孚生物技术股份有限公司的血清淀粉样蛋白a(saa)测定试剂进行比对，结果如表2所示。
50.通过上述实验结果表明，实施例1和实施例3与市面上市售的saa试剂盒，具有较好的相关性，且实施例3相较于实施例1，与市面上常规的saa抗体检测试剂盒的相关性较好。
51.实验3，测定实施例3制备得到的血清淀粉样蛋白a抗体对hama反应的有效性，具体测定方法如下：从杭州市某医院收集临床10例全血样本，经德国西门子医学诊断试剂检测，其中6例saa阳性样本，4例saa阴性样本；该批血液样本经疾控中心检测，显示hama浓度为62.3ng/ml（正常参考值：5.0-12.5ng/ml），具有明显hama效应。分别将1号鼠源性抗体与3号人源嵌合性抗体作为包被抗体，配对公司现有的鼠源性标记抗体，制备血清淀粉样蛋白a测定试剂盒，与德国西门子医学诊断试剂的检测结果进行比对。
52.通过上述实验数据可知，实施例3中的抗体制备得到的试剂盒实验结果相较于实施例1和西门子医学诊断试剂，能够明显地减弱hama效应，证明了实施例3中采用人源性的恒定区具有较好的抵抗hama效应的效果。
53.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权力要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。