一种采用鸡胸软骨提取ii型胶原蛋白的方法及其制品
技术领域
1.本发明涉及胶原蛋白的提取工艺，具体为一种采用鸡胸软骨提取ii型胶原蛋白的方法及其制品。


背景技术：

2.鸡胸软骨为鸡骨上于鸡胸附近有一块白色的软骨，具有清脆的口感，其中，ii型胶原蛋白是软骨基质中最主要的有机成分，具有致密的纤维结构，为软骨组织的特征性蛋白质。鸡胸软骨价格低廉易于获得，ii型胶原蛋白含量高，是很好的ii型胶原蛋白的提取源。可采用鸡胸软骨提取ii型胶原蛋白，制成各类营养品及护肤品，实现资源的升值和多元化利用。
3.ii型胶原蛋白的分子量很高约为30万道尔顿，消化吸收率低，因此将ii型胶原蛋白经酶等处理降解为分子量约为几千到几万道尔顿ii型胶原蛋白水解物是非常必要的。目前市场上的ii型胶原蛋白产品分子量分布不均，吸收效率不高。本发明制得的ii型胶原蛋白为水解分子量约为几千的小分子多肽易被吸收，制得的敷料膜制品能为细胞提供所需的胶原蛋白多肽，促进细胞的增值分化，以达到伤口修复的效果。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种采用鸡胸软骨提取ii型胶原蛋白的方法及其制品，以解决现有技术中存在的问题。
5.一种采用鸡胸软骨提取ii型胶原蛋白的方法，主要包括以下制备步骤：脱脂，粉磨，酸解，酶解，电泳透析，二次粉磨，杀菌。
6.作为优化，所述ii型胶原蛋白制得的制品，还包括以下制备步骤：载体膜的制备，二次电泳，真空封存。
7.作为优化，所述ii型胶原蛋白的制备方法主要包括以下制备步骤：
8.(1)脱脂：将除去骨肉新鲜的鸡胸软骨浸入质量分数0.3～0.5％的氢氧化钠溶液中，在20～30℃，30～40khz超声波振动20～30min，再用纯水洗涤至中性，在-10～-5℃温度，5～10pa压力下干燥4～6h，制得脱脂后的鸡胸软骨；
9.(2)粉磨：将脱脂后的鸡胸软骨在-10～-5℃环境温度下先粉碎至颗粒小于9mm后再置于粉磨机中，在-10～-5℃环境温度下粉磨至颗粒小于1mm，制得鸡胸软骨粉末；
10.(3)酸解：将鸡胸软骨粉末与质量分数0.3～0.5％的盐酸溶液按质量比1：10混合均匀，在1～5℃下静置20～24h，再用纯水洗涤至中性，制得前驱体；
11.(4)酶解：将前驱体和纯水按质量比1：10混合均匀，再加入前驱体质量0.03～0.05倍的乙酸和前驱体质量0.01～0.02倍的胃蛋白酶，在1～5℃下以1000～2000r/min的转速搅拌20～24h，再在1～5℃下以12000～15000r/min的转速离心20～30min，去除本次离心固体沉淀制得酶解上清液；
12.(5)电泳渗析：将酶解上清液加入酶解上清液质量3～5倍的电解液的阳极侧，在阳
极和阴极之间用3000～5000da的透析膜进行分隔，在1～5℃下以30～36v的电压电泳30～40min后，用质量分数0.1％的氢氧化钠溶液将阴极电解液调节至中性并进行过滤，并用纯水洗涤3～5次，制得ii型胶原蛋白胶体；
13.(6)二次粉磨：将ii型胶原蛋白胶体用胶体磨磨成浆，在-10～-5℃温度，5～10pa压力下干燥4～6h，再用超微粉碎机研磨至颗粒小于0.01mm，制得ii型胶原蛋白；
14.(7)杀菌：将ii型胶原蛋白置于高压脉冲电场中，在温度5～10℃下处理20～30s；
15.(8)载体膜制备：将改性石墨烯与乙醚按质量比1：10混合均匀，在120～150℃以聚四氟乙烯为衬底的反应釜中反应12～15h后过滤，用无水乙醇洗涤3～5次，在-10～-5℃温度，5～10pa压力下干燥6h，制得载体膜；
16.(9)二次电泳：以载体膜为阴极，对载体膜质量100～200倍的胶原蛋白电解液进行电泳，在1～5℃下以30～36v的电压电泳8～10min后，将表面附有ii型胶原蛋白载体膜取出，并与水平面成45
°
，用纯水以2ml/s的速度润洗表面3～5min，在1～10℃，5～10pa的压力下干燥6～8h，制得胶原蛋白敷料膜；
17.(10)真空封存：以聚乙烯为包装材料对胶原蛋白敷料膜进行真空密封包装，制得制品。
18.作为优化，步骤(4)所述胃蛋白酶的国际系统编号为ec3.4.23.1。
19.作为优化，步骤(5)所述电解液为质量分数0.1％的氯化钠溶液，并用质量分数0.1％的盐酸将ph调节至4～5。
20.作为优化，步骤(7)所述高压脉冲电场参数为：场强30～50kv/cm，脉冲频率200～400hz。
21.作为优化，步骤(8)所述改性石墨烯的制备方法为：将石墨烯与质量分数为98％的浓硫酸按质量比1：10混合均匀，加入石墨烯质量1倍的高锰酸钾，在50～60℃，30～40khz超声波振荡的条件下反应4～6h，再将反应液控制在1～5℃的条件下加入石墨烯质量0.1～0.3倍过氧化氢，以800～1000r/min的转速搅拌10～15min后，再放入离心机中，在8000～10000r/min的转速离心下分离得氧化石墨烯，将氧化石墨烯用纯水洗涤至中性，再与氧化石墨烯质量100倍的纯水混合均匀，再加入氧化石墨烯质量20～30倍的氢氧化钠和氧化石墨烯质量15～25倍的一氯乙酸，在50～60℃，30～40khz超声波振荡的条件下反应3～4h，并在60～70℃过滤，再与氢氧化钙，水按质量比1：0.1：20混合均匀，在70～80℃下以2000～3000r/min的转速搅拌1～2h后，在70～80℃下过滤，并用纯水洗涤至中性，在-10～-5℃温度，5～10pa压力下干燥4～6h，制备而成。
22.作为优化，步骤(9)所述胶原蛋白电解液的制备方法为：将ii型胶原蛋白与纯水按质量比1：100混合均匀，再加入ii型胶原蛋白质量0.1～0.3倍的氯化钠，并用乙酸调节ph至4～5，制备而成。
23.与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
24.本发明在提取ii型胶原蛋白时，以鸡胸软骨为原料通过脱脂，粉磨，酸解，酶解，电泳透析，二次粉磨，杀菌，制得ii型胶原蛋白，再将ii型胶原蛋白通过载体膜的制备，二次电泳，真空封存制得制品。
25.首先，对鸡胸软骨粉体进行酸解处理，酸解离的氢离子与鸡胸软骨粉体中ii型胶原蛋白质形成氢键的能力更强，使ii型胶原蛋白分子内和分子间氢键断裂，从而解开ii型
胶原蛋白的三螺旋结构，提高了ii型胶原蛋白的溶解度，促进后续步骤的进行；再用胃蛋白酶对酸解后的鸡胸软骨粉体进行酶解，提取酸解后的鸡胸软骨粉体内的ii型胶原蛋白并水解成小分子多肽，使ii型胶原蛋白更易被人体吸收利用；再将酶解液进行电泳渗析，使酶解液中的小分子多肽在电极沉积，除去大分子的酶和固体杂质，同时能快捷的得到高纯度的ii型胶原蛋白。
26.其次，在制得ii型胶原蛋白后以载体膜为电极对ii型胶原蛋白进行二次电泳，使ii型胶原蛋白在载体膜上均匀沉积，制得的制品为胶原蛋白敷料膜；将石墨烯进行氧化再与一氯乙酸，使石墨烯表面产生微孔并引入羧基，羟基和醛基等含氧基团，再与氢氧化钙反应，制得改性石墨烯，再使改性石墨烯之间的含氧官能团的发生交联反应，制得载体膜。使用胶原蛋白敷料膜对伤口进行处理时，胶原蛋白敷料膜可以很好地吸附伤口渗出血液中的水分，使局部血液浓度增大，加速血液凝固，同时胶原蛋白敷料膜上的羧酸钙基团可以解离除钙离子，促进凝血过程，羧酸钙基团解离后提高伤口渗出血液的ph值，进一步促进凝血，胶原蛋白敷料膜上的ii型胶原蛋白可被细胞吸收，促进细胞的增值分化，加快表皮细胞的生成，从而促进伤口的修复。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.为了更清楚的说明本发明提供的方法通过以下实施例进行详细说明，在以下实施例中制作的ii型胶原蛋制品白的各指标测试方法如下：
29.伤口愈合效果：对实验用雄性小鼠取相同体重年龄，对小鼠进行脱毛，清洗消毒后使温控烫伤仪用相同在小鼠相同位置造成相同面积烫伤，用生理盐水清洗后，将各实施例所得的胶原蛋白敷料膜制品与对比例材料取相同质量大小对烫伤进行完全覆盖，并每天进行清洗更换，相同天数后测量伤口面积和愈合面积，计算伤口愈合率＝已愈合面积/初始伤口面积。
30.实施例1
31.一种采用鸡胸软骨提取ii型胶原蛋白的方法及其制品，所述ii型胶原蛋白及其制品的制备方法主要包括以下制备步骤：
32.(1)脱脂：将除去骨肉新鲜的鸡胸软骨浸入质量分数0.3％的氢氧化钠溶液中，在20℃，30khz超声波振动30min，再用纯水洗涤至中性，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，制得脱脂后的鸡胸软骨；
33.(2)粉磨：将脱脂后的鸡胸软骨在-10℃环境温度下先粉碎至颗粒小于9mm后再置于粉磨机中，在-10℃环境温度下粉磨至颗粒小于1mm，制得鸡胸软骨粉末；
34.(3)酸解：将鸡胸软骨粉末与质量分数0.3％的盐酸溶液按质量比1：10混合均匀，在1℃下静置24h，再用纯水洗涤至中性，制得前驱体；
35.(4)酶解：将前驱体和纯水按质量比1：10混合均匀，再加入前驱体质量0.03倍的乙酸和前驱体质量0.01倍的胃蛋白酶，在1℃下以1000r/min的转速搅拌24h，再在1℃下以
12000r/min的转速离心30min，去除本次离心固体沉淀制得酶解上清液；
36.(5)电泳渗析：将酶解上清液加入酶解上清液质量3倍的电解液的阳极侧，在阳极和阴极之间用3000da的透析膜进行分隔，在5℃下以30v的电压电泳40min后，用质量分数0.1％的氢氧化钠溶液将阴极电解液调节至中性并进行过滤，并用纯水洗涤3次，制得ii型胶原蛋白胶体；
37.(6)二次粉磨：将ii型胶原蛋白胶体用胶体磨磨成浆，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，再用超微粉碎机研磨至颗粒小于0.01mm，制得ii型胶原蛋白；
38.(7)杀菌：将ii型胶原蛋白置于高压脉冲电场中，在温度5℃下处理30s；
39.(8)载体膜制备：将改性石墨烯与乙醚按质量比1：10混合均匀，在120℃以聚四氟乙烯为衬底的反应釜中反应15h后过滤，用无水乙醇洗涤3次，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，制得载体膜；
40.(9)二次电泳：以载体膜为阴极，对载体膜质量100倍的胶原蛋白电解液进行电泳，在1℃下以30v的电压电泳10min后，将表面附有ii型胶原蛋白载体膜取出，并与水平面成45
°
，用纯水以2ml/s的速度润洗表面3min，在1℃，5pa的压力下干燥8h，制得胶原蛋白敷料膜；
41.(10)真空封存：以聚乙烯为包装材料对胶原蛋白敷料膜进行真空密封包装，制得制品。
42.作为优化，步骤(4)所述胃蛋白酶的国际系统编号为ec3.4.23.1。
43.作为优化，步骤(5)所述电解液为质量分数0.1％的氯化钠溶液，并用质量分数0.1％的盐酸将ph调节至4。
44.作为优化，步骤(7)所述高压脉冲电场参数为：场强30kv/cm，脉冲频率400hz。
45.作为优化，步骤(8)所述改性石墨烯的制备方法为：将石墨烯与质量分数为98％的浓硫酸按质量比1：10混合均匀，加入石墨烯质量1倍的高锰酸钾，在50℃，30khz超声波振荡的条件下反应6h，再将反应液控制在1℃的条件下加入石墨烯质量0.1倍过氧化氢，以800r/min的转速搅拌10min后，再放入离心机中，在8000r/min的转速离心下分离得氧化石墨烯，将氧化石墨烯用纯水洗涤至中性，再与氧化石墨烯质量100倍的纯水混合均匀，再加入氧化石墨烯质量20倍的氢氧化钠和氧化石墨烯质量15倍的一氯乙酸，在50℃，30khz超声波振荡的条件下反应4h，并在60℃过滤，再与氢氧化钙，水按质量比1：0.1：20混合均匀，在70℃下以2000r/min的转速搅拌2h后，在70℃下过滤，并用纯水洗涤至中性，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，制备而成。
46.作为优化，步骤(9)所述胶原蛋白电解液的制备方法为：将ii型胶原蛋白与纯水按质量比1：100混合均匀，再加入ii型胶原蛋白质量0.1倍的氯化钠，并用乙酸调节ph至5，制备而成。
47.实施例2
48.一种采用鸡胸软骨提取ii型胶原蛋白的方法及其制品，所述ii型胶原蛋白及其制品的制备方法主要包括以下制备步骤：
49.(1)脱脂：将除去骨肉新鲜的鸡胸软骨浸入质量分数0.4％的氢氧化钠溶液中，在25℃，35khz超声波振动25min，再用纯水洗涤至中性，在-8℃温度，8pa压力下干燥5h，制得脱脂后的鸡胸软骨；
50.(2)粉磨：将脱脂后的鸡胸软骨在-8℃环境温度下先粉碎至颗粒小于9mm后再置于粉磨机中，在-8℃环境温度下粉磨至颗粒小于1mm，制得鸡胸软骨粉末；
51.(3)酸解：将鸡胸软骨粉末与质量分数0.4％的盐酸溶液按质量比1：10混合均匀，在3℃下静置22h，再用纯水洗涤至中性，制得前驱体；
52.(4)酶解：将前驱体和纯水按质量比1：10混合均匀，再加入前驱体质量0.04倍的乙酸和前驱体质量0.01倍的胃蛋白酶，在3℃下以1200r/min的转速搅拌22h，再在3℃下以13000r/min的转速离心25min，去除本次离心固体沉淀制得酶解上清液；
53.(5)电泳渗析：将酶解上清液加入酶解上清液质量4倍的电解液的阳极侧，在阳极和阴极之间用4000da的透析膜进行分隔，在3℃下以33v的电压电泳35min后，用质量分数0.1％的氢氧化钠溶液将阴极电解液调节至中性并进行过滤，并用纯水洗涤4次，制得ii型胶原蛋白胶体；
54.(6)二次粉磨：将ii型胶原蛋白胶体用胶体磨磨成浆，在-8℃温度，8pa压力下干燥5h，再用超微粉碎机研磨至颗粒小于0.01mm，制得ii型胶原蛋白；
55.(7)杀菌：将ii型胶原蛋白置于高压脉冲电场中，在温度8℃下处理25s；
56.(8)载体膜制备：将改性石墨烯与乙醚按质量比1：10混合均匀，在130℃以聚四氟乙烯为衬底的反应釜中反应13h后过滤，用无水乙醇洗涤4次，在-8℃温度，8pa压力下干燥6h，制得载体膜；
57.(9)二次电泳：以载体膜为阴极，对载体膜质量150倍的胶原蛋白电解液进行电泳，在3℃下以33v的电压电泳9min后，将表面附有ii型胶原蛋白载体膜取出，并与水平面成45
°
，用纯水以2ml/s的速度润洗表面4min，在5℃，8pa的压力下干燥7h，制得胶原蛋白敷料膜；
58.(10)真空封存：以聚乙烯为包装材料对胶原蛋白敷料膜进行真空密封包装，制得制品。
59.作为优化，步骤(4)所述胃蛋白酶的国际系统编号为ec3.4.23.1。
60.作为优化，步骤(5)所述电解液为质量分数0.1％的氯化钠溶液，并用质量分数0.1％的盐酸将ph调节至4。
61.作为优化，步骤(7)所述高压脉冲电场参数为：场强40kv/cm，脉冲频率300hz。
62.作为优化，步骤(8)所述改性石墨烯的制备方法为：将石墨烯与质量分数为98％的浓硫酸按质量比1：10混合均匀，加入石墨烯质量1倍的高锰酸钾，在55℃，35khz超声波振荡的条件下反应5h，再将反应液控制在3℃的条件下加入石墨烯质量0.2倍过氧化氢，以900r/min的转速搅拌12min后，再放入离心机中，在9000r/min的转速离心下分离得氧化石墨烯，将氧化石墨烯用纯水洗涤至中性，再与氧化石墨烯质量100倍的纯水混合均匀，再加入氧化石墨烯质量25倍的氢氧化钠和氧化石墨烯质量10倍的一氯乙酸，在55℃，35khz超声波振荡的条件下反应3h，并在65℃过滤，再与氢氧化钙，水按质量比1：0.1：20混合均匀，在75℃下以2500r/min的转速搅拌2h后，在75℃下过滤，并用纯水洗涤至中性，在-8℃温度，8pa压力下干燥5h，制备而成。
63.作为优化，步骤(9)所述胶原蛋白电解液的制备方法为：将ii型胶原蛋白与纯水按质量比1：100混合均匀，再加入ii型胶原蛋白质量0.2倍的氯化钠，并用乙酸调节ph至5，制备而成。
64.实施例3
65.一种采用鸡胸软骨提取ii型胶原蛋白的方法及其制品，所述ii型胶原蛋白及其制品的制备方法主要包括以下制备步骤：
66.(1)脱脂：将除去骨肉新鲜的鸡胸软骨浸入质量分数0.5％的氢氧化钠溶液中，在30℃，40khz超声波振动20min，再用纯水洗涤至中性，在-5℃温度，10pa压力下干燥4h，制得脱脂后的鸡胸软骨；
67.(2)粉磨：将脱脂后的鸡胸软骨在-5℃环境温度下先粉碎至颗粒小于9mm后再置于粉磨机中，在-5℃环境温度下粉磨至颗粒小于1mm，制得鸡胸软骨粉末；
68.(3)酸解：将鸡胸软骨粉末与质量分数0.5％的盐酸溶液按质量比1：10混合均匀，在5℃下静置20h，再用纯水洗涤至中性，制得前驱体；
69.(4)酶解：将前驱体和纯水按质量比1：10混合均匀，再加入前驱体质量0.05倍的乙酸和前驱体质量0.02倍的胃蛋白酶，在5℃下以2000r/min的转速搅拌20h，再在5℃下以15000r/min的转速离心20min，去除本次离心固体沉淀制得酶解上清液；
70.(5)电泳渗析：将酶解上清液加入酶解上清液质量5倍的电解液的阳极侧，在阳极和阴极之间用5000da的透析膜进行分隔，在5℃下以36v的电压电泳30min后，用质量分数0.1％的氢氧化钠溶液将阴极电解液调节至中性并进行过滤，并用纯水洗涤5次，制得ii型胶原蛋白胶体；
71.(6)二次粉磨：将ii型胶原蛋白胶体用胶体磨磨成浆，在-5℃温度，10pa压力下干燥6h，再用超微粉碎机研磨至颗粒小于0.01mm，制得ii型胶原蛋白；
72.(7)杀菌：将ii型胶原蛋白置于高压脉冲电场中，在温度10℃下处理20s；
73.(8)载体膜制备：将改性石墨烯与乙醚按质量比1：10混合均匀，在150℃以聚四氟乙烯为衬底的反应釜中反应12h后过滤，用无水乙醇洗涤5次，在-5℃温度，10pa压力下干燥6h，制得载体膜；
74.(9)二次电泳：以载体膜为阴极，对载体膜质量200倍的胶原蛋白电解液进行电泳，在5℃下以36v的电压电泳8min后，将表面附有ii型胶原蛋白载体膜取出，并与水平面成45
°
，用纯水以2ml/s的速度润洗表面5min，在10℃，10pa的压力下干燥6h，制得胶原蛋白敷料膜；
75.(10)真空封存：以聚乙烯为包装材料对胶原蛋白敷料膜进行真空密封包装，制得制品。
76.作为优化，步骤(4)所述胃蛋白酶的国际系统编号为ec3.4.23.1。
77.作为优化，步骤(5)所述电解液为质量分数0.1％的氯化钠溶液，并用质量分数0.1％的盐酸将ph调节至4。
78.作为优化，步骤(7)所述高压脉冲电场参数为：场强50kv/cm，脉冲频率200hz。
79.作为优化，步骤(8)所述改性石墨烯的制备方法为：将石墨烯与质量分数为98％的浓硫酸按质量比1：10混合均匀，加入石墨烯质量1倍的高锰酸钾，在60℃，40khz超声波振荡的条件下反应4h，再将反应液控制在5℃的条件下加入石墨烯质量0.3倍过氧化氢，以1000r/min的转速搅拌10min后，再放入离心机中，在10000r/min的转速离心下分离得氧化石墨烯，将氧化石墨烯用纯水洗涤至中性，再与氧化石墨烯质量100倍的纯水混合均匀，再加入氧化石墨烯质量30倍的氢氧化钠和氧化石墨烯质量25倍的一氯乙酸，在60℃，40khz超
声波振荡的条件下反应3h，并在70℃过滤，再与氢氧化钙，水按质量比1：0.1：20混合均匀，在80℃下以3000r/min的转速搅拌1h后，在80℃下过滤，并用纯水洗涤至中性，在-5℃温度，10pa压力下干燥4h，制备而成。
80.作为优化，步骤(9)所述胶原蛋白电解液的制备方法为：将ii型胶原蛋白与纯水按质量比1：100混合均匀，再加入ii型胶原蛋白质量0.3倍的氯化钠，并用乙酸调节ph至5，制备而成。
81.对比例1
82.一种采用鸡胸软骨提取ii型胶原蛋白的方法及其制品，所述ii型胶原蛋白及其制品的制备方法主要包括以下制备步骤：
83.(1)脱脂：将除去骨肉新鲜的鸡胸软骨浸入质量分数0.3％的氢氧化钠溶液中，在20℃，30khz超声波振动30min，再用纯水洗涤至中性，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，制得脱脂后的鸡胸软骨；
84.(2)粉磨：将脱脂后的鸡胸软骨在-10℃环境温度下先粉碎至颗粒小于9mm后再置于粉磨机中，在-10℃环境温度下粉磨至颗粒小于1mm，制得鸡胸软骨粉末；
85.(3)酸解：将鸡胸软骨粉末与质量分数0.3％的盐酸溶液按质量比1：10混合均匀，在1℃下静置24h，再用纯水洗涤至中性，制得前驱体；
86.(4)酶解：将前驱体和纯水按质量比1：10混合均匀，再加入前驱体质量0.03倍的乙酸和前驱体质量0.01倍的胃蛋白酶，在1℃下以1000r/min的转速搅拌24h，再在1℃下以12000r/min的转速离心30min，去除本次离心固体沉淀制得酶解上清液；
87.(5)电泳渗析：将酶解上清液加入酶解上清液质量3倍的电解液的阳极侧，在阳极和阴极之间用3000da的透析膜进行分隔，在5℃下以30v的电压电泳40min后，用质量分数0.1％的氢氧化钠溶液将阴极电解液调节至中性并进行过滤，并用纯水洗涤3次，制得ii型胶原蛋白胶体；
88.(6)二次粉磨：将ii型胶原蛋白胶体用胶体磨磨成浆，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，再用超微粉碎机研磨至颗粒小于0.01mm，制得ii型胶原蛋白；
89.(7)杀菌：将ii型胶原蛋白置于高压脉冲电场中，在温度5℃下处理30s；
90.(8)载体膜制备：将石墨烯与乙醚按质量比1：10混合均匀，在120℃以聚四氟乙烯为衬底的反应釜中反应15h后过滤，用无水乙醇洗涤3次，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，制得载体膜；
91.(9)涂覆：将ii型胶原蛋白与纯水按质量比1：1混合均匀，再涂覆在ii型胶原蛋白质量1倍的载体膜上，在1℃，5pa的压力下干燥8h，制得胶原蛋白敷料膜；
92.(10)真空封存：以聚乙烯为包装材料对胶原蛋白敷料膜进行真空密封包装，制得制品。
93.作为优化，步骤(4)所述胃蛋白酶的国际系统编号为ec3.4.23.1。
94.作为优化，步骤(5)所述电解液为质量分数0.1％的氯化钠溶液，并用质量分数0.1％的盐酸将ph调节至4。
95.作为优化，步骤(7)所述高压脉冲电场参数为：场强30kv/cm，脉冲频率400hz。
96.对比例2
97.一种采用鸡胸软骨提取ii型胶原蛋白的方法及其制品，所述ii型胶原蛋白及其制
品的制备方法主要包括以下制备步骤：
98.(1)脱脂：将除去骨肉新鲜的鸡胸软骨浸入质量分数0.3％的氢氧化钠溶液中，在20℃，30khz超声波振动30min，再用纯水洗涤至中性，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，制得脱脂后的鸡胸软骨；
99.(2)粉磨：将脱脂后的鸡胸软骨在-10℃环境温度下先粉碎至颗粒小于9mm后再置于粉磨机中，在-10℃环境温度下粉磨至颗粒小于1mm，制得鸡胸软骨粉末；
100.(3)酸解：将鸡胸软骨粉末与质量分数0.3％的盐酸溶液按质量比1：10混合均匀，在1℃下静置24h，再用纯水洗涤至中性，制得前驱体；
101.(4)酶解：将前驱体和纯水按质量比1：10混合均匀，再加入前驱体质量0.03倍的乙酸和前驱体质量0.01倍的胃蛋白酶，在1℃下以1000r/min的转速搅拌24h，再在1℃下以12000r/min的转速离心30min，去除本次离心固体沉淀制得酶解上清液；
102.(5)电泳渗析：将酶解上清液加入酶解上清液质量3倍的电解液的阳极侧，在阳极和阴极之间用3000da的透析膜进行分隔，在5℃下以30v的电压电泳40min后，用质量分数0.1％的氢氧化钠溶液将阴极电解液调节至中性并进行过滤，并用纯水洗涤3次，制得ii型胶原蛋白胶体；
103.(6)二次粉磨：将ii型胶原蛋白胶体用胶体磨磨成浆，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，再用超微粉碎机研磨至颗粒小于0.01mm，制得ii型胶原蛋白；
104.(7)杀菌：将ii型胶原蛋白置于高压脉冲电场中，在温度5℃下处理30s；
105.(8)载体膜制备：将石墨烯与乙醚按质量比1：10混合均匀，在120℃以聚四氟乙烯为衬底的反应釜中反应15h后过滤，用无水乙醇洗涤3次，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，制得载体膜；
106.(9)二次电泳：以载体膜为阴极，对载体膜质量100倍的胶原蛋白电解液进行电泳，在1℃下以30v的电压电泳10min后，将表面附有ii型胶原蛋白载体膜取出，并与水平面成45
°
，用纯水以2ml/s的速度润洗表面3min，在1℃，5pa的压力下干燥8h，制得胶原蛋白敷料膜；
107.(10)真空封存：以聚乙烯为包装材料对胶原蛋白敷料膜进行真空密封包装，制得制品。
108.作为优化，步骤(4)所述胃蛋白酶的国际系统编号为ec3.4.23.1。
109.作为优化，步骤(5)所述电解液为质量分数0.1％的氯化钠溶液，并用质量分数0.1％的盐酸将ph调节至4。
110.作为优化，步骤(7)所述高压脉冲电场参数为：场强30kv/cm，脉冲频率400hz。
111.作为优化，步骤(9)所述胶原蛋白电解液的制备方法为：将ii型胶原蛋白与纯水按质量比1：100混合均匀，再加入ii型胶原蛋白质量0.1倍的氯化钠，并用乙酸调节ph至5，制备而成。
112.对比例3
113.一种采用鸡胸软骨提取ii型胶原蛋白的方法及其制品，所述ii型胶原蛋白及其制品的制备方法主要包括以下制备步骤：
114.(1)脱脂：将除去骨肉新鲜的鸡胸软骨浸入质量分数0.3％的氢氧化钠溶液中，在20℃，30khz超声波振动30min，再用纯水洗涤至中性，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，制得
脱脂后的鸡胸软骨；
115.(2)粉磨：将脱脂后的鸡胸软骨在-10℃环境温度下先粉碎至颗粒小于9mm后再置于粉磨机中，在-10℃环境温度下粉磨至颗粒小于1mm，制得鸡胸软骨粉末；
116.(3)酸解：将鸡胸软骨粉末与质量分数0.3％的盐酸溶液按质量比1：10混合均匀，在1℃下静置24h，再用纯水洗涤至中性，制得前驱体；
117.(4)酶解：将前驱体和纯水按质量比1：10混合均匀，再加入前驱体质量0.03倍的乙酸和前驱体质量0.01倍的胃蛋白酶，在1℃下以1000r/min的转速搅拌24h，再在1℃下以12000r/min的转速离心30min，去除本次离心固体沉淀制得酶解上清液；
118.(5)电泳渗析：将酶解上清液加入酶解上清液质量3倍的电解液的阳极侧，在阳极和阴极之间用3000da的透析膜进行分隔，在5℃下以30v的电压电泳40min后，用质量分数0.1％的氢氧化钠溶液将阴极电解液调节至中性并进行过滤，并用纯水洗涤3次，制得ii型胶原蛋白胶体；
119.(6)二次粉磨：将ii型胶原蛋白胶体用胶体磨磨成浆，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，再用超微粉碎机研磨至颗粒小于0.01mm，制得ii型胶原蛋白；
120.(7)杀菌：将ii型胶原蛋白置于高压脉冲电场中，在温度5℃下处理30s；
121.(8)载体膜制备：将改性石墨烯与乙醚按质量比1：10混合均匀，在120℃以聚四氟乙烯为衬底的反应釜中反应15h后过滤，用无水乙醇洗涤3次，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，制得载体膜；
122.(9)二次电泳：以载体膜为阴极，对载体膜质量100倍的胶原蛋白电解液进行电泳，在1℃下以30v的电压电泳10min后，将表面附有ii型胶原蛋白载体膜取出，并与水平面成45
°
，用纯水以2ml/s的速度润洗表面3min，在1℃，5pa的压力下干燥8h，制得胶原蛋白敷料膜；
123.(10)真空封存：以聚乙烯为包装材料对胶原蛋白敷料膜进行真空密封包装，制得制品。
124.作为优化，步骤(4)所述胃蛋白酶的国际系统编号为ec3.4.23.1。
125.作为优化，步骤(5)所述电解液为质量分数0.1％的氯化钠溶液，并用质量分数0.1％的盐酸将ph调节至4。
126.作为优化，步骤(7)所述高压脉冲电场参数为：场强30kv/cm，脉冲频率400hz。
127.作为优化，步骤(8)所述改性石墨烯的制备方法为：将石墨烯与质量分数为98％的浓硫酸按质量比1：10混合均匀，加入石墨烯质量1倍的高锰酸钾，在50℃，30khz超声波振荡的条件下反应6h，再将反应液控制在1℃的条件下加入石墨烯质量0.1倍过氧化氢，以800r/min的转速搅拌10min后，再放入离心机中，在8000r/min的转速离心下分离得氧化石墨烯，将氧化石墨烯用纯水洗涤至中性，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，制备而成。
128.作为优化，步骤(9)所述胶原蛋白电解液的制备方法为：将ii型胶原蛋白与纯水按质量比1：100混合均匀，再加入ii型胶原蛋白质量0.1倍的氯化钠，并用乙酸调节ph至5，制备而成。
129.对比例4
130.一种采用鸡胸软骨提取ii型胶原蛋白的方法及其制品，所述ii型胶原蛋白及其制品的制备方法主要包括以下制备步骤：
131.(1)脱脂：将除去骨肉新鲜的鸡胸软骨浸入质量分数0.3％的氢氧化钠溶液中，在20℃，30khz超声波振动30min，再用纯水洗涤至中性，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，制得脱脂后的鸡胸软骨；
132.(2)粉磨：将脱脂后的鸡胸软骨在-10℃环境温度下先粉碎至颗粒小于9mm后再置于粉磨机中，在-10℃环境温度下粉磨至颗粒小于1mm，制得鸡胸软骨粉末；
133.(3)酸解：将鸡胸软骨粉末与质量分数0.3％的盐酸溶液按质量比1：10混合均匀，在1℃下静置24h，再用纯水洗涤至中性，制得前驱体；
134.(4)酶解：将前驱体和纯水按质量比1：10混合均匀，再加入前驱体质量0.03倍的乙酸和前驱体质量0.01倍的胃蛋白酶，在1℃下以1000r/min的转速搅拌24h，再在1℃下以12000r/min的转速离心30min，去除本次离心固体沉淀制得酶解上清液；
135.(5)电泳渗析：将酶解上清液加入酶解上清液质量3倍的电解液的阳极侧，在阳极和阴极之间用3000da的透析膜进行分隔，在5℃下以30v的电压电泳40min后，用质量分数0.1％的氢氧化钠溶液将阴极电解液调节至中性并进行过滤，并用纯水洗涤3次，制得ii型胶原蛋白胶体；
136.(6)二次粉磨：将ii型胶原蛋白胶体用胶体磨磨成浆，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，再用超微粉碎机研磨至颗粒小于0.01mm，制得ii型胶原蛋白；
137.(7)杀菌：将ii型胶原蛋白置于高压脉冲电场中，在温度5℃下处理30s；
138.(8)载体膜制备：将改性石墨烯与乙醚按质量比1：10混合均匀，在120℃以聚四氟乙烯为衬底的反应釜中反应15h后过滤，用无水乙醇洗涤3次，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，制得载体膜；
139.(9)涂覆：将ii型胶原蛋白与纯水按质量比1：1混合均匀，再涂覆在ii型胶原蛋白质量1倍的载体膜上，在1℃，5pa的压力下干燥8h，制得胶原蛋白敷料膜；
140.(10)真空封存：以聚乙烯为包装材料对胶原蛋白敷料膜进行真空密封包装，制得制品。
141.作为优化，步骤(4)所述胃蛋白酶的国际系统编号为ec3.4.23.1。
142.作为优化，步骤(5)所述电解液为质量分数0.1％的氯化钠溶液，并用质量分数0.1％的盐酸将ph调节至4。
143.作为优化，步骤(7)所述高压脉冲电场参数为：场强30kv/cm，脉冲频率400hz。
144.作为优化，步骤(8)所述改性石墨烯的制备方法为：将石墨烯与质量分数为98％的浓硫酸按质量比1：10混合均匀，加入石墨烯质量1倍的高锰酸钾，在50℃，30khz超声波振荡的条件下反应6h，再将反应液控制在1℃的条件下加入石墨烯质量0.1倍过氧化氢，以800r/min的转速搅拌10min后，再放入离心机中，在8000r/min的转速离心下分离得氧化石墨烯，将氧化石墨烯用纯水洗涤至中性，再与氧化石墨烯质量100倍的纯水混合均匀，再加入氧化石墨烯质量20倍的氢氧化钠和氧化石墨烯质量15倍的一氯乙酸，在50℃，30khz超声波振荡的条件下反应4h，并在60℃过滤，再与氢氧化钙，水按质量比1：0.1：20混合均匀，在70℃下以2000r/min的转速搅拌2h后，在70℃下过滤，并用纯水洗涤至中性，在-10℃温度，5pa压力下干燥6h，制备而成。
145.效果例
146.下表1给出了采用本发明实施例1至3与对比例1至4的ii型胶原蛋白的制品的伤口
愈合效果的分析结果。
147.表1
[0148] 伤口愈合率 伤口愈合率实施例192.3％对比例155.7％实施例293.5％对比例263.6％实施例392.7％对比例382.2％
ꢀꢀ
对比例481.3％
[0149]
从表1中实施例1，实施例2和实施例3的实验数据比较可发现，实施例1，实施例2和实施例3的伤口愈合率基本不变，说明在本发明制备方法的工艺参数范围类改变温度，压力，反应时间等对最后生产制品的伤口愈合率影响不大，均能达到较好的伤口治愈效果；从实施例1和对比列1的实验数据比较可发现，实施例1对比对比例1的伤口愈合率升高，说明了对石墨烯进行改性，并通过二次电泳制得的制品比不改性直接涂覆制得的制品的治愈效果更好；从实施例1和对比例2实验数据比较可发现，实施例1对比对比例2的伤口愈合率升高，对石墨烯进行改性后，使改性石墨烯表面增加孔隙并能交联成网络层状结构，从而提高了对ii型胶原蛋白的负载效果，从而促进细胞的增值分化，同时改性石墨烯上的羧酸钙基团可以解离除钙离子，促进凝血过程，羧酸钙基团解离后提高伤口渗出血液的ph值，进一步促进凝血，从而提高了伤口愈合效果；从实施例1对比对比例3实验数据比较可发现，实施例1对比对比例3的伤口愈合率升高，说明了对石墨烯氧化后进一步进行改性，改性石墨烯上的羧酸钙基团可以解离除钙离子，促进凝血过程，羧酸钙基团解离后提高伤口渗出血液的ph值，进一步促进凝血，从而提高了伤口愈合效果；从实施例1对比对比例4实验数据比较可发现，实施例1对比对比例4的伤口愈合率升高，说明了经二次电泳制得的制品比经涂覆制得的制品更加均匀细密，从而提高了伤口愈合效果。
[0150]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。