1.本发明属于微生物
技术领域：
：，具体涉及一种腹泻型肠易激综合征肠道微生物标志物及其应用。
背景技术：
：：2.腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominantirritablebowelsyndrome，ibs-d)是一种以腹泻、腹胀与腹痛为主要症状的胃肠道紊乱性肠病，且往往出现反复发作。由于ibs-d的病因和发病机制尚未完全明确，且临床表现缺乏特异性，使诊断存在一定困难。肠易激综合征中诊断生物标志物的识别一直是人们感兴趣的问题，并可能在未来达到ibs-d的快速诊断。目前ibs-d的诊断主要是基于临床症状，因此诊断存在主观性，易漏诊、误诊。随着基础和临床研究的深入，一些潜在的ibs相关生物学标记物受到广泛关注，以期寻找客观指标辅助ibs诊断。尽管肠动力学、粪便性状、自主神经反应性、粪便胰蛋白酶水平等曾被作为ibs-d的潜在生物学标记，但此类指标诊断ibs-d的价值有限。目前的研究已经发现ibs-d的发生发展与肠道微生态出现紊乱有着密切的关系。近年来发现肠道生物失调与腹泻型肠易激综合征的发病机制有关，其中诸多与ibs-d发病机制密切相关的菌属，部分菌属可能具有潜在诊断价值。3.来自动物和人类的研究都有证据支持胃肠道微生物群在肠易激综合征的发展和持续性中的关键作用。首先，无菌小鼠模型提供了直接证据，证明肠微生物群可以诱导局部肠功能障碍，导致微生物群的改变以及肠易激综合征的特征，如4周小鼠内脏过敏。在移植的小鼠中也发现了行为变化，这表明生物失调可能是导致肠易激综合征的行为症状和结肠运动功能障碍的原因。使用一系列定性和定量的微生物方法在所有细菌分类都报道了ibs-d的肠膜和粘膜胃肠道微生物组与对照组的差异。肠道微生物群落的多样性、组成、功能方面与肠易激综合征症状有很强的相关性。根据这些特点，有研究将肠菌作为食物制剂，用以改善和促进动物机体的健康发育。而动物的肠易激综合征症状也与肠道微生物有很强的关系，肠道微生物通过肠-脑轴可引起宿主的肠易激综合征的焦虑和抑郁症状。另外，腹泻型肠易激综合征肠道微生物物种多样性也明显低于健康个体，根据肠菌的偏好性就可以很好的将腹泻型肠易激综合、健康的个体鉴别，其准确性可达到90％，进一步说明了发现与腹泻型肠易激综合征症状显著相关的肠道微生物有较高的可行性。4.事实上，发现并提供与腹泻型肠易激综合征症状显著关联的微生物标记物在小鼠模型研究和治疗ibs-d中都具有重要意义。在未来，该类肠菌也可为研发改善ibs-d类微生物制品提供参考素材，并且也可能用于治疗ibs-d的微生态制剂。技术实现要素：5.针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供了一种腹泻型肠易激综合征肠道微生物标志物及其应用。本发明提供的微生物标志物具有特异性高、敏感性强、检测对象采集处理简易、无侵害性、成本低等优点；该标志物的发现为诊断微生物腹泻型肠易激综合征提供了参考。6.为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：7.一种腹泻型肠易激综合征肠道微生物标志物，包括staphylococcus属、akkermansia属、enterobacter属、dubosiella属、lactobacillus属。8.优选地，所述staphylococcus属与enterobacter属菌群的相对丰度在腹泻型肠易激综合征动物模型组中显示升高，akkermansia属、dubosiella属、lactobacillus属菌群的相对丰度在腹泻型肠易激综合征动物模型中则下降。9.优选地，所述相对丰度的计算方式为组间差异显著物种分析，通过采用线性判别分析进而来估算各个组分丰度对各组肠道菌群之间的差异效果的影响大小。10.本发明还提供了一种所述腹泻型肠易激综合征肠道微生物标志物的筛选方法，包括如下步骤：11.s1、将c57小鼠随机分成2组，即正常对照组、模型组，通过慢性束缚联合灌胃番泻叶建立ibs-d小鼠模型；ibs-d小鼠模型构建成功后(稀便率、awr评分作为指标表明了ibs-d小鼠模型的成功建立)，无菌环境下收集各组小鼠的粪便，随后对粪便样本的总dna进行提取，通过16srrna基因测序方法对腹泻型肠易激综合征动物小鼠模型和正常模型小鼠模型的粪便进行检测，通过对数据分析，比较腹泻型肠易激综合征动物模型和正常小鼠模型肠道菌群组成差异；12.s2、物种分类学分析：通过将otu的代表序列与微生物参考数据库进行比对可得到与每个otu所相对应的物种分类信息，进而各对样品的肠道菌群在各水平的物种组成进行统计，利用qiime软件生成不同分类水平上的肠道菌群内物种的丰度表，再通过r语言工具对样品在各分类学水平下的微生物丰度前十的肠道菌群物种结构绘制成图；13.s3、肠道微生物筛选：lefse分析，即组间差异显著物种分析，通过采用线性判别分析进而来估算各个组分丰度对各组肠道菌群之间的差异效果的影响大小，通过采用该分析来找到在各组之间肠道菌群在丰度上具有显著性差异的物种；默认设置ldascore的筛选值为4.0；筛选出在腹泻型肠易激综合征c57小鼠肠道中高丰度的且差异最为显著的五种细菌作为标记物，即得。14.优选地，步骤s1所述的16srrna基因测序方法为：于无菌环境下收集健康与腹泻型肠易激综合征c57小鼠微生物样品，随后通过使用powersoildnaisolationkit试剂盒对粪便样本中的微生物基因组dna进行提取，按试powersoildnaisolationkit试剂盒说明书提供的步骤进行相关操作；根据细菌的16srrnav3～v4区设计引物进行扩增，随后通过illuminamiseq平台进行相关的高通量测序。15.优选地，所述引物为v3-v4(按细菌双高变v3～v4区合成带有样本识别标记(barcode)的特异性引物)，其上游引物序列为v3-v4-f，序列信息如seqidno.1所示，下游引物为v3-v4-r，序列信息如seqidno.2所示；进行扩增时的pcr扩增体系包括：模板dna40～60ng，正向和反向引物各1.5μl，q5highfidelitydnapolymerase0.2μl，highgcenhancer10μl，reactionbuffer10μl，dntpmix1μl，使用灭菌后的双蒸水补充总体系至50μl；反应条件为：95℃预变性5min；95℃进行1min，50℃进行1min，72℃进行1min，共15个循环；最后72℃延伸进行7min，4℃保存。16.5'-actcctacgggaggcagca-3'(seqidno.1)；17.5'-ggactachvgggtwtctaat-3'(seqidno.2)；18.优选地，步骤s1所述的数据分析过程包括数据预处理、alpha多样性分析、beta多样性分析。19.优选地，步骤s2所述的各水平包括门，纲，目，科，属，种。20.本发明还提供了一种所述腹泻型肠易激综合征肠道微生物标志物在制备或筛选腹泻型肠易激综合征检测产品中的用途。21.本发明中，staphylococcus属的具体分类学特征为：bacteria；firmicutes；bacilli；bacillales；staphylococcaceae；staphylococcus；s__uncultured_bacterium_g_staphylococcus；akkermansia属的具体分类学特征为：bacteria；verrucomicrobia；verrucomicrobia；verrucomicrobiales；verrucomicrobiaceae；akkermansia；uncultured_bacterium_g_akkermansia；dubosiella属的具体分类学特征为：bacteria；firmicutes；erysipelotrichia；erysipelotrichaleserysipelotrichaceae；dubosiella；s__uncultured_bacterium_g_dubosiella；enterobacter属的具体分类学特征为：bacteria；firmicutes；proteobacteria；enterobacteriales；enterobacteriaceae；enterobacter；lactobacillus属的具体分类学特征为：bacteria；firmicutes；bacilli；lactobacillales；lactobacillaceae；lactobacillus；s__uncultured_bacterium_g_lactobacillus。22.本发明在试验过程中，使用的慢性束缚为世界著名肠易激综合征模型，williamscl等人.stress-inducedchangesinintestinaltransitintherat:amodelforirritablebowelsyndrome[j].gastroenterology,1988,94(3):611-621.慢性束缚联合灌胃番泻叶建立ibs-d为世界著名腹泻型肠易激综合征模型之一，lil等人.synergisticeffectofberberine-basedchinesemedicineassemblednanostructuresondiarrhea-predominantirritablebowelsyndromeinvivo[j].frontpharmacol,2020,11:1210.。[0023]与现有技术相比，本发明提供的腹泻型肠易激综合征肠道微生物标志物具有如下优势：利用腹泻型肠易激综合征c57小鼠肠道微生物异于健康c57小鼠肠道微生物的特性，筛选出能够用于腹泻型肠易激综合征有关的肠菌标记物。该标记物在腹泻型肠易激综合征c57小鼠肠道中富集，小鼠表现为腹泻、饮食摄入量减少、精神疲劳、体重减轻、皮毛枯萎、淀粉松弛和迟钝，该标记物的发现为诊断微生物腹泻型肠易激综合征提供了参考，另外，可用于研发改善腹泻型肠易激综合征的微生物制剂。附图说明：[0024]图1为腹泻型肠易激综合征模型评价结果图；[0025]图2为腹泻型肠易激综合征模型与正常小鼠与健康肠道微生物的alpha多样性分析结果；[0026]图3为腹泻型肠易激综合征模型与正常小鼠肠道微生物的beta多样性分析结果图；[0027]图4为腹泻型肠易激综合征模型与正常小鼠肠道微生物的物种分类学分析结果图；[0028]图5为腹泻型肠易激综合征模型与正常小鼠肠道微生物的肠道微生物筛选分析结果图；[0029]图6为staphylococcus属、akkermansia属、enterobacter属、dubosiella属、lactobacillus属在con组和model组肠道中的丰度结果图。具体实施方式[0030]下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。[0031]实施例1慢性束缚联合灌胃番泻叶[0032]spf级c57bl/6j小鼠16只，体重(20±2)g，雄性，由广东省医学动物中心提供，动物合格证号：scxk(粤)2018-0002。实验前，将动物置于实验室适应环境中，自由进食、饮水，室温(22±2)℃，正常昼夜节律。实验过程中实验动物的饲养管理和实验操作过程均遵守广东药科大学实验动物中心相关规定。[0033]称取番泻叶60g，300ml蒸馏水煎煮。10min后用双层纱布过滤得到上清液。高温煎煮后将质量浓度浓缩到0.6g/ml，-20℃冰箱保存，每天给药前25℃水浴加热，小鼠每天用10ml/kg小鼠胃内给药两次，接受急性约束应力28天，建立ibs-d模型。[0034]实施例2模型评价[0035]通过滤纸印迹法计算造模后6h小鼠排便的总粒数以及稀便粒数。稀便的判断以滤纸上有无污迹来判断。稀便率(％)＝稀便粒数/粪便总粒数×100％。根据造模后小鼠排出的稀便在滤纸上污迹直径对稀便进行分级：1级，污迹直径《1cm；2级，污迹直径1～2cm；3级，污迹直径2～3cm；4级，污迹直径3～4cm；5级，污迹直径4～5cm。腹泻指数＝稀便率×稀便级。小鼠禁食24h，将石蜡油润滑后的6fr导尿管经肛门插入，将球囊末端放在距离肛门1.0cm左右，用医用胶带把导尿管和小鼠尾巴根部固定。将其放在平台上，待小鼠适应环境后，逐渐注水使球囊扩张，扩张容量分别为0.25ml、0.35ml、0.50ml，每次直肠扩张持续30s，由观察者进行腹部撤离反射(awr)评估。重复进行3次，数据取均值。awr评分标准：0分：对扩张无明显行为反应；1分：在刺激开始仅有短暂的头部运动，随后停止运动；2分：有轻微的腹部肌肉收缩，但不能把腹部抬离平台；3分：有强烈的腹部肌肉收缩，可以把腹部抬离平台；4分：腹部肌肉强直收缩，使身体成弓形，腹部抬高，骨盆结构直立和提睾反射。[0036]如图1所示，稀便率、awr评分分别为2级以上和5分以上，表明了ibs-d小鼠模型的成功建立。其中，con组和model组分别指正常组和腹泻型肠易激综合征模型组小鼠。a)腹泻情况；b)内脏敏感性。[0037]实施例3粪便收集及检测[0038]选取造模成功ibs-d小鼠和健康小鼠各6只，粪便样品均来自spf动物房饲养的成年雄性c57小鼠模型。用无菌镊子将自然排出的新鲜小鼠模型粪便放入无菌干燥收集管内，放置于液氮里，30min内送回实验室，存于-80℃冰箱。通过使用powersoildnaisolationkit试剂盒对各组小鼠粪便样本中的微生物基因组dna进行提取，根据保守区设计得到引物，即本技术seqidno.1-2所示的引物，在引物末端加上测序接头，进行pcr扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化纯化、定量和均一化(pcr产物根据电泳定量(imagej软件)结果，按照质量比1:1进行混样后，采用omegadna纯化柱进行过柱纯化，然后使用1.8％的琼脂糖凝胶，120v40min电泳后，切目的片段，并回收)形成测序文库，总结整个建库过程为：目标区域pcr、solexapcr、nanodrop定量及混养、过柱纯化、切胶回收，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库干冰运送至百迈克测序公司测序用illuminahiseq2500进行测序。所述目标区域pcr体系共配制10μl：基因组dna50ng±20％、*vnf(10μm)0.3μl、*vnr(10μm)0.3μl、kodfxneobuffer5μl、dntp(2mmeach)2μl、kodfxneo0.2μl、ddh2o补至10μl；pcr反应条件为95℃5min；95℃30s，50℃30s，72℃40s，25cycles；72℃7min；4℃∞。所述solexapcr体系共配制20μl：目的区域pcr纯化产物5μl，★mppi-a(2μm)2.5μl，★mppi-b(2μm)2.5μl，2×q5hfmm10μl；pcr反应条件为：98℃30s；98℃10s，65℃30s，72℃30s，10cycles；72℃5min。[0039]高通量测序(如illuminahiseq等测序平台)得到的原始图像数据文件，经碱基识别(basecalling)分析转化为原始测序序列(sequencedreads)，结果以fastq(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。[0040]实施例4菌群分析[0041]对测序结果进行以下分析：(1)数据预处理：根据pereads之间的overlap关系，将通过illuminahiseq测序所得到的双端序列数据进行拼接(merge)，构建成一条序列tags，并同时对reads的质量以及merge的效果进行质控过滤。主要有如下3个步骤：①pereads拼接：通过使用flashv1.2.7软件，对每个样品的reads进行overlap来拼接，最后所得到的拼接序列即为原始tags数据(rawtags)；②tags过滤：通过使用trimmomaticv0.33软件，对拼接得到的rawtags进行过滤，得到高质量的tags数据(cleantags)；③去除嵌合体：通过使用uchimev4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据(effectivetags)。信息分析内容：划分otu、多样性及差异性分析；[0042](2)alpha多样性分析：利用alpha多样性分析法分析各组小鼠盲肠内容物的稀释曲线(测序条数作为横坐标，并基于此测序条数经otu聚类后得到otu数量作为纵坐标)、shannon指数曲线(测序条数作为横坐标，shannon指数作为纵坐标)、等级丰度曲线(otu数量作为横坐标，相对丰度作为纵坐标；若曲线越平滑下降则表明样本的多样性高，曲线越陡然下降则表明样本的多样性低)[0043](3)beta多样性分析：主坐标分析法(principalcoordinatesanalysis,pcoa)是一种与pca类似的降维排序方法，通过对不同样品有衡量它们之间差异或距离的数据，就可以用此方法找出一个直角坐标系，将n个样品表示成n个点，而使点间的欧式距离的平方正好等于原来的差异数据，实现定性数据的定量转换，从多维数据中提取出最主要的元素和结构。通过主坐标分析可以实现多个样品的分类，进一步展示样品间物种多样性差异。两个样品之间的距离越近，则表示这两个样品肠道菌群之间的组成越相似。使用r语言工具绘制pcoa分析图。[0044](4)物种分类学分析：通过将otu的代表序列与微生物参考数据库进行比对可得到与每个otu所相对应的物种分类信息，进而各对样品的肠道菌群在各水平(门，纲，目，科，属，种)的物种组成进行统计，利用qiime软件生成不同分类水平上的肠道菌群内物种的丰度表，再通过r语言工具对样品在各分类学水平下的肠道菌群物种结构绘制成图。[0045](5)肠道微生物筛选：lefse分析，即组间差异显著物种分析(可以称作生物标记物分析)，通过采用线性判别分析(lda)进而来估算各个组分(物种)丰度对各组肠道菌群之间的差异效果的影响大小，通过采用该分析来找到在各组之间肠道菌群在丰度上具有显著性差异的物种。[0046]通过上述分析比较旨在找出ibs-d小鼠模型和健康小鼠模型粪便中微生物组成的差异及各组样本中的优势物种，即肠道细菌菌属staphylococcus属、akkermansia属、enterobacter属、dubosiella属、lactobacillus属；具体结果如图2-图6所示，其中，图5中，a表示con组和model组粪便微生物在门、纲、目、科、属、种水平(从内到外)的物种差异分析；b表示标志物筛选/lefse分析结果：在lda》4.0的情况下，在属水平上model组中2个属表达升高，3个属表达下降(p《0.05)。[0047]需要说明的是，尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
：，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。当前第1页12当前第1页12