专利名称：对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌o124与o164的o－抗原特异的核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及痢疾志贺氏菌3型(Shigella dysenteriae 3)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及痢疾志贺氏菌3型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124(Escherichia coliO124)和大肠杆菌O164(Escherichia coli O164)并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenlociimplication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-693 0；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO 111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Joumal ofBacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖问联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是志贺氏菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测志贺氏菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia colt”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 16417-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。
志贺氏菌有46种血清型，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification ofthe Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and O164 and Shigella Oantigens”J.clin Microbiol，17(4)681-684]，其中痢疾志贺氏菌3型和大肠杆菌O124就拥有相同的O-抗原[Dmitriev，B.A.，et al(1976)“Cell-walllipopolysaccharide of the‘Shigella -like’Escherichia coliO124”Eur.J.Biochem.64491-498]，还与大肠杆菌O136的O-抗原相关。另外，痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原的结构都已知[Dmitriev，B.A.，et al(1977)Carbohydr.Res，56207-209；Malin Linnerborg.，et al(1999)“Structural studies of the O-antigen polysaccharide from the enteroinvasiveEscherichia coli O 164 cross-reacting with Shigella dysenteriae type 3”Eur.J.Biochem，266460-466]，如下图所示。从图中可看出它们的O-抗原结构很相似，不同的是在痢疾志贺氏菌3型的O-抗原结构中支链的最后一个糖上比大肠杆菌O164多一个基团；此外在痢疾志贺氏菌3型的O-抗原结构中主链上有一个β-D-Galp，而在大肠杆菌O164的O-抗原结构中主链上有一个α-D-Galp，传统的血清学方法不能将它们区分。
痢疾志贺氏菌3型和大肠杆菌O124的O-抗原结构→6)-β-D-Galf-(1→3)-β-D-GalpNAc-(1→3)-β-D-Galp-(1→α4CH3 ↑↑ 1HOOCCH-4)-β-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp大肠杆菌O164的O-抗原结构→6)-β-D-Galf-(1→3)-β-D-GalpNAc-(1→3)-α-D-Galp-(1→α4↑1β-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp
本发明的一个目的是提供了痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的次一目的是提供了构成痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的基因转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf4、orf5、orf7、orf9基因；糖合成路径基因，包括galf基因；两个功能未知的基因，包括orf2、orf3。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf4、orf5、orf7、orf9基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因、源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164的O-抗原也是高度特异的。
本发明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164的O-抗原及检测和鉴定痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164。
本发明的再一目的是提供了分离痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长12629个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其由9个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因包括关于转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf4、orf5、orf7、orf9基因；其中所述的wzx基因是SEQ ID NO1中的1111至2625碱基的核苷酸；orf4基因是SEQ ID NO1中的5151至6155碱基的核苷酸；orf5基因是SEQ ID NO1中的6152至6940碱基的核苷酸；wzy基因是SEQ ID NO1中的7014至8117碱基的核苷酸；orf7基因是SEQ ID NO1中的8146至9195碱基的核苷酸；orf9基因是SEQ ID NO1中的10435至11208碱基的核苷酸。
前述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf4、orf5、orf、orf9基因；或糖合成路径基因中的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
前述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的1221至1240碱基的核苷酸和2148至2167碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的1220至1238碱基的核苷酸和1884至1903碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的1835至1853碱基的核苷酸和2325至2345碱基的核苷酸；源于orf4的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的5931至5909碱基的核苷酸和5824至5843碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5377至5396碱基的核苷酸和6107至6125碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5575至5594碱基的核苷酸和6114至6132碱基的核苷酸；源于orf5的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的6182至6200碱基的核苷酸和6874至6895碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的6168至6186碱基的核苷酸和6824至6842碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的6172至6190碱基的核苷酸和6172至6190碱基的核苷酸；源于wzy的寡核苷酸对是SEQID NO1中的7969至7990碱基的核苷酸和7256至7276碱基的核苷酸，SEQID NO1中的7257至7277碱基的核苷酸和7768至7786碱基的核苷酸，SEQID NO1中的7410至7430碱基的核苷酸和7955至7973碱基的核苷酸；源于orf7的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的8410至8428碱基的核苷酸和9109至9127碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的8405至8423碱基的核苷酸和9242至9260碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的8449至8467碱基的核苷酸和9040至9059碱基的核苷酸；源于orf9的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的10450至10468碱基的核苷酸和11123至11141碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10451至10469碱基的核苷酸和10803至10821碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10565至10583碱基的核苷酸和11124至11142碱基的核苷酸；前述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原，并成为细菌疫苗。
前述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，可用这些方法检测人体和环境中的细菌。
前述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养痢疾志贺氏菌3型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增痢疾志贺氏菌3型中的O-抗原基因簇以痢疾志贺氏菌3型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管longPCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3MNaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5□细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了痢疾志贺氏菌12型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再根据已得到的序列设计引物，再从痢疾志贺氏菌3型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。在痢疾志贺氏菌3型中我们根据已得到的序列设计了两对引物，如下所示上游引物5′-TACTCTCCGCACAACGTC-3′和下游引物5′-TGCCCAATCATCACTATCA-3′；上游引物5′-TAATCCCTCTGACAATAGTG-3′和下游引物5′-GCAATGTCAGAAACTC-3′。
(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证1)对痢疾志贺氏菌12型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到痢疾志贺氏菌3型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到9个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因的筛选针对痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf4、orf5、orf7、orf9基因设计引物。在每个基因内各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，所有引物都在大肠杆菌O124和O164中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf4、orf5、orf7、orf9基因对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164及其O-抗原都是高度特异的。
也就是，本发明的第一个方面，提供了痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全长12629个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通过本发明的方法得到了痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的结构，如表3所述，它总共由9个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf4、orf5、orf7、orf9基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括glf基因；两个功能未知的基因，包括orf2、orf3基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在图2中。本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164的O-抗原是高度特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因，包括orf4、orf5、orf7、orf9基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物，虽然在有些菌中得到了PCR产物带，但其大小不符合预期大小，这是由于引物结合到基因组的别的位置造成，这种问题可通过用基因内的其它引物做PCR来避免。所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164及它们的O-抗原是高度特异的。
所述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤1)基因组的提取；2)PCR扩增痢疾志贺氏菌3型中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所用，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。更确切的说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的1111至2625碱基)，orf4基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的5151至6155碱基)，orf5基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的6152至6940碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的7014至8117碱基)，orf7基因(核苷酸位置是从SEQID NO1的8146至9195碱基)，orf9基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的10435至11208碱基)。源于以上基因内的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164都是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因；也源于糖合成路径基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸与源于糖合成路径基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明者考虑到以下情况当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达痢疾志贺氏菌3型的O-抗原，并成为有用的疫苗。
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养痢疾志贺氏菌3型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。实施例2通过PCR扩增痢疾志贺氏菌3型中的O-抗原基因簇以痢疾志贺氏菌3型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGT GNG CCT GGATTA AGT TCG C-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long TemplatePCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。实施例3构建O-抗原基因簇文库。
首先是连接产物的获得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5uldNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD6000.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清液液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清液液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇文库。实施例4对文库中的克隆测序。
从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再根据已得到的序列设计引物，再从痢疾志贺氏菌3型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。在痢疾志贺氏菌3型中剩余20％的序列是根据已得到的序列设计两对引物，再从痢疾志贺氏菌3型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序获得的，引物如下所示上游引物5′-TACTCTCCGCACAACGTC-3′和下游引物5′-TGCCCAATCATCACTATCA-3′；上游引物5′-TAATCCCTCTGACAATAGTG-3′和下游引物5′-GCAATGTCAGAAACTC-3′实施例5核苷酸序列的拼接及分析。
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证1)对痢疾志贺氏菌12型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到痢疾志贺氏菌3型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到9个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1与E.coli O157H7的wzx基因在440个氨基酸中有17％的氨基酸序列是一样的，即有17％的相同性，42％的相似性；而且和Bacteroides fragilis的wzx基因在506个氨基酸中有20％的相同性，42％的相似性，此wzx基因有13个潜在的穿膜区，而通过Eisenberg等的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984)“Analysis of membrane and surface proteinsequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179125-142]发现orf6也有13个潜在的穿膜区，而且与许多wzx蛋白相似，orf6在wzx蛋白的氨基端有一个大约50个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf6是wzx基因，命名为wzx。orf2与Sinorhizobium meliloti的一个假设的蛋白在363个氨基酸中有34％的相同性，有52％的相似性，暂时将orf2命名为orf2基因。orf3也与Sinorhizobium meliloti的一个假设的蛋白在226个氨基酸中有23％的相同性，42％的相似性，暂时将orf3命名为orf3基因。orf4与Streptococcus thernophilus的eps9I基因在239个氨基酸中有30％的相同性，54％的相似性，而eps9I基因是糖基转移酶基因；另外orf4与Streptococcus agalactiae的CpsIaI基因在310个氨基酸中有29％的相同性，47％的相似性，CpsIaI基因是一个N-乙酰糖基转移酶基因，所以认为orf4是一个糖基转移酶基因，命名为orf4。orf5与大肠杆菌的cap8J基因表现出较高的同源性，此基因编码半乳糖基转移酶，所以orf5是半乳糖基转移酶基因，命名为orf5。orf6是一个预测带有10个跨膜片段的蛋白，它的内膜的拓扑结构具有众所周知的O-抗原聚合酶的典型特征，此外，它与E.coli的编码O-抗原聚合酶的wzy基因在355个氨基酸中有23％的相同性，44％的相似性；与Streptococcus thermophilus的wzy基因在353个氨基酸中有22％的相同性，44％的相似性，所以命名orf6为wzy基因。orf7与Streptococcus pneumoniae中编码半乳糖基转移酶的cpsI基因和Streptococcus pneumoniae中编码半乳糖基转移酶的cps23FU基因在氨基酸水平上分别有34.5％和33％的相同性，而在痢疾志贺氏菌3型的O-抗原结构中有半乳糖，所以确定orf7也是一个半乳糖基转移酶基因，命名为orf7。orf8有63％的氨基酸序列与E.coli K12的O-抗原基因簇的glf基因的氨基酸序列相同，表明它们之间有高度的同源性。此外，glf基因编码的酶催化合成糖Galf，这正是痢疾志贺氏菌3型O-抗原结构中的成分，所以推测orf8是glf基因，命名为glf。orf9与Bifidobacterium longum的基因BL0045和Bacteoides fragilis的wcfN基因在氨基酸水平上拥有33％的相同性，而这两个基因是胞外多糖基因簇中的糖基转移酶基因。因此orf9也是一个糖基转移酶基因，命名为orf9基因。
根据痢疾志贺氏菌3型的结构推测它应有四个糖基转移酶基因，分别转移五个糖以合成O-抗原的寡糖单位。需要wzx基因将寡糖单位转移到膜外，wzy基因将寡糖单位聚合成多糖，寡糖单位中的特殊单糖也由O-抗原基因簇合成，如Galf由glf基因合成，这些基因在痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇里都被发现。但在痢疾志贺氏菌3型O-抗原的结构里还有GalNAc。在Yersina enterocolitica O8中，UDP-GalNAc是由gne基因编码的半乳糖变位酶催化UDP-GlcNAc生成的，在痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇里还没有发现gne基因，但是Peter Reeves等通过PCR发现在某些菌如E.coli O124中的其他基因簇里有gne基因，也即是O-抗原基因簇外的gne基因转化UDP-GlcNAc生成UDP-GalNAc提供O-抗原合成必需的糖，所以我们认为gne基因可能在痢疾志贺氏菌3型的其他基因簇里。实施例6特异基因的筛选。
针对痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf4、orf5、orf7、orf9基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
在表1中列出了痢疾志贺氏菌3型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166株大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166株大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共27组，它们的来源都列于表中。
在第24组中含有痢疾志贺氏菌3型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR在94℃预变性2分钟后，94℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy、orf4、orf5、orf7、orf9基因，每个基因都有三对引物被检测，每对引物除了在第24组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在第19组和第20组中也都得到同样大小的特异性带。以这两组中的每个菌的基因组DNA做模板PCR后，发现只在大肠杆菌O124和O164中得到了阳性结果。更详细地说，以上每个基因的每一对引物都在大肠杆菌O124和O164中得到预期大小的正确的PCR产物带。说明痢疾志贺氏菌3型的wzx、wzy、orf4、orf5、orf7、orf9基因也都存在于大肠杆菌O124和O164的O抗原基因簇中。另外，源于orf9基因的三对引物在大肠杆菌O136中都得到阳性结果，而其他基因的引物在大肠杆菌O136中都未得到阳性结果。正如背景技术所介绍，痢疾志贺氏菌3型和大肠杆菌O124的O-抗原结构是一样的，和大肠杆菌O164的O-抗原结构很相似，和大肠杆菌O136的O-抗原结构相关，我们的结果从另一个侧面证实了这一点。除了上述情况外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf4、orf5、orf7、orf9基因对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164及其O-抗原都是高度特异的。
最后，通过PCR从痢疾志贺氏菌3型中筛选到对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164的O-抗原高度特异的基因wzx、wzy和四个糖基转移酶基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的结构，共由9个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个ATG和GTG。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>南开大学<120>对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164特异的核苷酸<130>对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164特异的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12629<212>DNA<213>Shigella dysenteriae<400>1attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc 60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgagcagcg cgtgaagcgt120caactgttgg cggaagtaca atctatctgt ccgccgggcg tgaccattat gaacgtgcgt180cagggtgaac ctttaggttt aggccactcc atcttatgtg cgcgacctgc cattggtgac240aacccattta tcgtggtact gccagacgta gtgatcgacg acgccagcgc cgacccgctg300cgctacaacc ttgctgccat gattgcgcgc ttcaacgaaa cgggccgtag ccaggtgctg360gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca tccagaccaa agaaccgctg420gaccgtgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag480acgctggact cagacatcat ggccgtaggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg540gaactagaac gcactcagcc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgctattgcc600gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgcc atgctgatga ctggagacag ctacgactgc660ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttt gtgaagtacg gactgcgtaa 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cttttggtca acaatcaagg taatgatctt 10980ctttcctgga aaggatattt tatgcttcga aatcttttct acctgcataa aacgtatggg 11040accaatttcc ttgttagaca aaaacctatc gtattgggat taggatatgc attgtcgtgt 11100gtattgaaat gcaatttttc tcaacttccc gttatatggc gtgctttttg ggattcatct 11160acgttaagaa ataccgaaaa attcaggccc gaaatgagaa gtaaataatt tattattatg 11220tttttattaa ttaatgtcga tttttactaa aattcttaac acgatattta tccctgacag 11280gagtaaacaa tgtcaaagca acagatcggc gtcgtcggta tggcagtgat ggggcgcaac 11340cttgcgctca acatcgaaag ccgtggttat accgtctcta ttttcaaccg ttcccgtgaa 11400aaaacggaag aagtgattgc cgaaaatcca ggcaaaaaac tggttcctta ctatacggtg 11460aaagagtttg ttgaatctct ggaaacgcct cgtcgcatcc tgttaatggt gaaagcaggt 11520gcaggcacgg atgctgctat tgattctctc aagccatacc tcgataaagg tgacatcatc 11580attgatggtg gtaacacctt cttccaggac accattcgtc gtaaccgtga gctttctgca 11640gaaggcttta acttcattgg taccggtgtt tccggcggtg aagagggggc gctgaaaggg 11700
ccgtccatca tgcctggtgg ccagaaagaa gcctatgaac tggttgcacc gatcctgacc11760aaaatcgccg cagtagctga agacggggag ccatgcgtta cctatattgg tgccgatggt11820gcaggtcact atgtgaagat ggttcacaac ggtattgaat acggtgatat gcaactgatt11880gctgaagcct attctctgct taaaggtggc ctgaacctca ccaacgaaga actggcgcag11940acctttaccg agtggaataa cggtgaactg agcagctacc tgatcgacat cactaaagac12000atcttcacta aaaaagatga agacggtaac tacctggttg atgtgattct ggatgaagca12060gcaaacaaag gtaccggtaa atggactagc cagagcgcgc tggatctcgg cgaaccgctg12120tcgctgatta ccgagtctgt gtttgcacgt tatatctctt ctctgaaaga tcagcgcgtt12180gccgcgtcta aagttctcac tggcccgaaa gcacagccag ctggcgaaaa ggctgagttc12240atcgaaaaag ttcgtcgtgc gctgtatctg ggcaaaatcg tttcttacgc tcagggcttc12300tctcagctac gcgccgcgtc tgaagagtac aactgggatc tgaactacgg cgaaatcgcg12360aagattttcc gtgctggttg catcatccgt gcgcagttcc tgcagaaaat caccgatgcc12420tatgccgaaa atccgcagat cgctaacctg ctgctggctc cgtacttcaa gcaaattgcc12480gatgactacc agcaggcgct gcgcgatgtc gtcgcttacg cagtacagaa cggtatcccg12540gttccgacct tcgccgctgc ggttgcctat tatgacagct accgttctgc tgttctgcct12600gcgaacctaa tccaggccca gcgcgacta 12629表1 痢疾志贺氏菌3型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据

*在一组中产生一条错误大小的带；**在一组中产生两条错误大小的带表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源组号 该组中含有的菌株 来源1野生型大肠杆菌O1，O2，O3，O4，O10，O16，O18，O39 IMVSa2野生型大肠杆菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100 IMVS3野生型大肠杆菌O102，O109，O1 19，O120，O121，O125，O126，O137 IMVS4野生型大肠杆菌O138，O139，O149，O7，O5，O6，O11，O12 IMVS5野生型大肠杆菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22 IMVS6野生型大肠杆菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30 IMVS7野生型大肠杆菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42 IMVS8野生型大肠杆菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53 IMVS9野生型大肠杆菌O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61 IMVS10野生型大肠杆菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70 IMVS11野生型大肠杆菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81 IMVS12野生型大肠杆菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90 IMVS13野生型大肠杆菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101 IMVS14野生型大肠杆菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118 IMVS15野生型大肠杆菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171 See b16野生型大肠杆菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132， See c17野生型大肠杆菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143 IMVS18野生型大肠杆菌O144，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152 IMVS19野生型大肠杆菌O153，0154，O155，O156，O157，O158，O159，O164 IMVS20野生型大肠杆菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111 IMVS21野生型大肠杆菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110 IMVS22鲍氏志贺氏菌血清型B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14See d23鲍氏志贺氏菌血清型B1，B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18 See d24痢疾志贺氏菌血清型D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8 See d25痢疾志贺氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13 See d26弗氏志贺氏菌F6a，F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v7)F5(v4)See d27宋内氏志贺氏菌D5，DR See da. Institude of Medical and VeterinaryScience，Ane1aide，Australiab.O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc.172 and 173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVSd. 中国预防医学科学院流行病学研究所表3是痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的结构表 表4是痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇中的基因的位置表ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC 60GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT120CAACTGTTGG CGGAAGTACA ATCTATCTGT CCGCCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT180CAGGGTGAAC CTTTAGGTTT AGGCCACTCC ATCTTATGTG CGCGACCTGC CATTGGTGAC240AACCCATTTA TCGTGGTACT GCCAGACGTA GTGATCGACG ACGCCAGCGC CGACCCGCTG300CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGC TTCAACGAAA CGGGCCGTAG CCAGGTGCTG360GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TCCAGACCAA AGAACCGCTG420GACCGTGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG480ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTAGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG540GAACTAGAAC GCACTCAGCC TGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCTATTGCC600GAACTGGCGA AAAAACAGTC CGTTGATGCC ATGCTGATGA CTGGAGACAG CTACGACTGC660GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTACG GACTGCGTAA CCTGAAAGAA720GGGGCGAAGT TCCGCAAAGG TATTGAGAGG TTGTTGAATG ATTAAAAACA TGAACAAATA780TAACGGTAAA TAAGAGAAAT TGTAACGGCA GTGAGGATTT GCGGCGAAGC TCAAACGTGG840CGAATATCCC TGTCGTTATT TATTAATAAA TCATCGTACT AACAATGGAA TAAAAAAGTG900CCTTGTTTTA AGTTTTACAG GATATTCCTT GTTTCTGGAG GAGATTGATA AGGCAATCAG960CATCTGAATT TATCAGAACT TGTGTGTCTT GCTGATTACA TTGTTATATT CATGCAGTGT 1020ACTGGTAGCT GTGGAGCCAG GGGCGGTAGC GTGCATTAAT ATTCACAATA TATTCTTTTA 1080orf1的起始AATGTAAGCA GAATTAATCG AACCTAAATA ATGTCACGTA ACAAAATAAT CATAAAGAAT 1140ACTATGTTTT TGGCAACAAG AACTTTAGTT TCTTTAAGTG TTTCATTTTA CACAACAAGA 1200ATAGTTATAC AACAGTTGGG GGCGGCAGAC TATGGCTTAT TTAATATCAT TTATGGAGTT 1260GTAACATTTT TTACATTCGT AGTCACCGCG ATGAATGATT CTGTACAGCG TTATATTGCA 1320ATAGGTGTTG GTTCACAAAA AATATCGGTT ATTAGAGATG CTGTAAAAAA TAGTATGTTT 1380ATATTTGTTA TATCTGCTTT CATATTGGCA GTATGTCTTC TTTTGGCAAG GGGGGTGATC 1440ATACATAATA TTTTAAATAT ACCTAAAGAT TCTATTGAAA ATGCAAGTGT 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GTCGCTTACG CAGTACAGAA CGGTATCCCG12540GTTCCGACCT TCGCCGCTGC GGTTGCCTAT TATGACAGCT ACCGTTCTGC TGTTCTGCCT12600GCGAACCTAA TCCAGGCCCA GCGCGACTA 12629以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长12629个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其由9个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
3.按照权利要求2所述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因包括关于转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf4、orf5、orf7、orf9基因；其中所述的wzx基因是SEQ ID NO1中的1111至2625碱基的核苷酸；orf4基因是SEQ ID NO1中的5151至6155碱基的核苷酸；orf5基因是SEQ ID NO1中的6152至6940碱基的核苷酸；wzy基因是SEQ ID NO1中的7014至8117碱基的核苷酸；orf7基因是SEQ ID NO1中的8146至9195碱基的核苷酸；orf9基因是SEQ ID NO1中的10435至11208碱基的核苷酸。
4.按照权利要求1或2所述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因即orf4、orf5、orf7、orf9基因；或糖合成路径基因中的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
5.按照权利要求4所述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的1221至1240碱基的核苷酸和2148至2167碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的1220至1238碱基的核苷酸和1884至1903碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的1835至1853碱基的核苷酸和2325至2345碱基的核苷酸；源于orf4基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的5391至5409碱基的核苷酸和5824至5843碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5377至5396碱基的核苷酸和6107至6125碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5575至5594碱基的核苷酸和6114至6132碱基的核苷酸；源于orf5基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的6182至6200碱基的核苷酸和6874至6895碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的6168至6186碱基的核苷酸和6824至6842碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的6172至6190碱基的核苷酸和6584至6602碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的7969至7990碱基的核苷酸和7256至7276碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的7257至7277碱基的核苷酸和7768至7786碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的7410至7430碱基的核苷酸和7955至7973碱基的核苷酸；源于orf7基因的寡核苷酸对是SEQ IDNO1中的8410至8428碱基的核苷酸和9109至9127碱基的核苷酸，SEQ IDNO1中的8405至8423碱基的核苷酸和9242至9260碱基的核苷酸，SEQ IDNO1中的8449至8467碱基的核苷酸和9040至9059碱基的核苷酸；源于orf9基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的10450至10468碱基的核苷酸和11123至11141碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10451至10469碱基的核苷酸和10803至10821碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10565至10583碱基的核苷酸和11124至11142碱基的核苷酸。
6.权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
7.权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原，并成为细菌疫苗。
8.权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
9.权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养痢疾志贺氏菌3型，离心收集细胞，用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清液液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增痢疾志贺氏菌3型中的O-抗原基因簇以痢疾志贺氏菌3型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C-3’)，用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1MMnCl2，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTp，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5□细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再根据已得到的序列设计引物，该引物如下所示上游引物5′-TACTCTCCGCACAACGTC-3′和下游引物5′-TGCCCAATCATCACTATCA-3′；上游引物5′-TAATCCCTCTGACAATAGTG-3′和下游引物5′-GCAATGTCAGAAACTC-3′。再从痢疾志贺氏菌3型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证1)对痢疾志贺氏菌3型的基因组作6个LongPCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到痢疾志贺氏菌3型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到9个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因的筛选针对痢疾志贺氏菌3型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf4、orf5、orf7、orf9基因设计引物。在每个基因内各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，所有引物都在大肠杆菌O124和O164中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf4、orf5、orf7、orf9基因对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和O164及其O-抗原都是高度特异的。
全文摘要
本发明提供一种对痢疾志贺氏菌3型(Shigelladysenteriae3)、大肠杆菌O124(Escherichia coli O124)和大肠杆菌O164(Escherichia coli O164)的O－抗原特异的核苷酸，它是痢疾志贺氏菌3型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长12629个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；还包括源于痢疾志贺氏菌3型的O－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸。本发明通过PCR证实寡核苷酸对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的O－抗原都有高度的特异性。本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌O124和大肠杆菌O164的方法。
文档编号C07H21/00GK1442422SQ0310958
公开日2003年9月17日 申请日期2003年4月15日 优先权日2003年4月15日
发明者王磊, 杨静华, 冯露 申请人:南开大学