1.本发明涉及纳米铂技术领域，尤其涉及的是一种利用莲花水提物绿色合成纳米铂的方法及应用。


背景技术：

2.纳米粒子是尺寸不超过100纳米的固体结构，可以应用在催化、光电子学、传感、成像以及基因和药物输送等领域。在纳米粒子中，铂纳米粒子因其催化活性以及安全性，被广泛用于生物领域。目前，主要利用化学和物理方法合成常规的有机纳米粒子，如化学还原、热分解、溶胶凝胶、激光消融等。
3.如中国专利申请号为：cn202110417723.1，公开一种用于肉桂醛加氢反应的纳米铂催化剂的制备方法。
4.上述专利中记载如下技术方案：
5.采用简单的共沉淀或水热反应，一步制备出二维片层mgal-ldh载体，利用沉淀剂调控溶液ph值，实现对ldh片层大小的精准调控。采用该方法制备的纳米铂催化剂，利用ldh载体层板对pt纳米粒子的“限域”作用，以及金属与载体间的强相互作用，使得pt纳米粒子高度分散，平均粒径为2.1nm，显著提高肉桂醛选择加氢反应的催化性能。在肉桂醛选择加氢反应中使用上述催化剂后，肉桂醛的转化率可达到79.8％，产物肉桂醇的选择性可达到82.1％；该制备方法具有方法简单、普适性强等优点，而且制备获得的催化剂具有催化性能高、稳定性好等优点。
6.然而，这些方法存在一些缺点，如成本高，或者使用了有害化学试剂作为封闭剂和还原剂。
7.此外，残留的未反应的化学试剂和危险副产物很可能吸附在纳米粒子的表面上。因此，利用现有方法生产的纳米粒子不适合用于生物医药、保健和美容应用。为了解决这些缺点和有害化学物质的使用，利用安全性能较高的植物提取物生产铂纳米材料，可以为其在生物领域的应用提供了优势。
8.热带睡莲的花中富含多糖、多酚、黄酮和生物碱等活性成分，具有美容保健等功能，用睡莲花朵提取物还原纳米铂，安全性能高，扩大了纳米铂在生物学领域的应用范围。


技术实现要素：

9.本发明所要解决的技术问题在于提供了一种利用莲花水提物绿色合成纳米铂的方法。
10.本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
11.一种利用莲花水提物绿色合成纳米铂的方法，包括以下步骤：
12.(1)取干燥的莲花粉末，按照质量比为1:1-1:100的比例与超纯水混匀，得到混合液，0-100℃超声0.5-6h，于-20℃放置24h；
13.(2)离心机8000-15000r/min离心10-30min，取上清，干燥，得到莲花提取物干粉；
14.(3)称取步骤(2)得到的莲花提取物，按1：100-10：100溶解在水中，过滤，得到莲花提取液；
15.(4)取提取液1-4ml加入氯铂酸0.001-0.1mol,剧烈搅拌30min-3h，反应混合物从黄色变为黑色，形成纳米铂；
16.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，8000-15000r/min离心10-30min，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
17.优选地，所述步骤(1)中，取干燥的莲花粉末，按照质量比为1:10的比例与超纯水混匀，得到混合液，0℃超声30min；
18.步骤(2)中，离心机8000r/min离心10min，取上清，干燥，得到莲花提取物干粉；
19.步骤(3)中，称取步骤(2)得到的莲花提取物，按1：100溶解在水中，过滤，得到莲花提取液；
20.步骤(4)中，取提取液1ml加入氯铂酸0.001mol,剧烈搅拌30min，反应混合物从黄色变为黑色，形成纳米铂；
21.步骤(5)中，将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000r/min离心20min，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
22.优选地，所述步骤(1)中取干燥的莲花粉末，按照质量比为1:20的比例与超纯水混匀，得到混合液，30℃超声2h；
23.(2)离心机10000r/min离心15min，取上清，干燥，得到莲花提取物干粉；
24.(3)称取步骤(2)得到的莲花提取物，按2：100溶解在水中，过滤，得到莲花提取液；
25.(4)取提取液2ml加入氯铂酸0.01mol,剧烈搅拌1h，反应混合物从黄色变为黑色，形成纳米铂；
26.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000r/min离心20min，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
27.优选地，所述步骤(1)中取干燥的莲花粉末，按照质量比为1:50的比例与超纯水混匀，得到混合液，60℃超声4h；
28.(2)离心机12000r/min离心20min，取上清，干燥，得到莲花提取物干粉；
29.(3)称取步骤(2)得到的莲花提取物，按5：100溶解在水中，过滤，得到莲花提取液；
30.(4)取提取液3ml加入氯铂酸0.05mol,剧烈搅拌2h，反应混合物从黄色变为黑色，形成纳米铂；
31.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000r/min离心20min，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
32.优选地，所述步骤(1)中取干燥的莲花粉末，按照质量比为1:100的比例与超纯水混匀，得到混合液，100℃超声6h；
33.(2)离心机15000r/min离心30min，取上清，干燥，得到莲花提取物干粉；
34.(3)称取步骤(2)得到的莲花提取物，按10：100溶解在水中，过滤，得到莲花提取液；
35.(4)取提取液4ml加入氯铂酸0.1mol,剧烈搅拌3h，反应混合物从黄色变为黑色，形成纳米铂；
36.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000r/min离心20min，沉淀用纯水洗涤两次后
再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
37.优选地，所述步骤(3)中莲花提取物与水之间的比例为质量与体积之比。
38.优选地，所述步骤(2)中干燥的方式为冻干干燥。
39.本发明同时公开利用莲花水提物绿色合成纳米铂的方法合成的纳米铂在制备化妆品中的应用。
40.优选地，所述化妆品为面膜、精华液、面霜、眼霜或爽肤水中的任意一种。
41.本发明相比现有技术具有以下优点：
42.本发明公开一种利用莲花水提物绿色合成纳米铂的方法，具有以下有益效果：
43.1、本发明所采用的纳米铂合成方法，没有有机试剂污染，生产步骤简洁，成本低。
44.2、本发明所采用的合成方法，合成的纳米粒子稳定，莲花提取物所含有的羰基、羧酸根和胺基能与纳米粒子表面结合，防止聚集。
45.3、本发明提供的莲花纳米铂，生物活性高，具有显著地抗氧化、抗衰老和美白作用。
46.4、本发明提供的纳米铂溶液能够清除dpph自由基，具有抗衰老能力，可以促进胶原蛋白合成，抑制酪氨酸酶活性，适合应用在化妆品中。
附图说明
47.图1为发明实例制得的纳米铂紫外吸收光谱图；
48.图2为发明实施例制得的纳米铂离子透射电镜图；
49.图3为发明实施例的纳米铂对dpph自由基的清除作用柱形图；
50.图4为发明实施例制得的纳米铂对hff-1成纤维细胞的毒性图；
51.图5为发明实施例制得的纳米铂对hff-1成纤维细胞i型胶原蛋白分泌的影响图；
52.图6为发明实施例制得的纳米铂对a375黑色素瘤细胞的毒性分析图；
53.图7为发明实施例制得的纳米铂对a375黑色素瘤细胞中酪氨酸酶的抑制作用图。
具体实施方式
54.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
55.实施例1
56.(1)取干燥的莲花粉末，按照质量比为1:10的比例与超纯水混匀，得到混合液，0℃超声30分钟；
57.(2)离心机8000转离心10分钟，取上清，冻干，得到莲花提取物干粉；
58.(3)称取步骤(2)得到的莲花提取物，按1：100(w:v)溶解在水中，过滤，得到莲花提取液。
59.(4)取提取液1ml加入氯铂酸0.001mol,剧烈搅拌30分钟，反应混合物从黄色变为黑色，表明纳米铂的形成。
60.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000转离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
61.实施例2
62.(1)取干燥的莲花粉末，按照质量比为1:20的比例与超纯水混匀，得到混合液，30℃超声2个小时；
63.(2)离心机10000转离心15分钟，取上清，冻干，得到莲花提取物干粉；
64.(3)称取步骤(2)得到的莲花提取物，按2：100(w:v)溶解在水中，过滤，得到莲花提取液。
65.(4)取提取液2ml加入氯铂酸0.01mol,剧烈搅拌1小时，反应混合物从黄色变为黑色，表明纳米铂的形成。
66.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000转离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
67.实施例3
68.(1)取干燥的莲花粉末，按照质量比为1:50的比例与超纯水混匀，得到混合液，60℃超声4个小时；
69.(2)离心机12000转离心20分钟，取上清，冻干，得到莲花提取物干粉；
70.(3)称取步骤(2)得到的莲花提取物，按5：100(w:v)溶解在水中，过滤，得到莲花提取液；
71.(4)取提取液3ml加入氯铂酸0.05mol,剧烈搅拌2小时，反应混合物从黄色变为黑色，表明纳米铂的形成。
72.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000转离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
73.实施例4
74.(1)取干燥的莲花粉末，按照质量比为1:100的比例与超纯水混匀，得到混合液，100℃超声6个小时；
75.(2)离心机15000转离心30分钟，取上清，冻干，得到莲花提取物干粉；
76.(3)称取步骤(2)得到的莲花提取物，按10：100(w:v)溶解在水中，过滤，得到莲花提取液。
77.(4)取提取液4ml加入氯铂酸0.1mol,剧烈搅拌3小时，反应混合物从黄色变为黑色，表明纳米铂的形成。
78.(5)将步骤(4)得到的纳米铂溶液，12000转离心20分钟，沉淀用纯水洗涤两次后再溶于纯水中，即得纳米铂溶液。
79.对比例
80.(1)取干燥的莲花粉末，按照质量比为1:100的比例与超纯水混匀，得到混合液，100℃超声6个小时；
81.(2)离心机15000转离心30分钟，取上清，冻干，得到莲花提取物干粉；
82.(3)将步骤(2)得到的莲花提取物干粉溶于纯水中，即得对比例溶液。
83.分析实验
84.莲花还原纳米铂紫外可见光度计分析；
85.在紫外可见光下，氯铂酸在262nm有吸收峰，莲花提取物在269nm有吸收峰，随着铂被还原，氯铂酸的吸收峰基本消失，同时还可以看到紫外到可见区整个谱带的吸收强度增
加，如图1。
86.莲花还原纳米铂透射电镜表征；
87.利用透射电子显微镜可以更直接地观察纳米粒子的形貌和大小，将不同实施例制得的纳米铂取出进行表征，由电子衍射图可以看出，实施例制得的纳米粒子尺寸在10nm以下，见图2。
88.莲花纳米铂对dpph自由基的清除作用柱形图；
89.用无水乙醇配置50μg/ml dpph工作溶液，避光保存，向实验组中加入100 μl浓度为10mg/l的莲花纳米铂组合物溶液和900μl的dpph工作液(a1)，向空白组中加入100μl浓度为10mg/l的莲花纳米铂溶液和900微升的无水乙醇溶液(a2)，向对照组中加入100μl的无水乙醇溶液和900微升dpph工作液(a0)，混匀后，室温黑暗处静置半个小时，离心，去上清在517nm处测定吸光值。实施例1-4的测定结果如表1和图3所示。
90.根据以下公式计算dpph清除率：
91.dpph清除率(％)＝[1-(a1-a2)/a0]
[0092]
表1莲花纳米铂清除dpph自由基的能力
[0093][0094]
从表1和图3中可以看出，莲花纳米铂实施例四对dpph的清除效率较高，在其浓度10mg/l为时对自由基的清除率为85.4％，清除效果优于实施例1-3和对比例。
[0095]
莲花纳米铂对hff-1成纤维细胞的毒性；
[0096]
取对数生长期、浓度为5000个/ml的人hff-1成纤维细胞，将细胞接种于 96孔细胞培养板中，每孔细胞液100μl；将96孔板置于37℃的细胞培养箱中贴壁培养化。将浓度为0.25mg/l、1mg/l和2.5mg/l的莲花纳米铂加入到96孔细胞培养板中，向对照组加入等体积的细胞培养液，于37℃、包含5％co2的细胞培养箱中孵育24h；然后向每孔中加入cck8溶液10μl，于37℃、包含5％co2 的细胞培养箱中孵育1-4h；用酶标仪测定在450nm处的吸光度。实施例1-4的测定结果如表1所示。
[0097]
表2为莲花纳米铂对人hff-1成纤维细胞存活率(100％)的影响
[0098][0099][0100]
以细胞存活率高于80％为对人hff-1成纤维细胞无毒的标准，从表2和图4 中可以看出，实施例1-4中的莲花纳米铂在浓度不高于2.5mg/ml时，对hff-1 成纤维细胞没有毒性。
[0101]
5、发明实施例制得的纳米铂对hff-1成纤维细胞i型胶原蛋白分泌的影响；
[0102]
取对数生长期、浓度为5000个/ml的人hff-1成纤维细胞，将细胞接种于 96孔细胞培养板中，每孔细胞液100μl；向实验组中分别加入10μl浓度为 0.25mg/l、1mg/l、2.5mg/l的莲花纳米铂，空白组中不加样品，分别于37℃孵育24h；收集细胞培养上清液，采用elisa法，用酶标仪在450nm处测定吸光值，计算出i型胶原蛋白的相对含量。实施例1-34的测定结果如表3和图5所示。
[0103]
表3莲花纳米铂对hff-1成纤维细胞i型胶原蛋白分泌的影响
[0104][0105][0106]
由表3和图5可知，向hff-1成纤维细胞中添加本发明提供的莲花纳米铂后，hff-1成纤维细胞中合成的i型胶原蛋白的含量随着纳米铂含量升高而上升，当铂的添加量为2.5mg/l中的i型胶原蛋白含量为140％，说明本发明提供的莲花纳米铂能够显著的促进i型胶原蛋白的表达，可以作为抗老因子添加到化妆品中。
[0107]
莲花还原纳米铂对a375黑色素瘤细胞的毒性分析；
[0108]
取对数生长期、浓度为3000个/ml的人a375黑色素瘤细胞，将细胞接种于 96孔细胞培养板中，每孔细胞液100μl；将96孔板置于37℃的细胞培养箱中贴壁培养化。将浓度为0.1mg/l、0.5mg/ml和1mg/ml的莲花纳米铂加入到96 孔细胞培养板中，向对照组加入等体积的细胞培养液，于37℃、包含5％co2的细胞培养箱中孵育24h；然后向每孔中加入cck8溶液10μl，于37℃、包含5％ co2的细胞培养箱中孵育1-4h；用酶标仪测定在450nm处的吸光度。实施例1-4 的测定结果如表4所示。
[0109]
表4莲花纳米铂对人a375黑色素瘤细胞存活率(100％)的影响
[0110][0111][0112]
7、发明实施例制得的纳米铂对a375黑色素瘤细胞中酪氨酸酶的抑制效果；
[0113]
取对数生长期、浓度为106个/ml的人a375黑色素瘤细胞，取细胞200μl 接种于有1ml培养液的35mm的细胞培养皿中，置于37℃、5％co2的细胞培养箱中贴壁培养化；向实验组中分别加入10μl浓度为0.1mg/l、0.5mg/l、1mg/l 的莲花纳米铂，空白组中不加样品，分别于37℃孵育24h，；吸弃细胞培养液，用pbs清洗2次，加入含有pmsf的1％的troton-x-100细胞裂解液100μl，迅速置于-20℃冷冻30分钟，4℃融化后收集样品，并于4℃离心15分钟，转速为12000rpm每分钟。收集上清，bca定量后，再加入4mg/ml的左旋多巴溶液100微升，37℃水浴3h,用酶标仪在490nm处测定吸光值，计算出酪氨酸酶的抑制效果。实施例1-4的测定结果如表5和图7所示。
[0114]
表5莲花纳米铂对a375黑色素瘤细胞中酪氨酸酶的抑制效果
[0115][0116][0117]
由表5和图5可知，向a375黑色素瘤细胞中添加本发明提供的浓度为 0.1mg/l的莲花纳米铂后，实施例三中，对a375黑色素瘤细胞中酪氨酸酶的抑制率为87.07％，说明本发明提供的莲花纳米铂能够显著的抑制酪氨酸酶的表达，可以作为美白因子添加到化妆品中。
[0118]
综上所述，本发明提供的莲花纳米铂，相对于现有技术制备的莲花提取物，具有良好的抑制酪氨酸酶、去除自由基的能力可作为化妆品添加剂加入到化妆品中。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。