1.本发明属于荧光染料的合成技术领域，具体涉及一种水溶性吲哚菁绿染料及其合成方法。
背景技术：
2.吲哚菁绿(indocyanine green,icg)，是由卡内基梅隆大学的alan waggoner和他的同事们在1990年代早期发现的一种花菁染料，icg染料比cy系列的花菁染料毒性更低，有更高的安全性及更好的光稳定性，是被美国食品药品管理局(fda)批准为临床使用的近红外成像试剂。icg染料主要具有以下优点：(1)icg是一种具有近红外特征吸收峰的花菁染料，它的吸收波在近红外范围为800～835nm，近红外光在组织中的穿透深度较大，且受生物组织本底的影响较小，由于icg具有近红外吸收和发射荧光特性，可作为一种优良的体内组织穿透剂。(2)icg可以在血浆和全血液中几乎完全与血浆蛋白结合，其几乎完全留在血管中而不易向外扩散，因此被作为一种常用的血管造影剂使用。(3)icg还常用于测定心输出量、肝脏功能、肝血流量和眼科血管造影术。它有一个最大吸收光谱在800nm附近，这些红外波段可以穿过视网膜层，相比荧光素血管造影icg血管造影图像允许进入更深的血液循环。(4)icg的半衰期为150到180秒，没有任何已知的代谢产物，仅通过肝脏和胆管排出，并且完全由肝脏胆汁退出循环，因为它不被肠粘膜吸收，可归类为低毒性。(5)icg还能够强烈地吸收光能将其转化为热能或产生单线态氧，可用于光热治疗(ptt)或光动力治疗(pdt)。还有文献报道在手术中用icg进行荧光成像，可以对某些原位及转移肿瘤和其前哨淋巴结进行定位。综上所述，icg在临床上已经得到了广泛的应用。
3.但由于icg分子内两边碳链末端均为磺酸，没有羧基，无法通过羧基与氨基反应来将染料标记到含胺的核酸和多肽小分子上，针对这一问题，在对其结构和应用性多年研究探索中，已经发展出将icg分子内一边的c4‑
磺酸替换为己酸的icg
‑
carboxylic acid(cas：181934
‑
0908)，并在此基础上还开发出了许多其他衍生物，常见的具有商业价值的主要有如下化合物：
[0004][0005]
icg
‑
cooh(cas：181934
‑
09
‑
8)是一种具有代表性的胺反应基团的化合物。由于它对一级胺(
‑
nh2)具有快速、高特异性的反应，能在短时间内标记含胺(
‑
nh2)的蛋白质、抗体和胺修饰的寡核苷酸，还能与各种生物分子底物(如肽、酶等)以及一些含有氨基官能团小分子结合，实现荧光标记。同时其也是合成各类icg衍生物及具有特定功能的探针的重要中间体。ji young park团队报道，以icg
‑
cooh合成的肝细胞显像剂探针(简称hia，λem＝817nm)，用于活体近红外成像，可以直接显示和跟踪肝损伤动物中移植的富含人多功能干细胞的源肝细胞，有望成为富含人多功能干细胞的源肝细胞用于药物筛选和细胞替代治疗时的有效工具。
[0006][0007]
xiao
‑
guang yang团队将单胺氧化酶a抑制剂异烟肼(inh)与肿瘤靶向近红外七甲胺菁染料结合合成了一系列的抗肿瘤化合物，经评估表明其几乎都有中等的抗肿瘤疗效，在晚期前列腺癌的治疗方面是非常有发展前景的工具，其中一个抗肿瘤化合物就是直接以icg
‑
cooh为原料合成。
[0008]
综上所述，icg
‑
cooh已被开发出了多方面的用途，但其本身有一个明显的缺点就是在水中的溶解性较差，水溶性较差不利于生物体内应用，如在水做溶剂的条件下直接对细胞进行标记染色，阻碍了其在此方面的应用及推广。
技术实现要素：
[0009]
为了解决icg
‑
cooh水溶性不好这一问题，本发明提供了一种水溶性吲哚菁绿染料，并为该染料提供一种合成方法。
[0010][0011]
本发明提供的水溶性吲哚菁绿的合成方法由下述步骤组成：
[0012]
(1)将6
‑
氨基萘
‑2‑
磺酸溶于水中，加入氢氧化钠水溶液，0℃搅拌10～15分钟，滴加硫酸水溶液，滴加完成后继续0℃搅拌并加入亚硝酸钠水溶液，加完后搅拌2～3小时，趁冷过滤，得到重氮盐，然后在0℃及搅拌条件下将重氮盐加入氯化亚锡的盐酸水溶液中，反应8～10小时，过滤得固体，即为中间体1；
[0013][0014]
(2)将中间体1与乙酸钠、3
‑
甲基
‑2‑
丁酮加入乙酸酐中，140～160℃反应8～10小时，反应完成后将反应液倒入石油醚中，使固体析出后过滤，固体干燥即得中间体2；
[0015][0016]
(3)将中间体2用1,4
‑
丁烷磺内酯溶解后，70～90℃加热反应8～10小时，反应完成后加入石油醚与乙醚的混合液中，析出固体，过滤固体即为中间体3；
[0017][0018]
(4)将中间体2与6
‑
溴己酸加入邻二氯苯中，110～130℃反应8～12小时，反应完成后先冷却，加入甲醇溶解产物，再将其加入石油醚中，使固体析出，过滤固体得中间体4；
[0019][0020]
(5)将中间体4与戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐加入乙酸中，140～160℃加热反应10～15小时，反应结束后将反应液倒入甲基叔丁基醚中，倒出上清液后，固体用二氯甲烷与甲醇的混合液溶解，溶解后滴入甲基叔丁基醚中使固体析出，过滤得中间体5；
[0021][0022]
(6)将中间体5与中间体3加入dmso中，并加入吡啶，室温反应10～12小时，反应完成后将反应液加入甲基叔丁基醚中，析出固体用二氯甲烷溶解，柱层析纯化，得到水溶性吲哚菁绿染料；
[0023][0024]
上述步骤(1)中，优选6
‑
氨基萘
‑2‑
磺酸与氢氧化钠、h2so4、亚硝酸钠、氯化亚锡的摩尔比1:2.5～4:0.5～1:2.5～4:1.5～3。
[0025]
上述步骤(2)中，优选中间体1与醋酸钠、3
‑
甲基
‑2‑
丁酮的摩尔比1:3.5～5:2.5～4。
[0026]
上述步骤(3)中，优选中间体2与1,4
‑
丁烷磺内酯的摩尔比1:18～22。
[0027]
上述步骤(4)中，优选中间体2与6
‑
溴己酸的摩尔比1:1～1.5。
[0028]
上述步骤(5)中，优选中间体4与戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐的摩尔比1:1.5～2.5。
[0029]
上述步骤(6)中，优选中间体5与中间体3、吡啶的摩尔比1:1～1.5:18～25。
[0030]
本发明的有益效果如下：
[0031]
本发明对icg
‑
cooh分子进一步进行了修饰，在芳环上增加了两个磺酸基团，最终得到了一种在水中具有良好溶解性的水溶性吲哚菁绿染料，初步的细胞标记实验表明，该化合物可高质量的用于叠氮
‑
糖的代谢标记细胞膜。
附图说明
[0032]
图1是实施例1的水溶性吲哚菁绿染料的核磁氢谱图。
具体实施方式
[0033]
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
[0034]
实施例1
[0035]
1、将150g(0.67mol)6
‑
氨基萘
‑2‑
磺酸溶解在1l水中，再加入氢氧化钠水溶液
(80.4g(2.01mol)氢氧化钠溶于160ml水中)，0℃搅拌10min，再向其中滴加硫酸水溶液(17.73ml(0.335mol)硫酸加入134ml水中配制)，0℃滴加亚硝酸钠水溶液(137.98g(2.01mol)溶于280ml水中)，滴加完成后0℃下搅拌2h，然后趁冷过滤，得到重氮盐。将254g(1.34mol)氯化亚锡溶解于500ml盐酸水溶液(250ml盐酸加250ml水中)中，0℃搅拌10min后，在搅拌状态下将重氮盐逐勺加入其中，反应8h，反应完成后直接过滤，80℃烘干即得157g中间体1。
[0036]
2、将50g(0.21mol)中间体1与68g(0.84mol)乙酸钠、54.26g(0.63mol)3
‑
甲基
‑2‑
丁酮混合后加入800ml乙酸酐，150℃加热反应8h，反应结束后，将反应液倒入石油醚中，使固体析出后过滤，固体干燥即得45.8g中间体2。
[0037]
3、将10g(0.032mol)中间体2溶解于50ml(0.64mol)1,4
‑
丁烷磺内酯中，80℃反应8h，反应结束后先冷却反应，加入乙醇溶解反应物，再将其加入体积比石油醚：乙醚＝1:1的混合溶液中，使固体析出，过滤固体即得18g中间体3。
[0038]
4、将10g(0.032mol)中间体2与6.71g(0.032mol)6
‑
溴己酸混合后，加入100ml邻二氯苯，120℃反应10h，反应完成后先冷却反应，加入甲醇溶解产物，再将其加入石油醚中，使固体析出，过滤固体即得11.6g中间体4。
[0039]
5、将10g(0.022mol)中间体4与12.7g(0.044mol)戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐混合后加入50ml乙酸中，150℃反应8h，反应结束后将反应液倒入甲基叔丁基醚中，倒出上清液后，固体用体积比二氯甲烷:甲醇＝1:1的混合液溶解，溶解后滴入甲基叔丁基醚中使固体析出，过滤得15.1g中间体5。
[0040]
6、将13.5g(0.021mol)中间体5与10.6g(0.021mol)中间体3用50ml dmso溶解后，加入10ml吡啶，室温反应12h，反应完成后将反应液加入甲基叔丁基醚中，析出固体用二氯甲烷溶解后，柱层析纯化，产物极性较大，过柱时先由体积比二氯甲烷:甲醇＝10:1配制展开剂，再加入展开剂体积1％的水，搅拌混合均匀后即可作为过柱溶剂，根据点板监测情况逐渐增加过柱溶剂中甲醇的比例，当增加至体积比二氯甲烷:甲醇＝4:1时产品基本已经分完，减压蒸馏除去溶剂即得到水溶性吲哚菁绿染料。
[0041]
所得水溶性吲哚菁绿染料的核磁氢谱如图1所示：1h nmr(600mhz,meod)δ8.33(s,2h),8.18(d,j＝8.9hz,2h),7.94(m,4h),7.55(m,3h),6.55(t,j＝12hz,2h),6.26(d,j＝13.7hz,2h),5.81
‑
5.75(m,1h),4.10(t,j＝7.4hz,4h),2.10(t,j＝7.1hz,2h),1.88(s,12h),1.80
‑
1.74(m,4h),1.61(m,4h),1.46
‑
1.39(m,4h).
[0042]
水溶性测试实验：取制得的水溶性吲哚菁绿染料500mg置于干净的25ml梨形瓶中，加入1ml纯净水，置于超声波清洗机中，室温下超声1～2min，染料全部溶解，瓶内为深绿色的澄清液体，说明本发明制备的吲哚菁绿染料具有良好的水溶性。