1.本发明涉及天然抑菌剂技术领域，更具体的说是涉及一种酸菜发酵废液抑菌剂的制备方法及应用。


背景技术：

2.目前，随着酸菜的工业化量产，大量的酸菜发酵废液产生，而酸菜生产厂商采取的方法一致是将废液全部倒掉，这不仅给周遭的环境造成了不同程度的污染，同时也造成了很大的资源浪费。因此，对酸菜发酵废液进行回收、利用是目前研究的重点，可有效解决酸菜发酵带来的环境污染及资源浪费问题。
3.另外，有害菌会对农作物的生长产生不利的影响，一是容易导致病变部位有腐烂、斑点、枯萎、溃疡等现象，二是作物在遭受有害菌后期，病变部位有菌脓溢出，导致危害扩大。为了抑制有害微生物对农作物的危害，农用的抑菌剂应运而生，但是现有技术中针对农作物病虫害以及微生物危害的现象通常采用喷洒农药的方式进行缓解，但是现有技术中的农药通常为化学合成的农药，一方面病虫及微生物会对化学合成的农药产生抗药性，因此导致农药的失效，另一方面化学合成的农药通常不易分解，会在农作物或者土壤中残留，危害人体抑或是环境。
4.因此，提供一种酸菜发酵废液抑菌剂的制备方法及应用是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种酸菜发酵废液抑菌剂的制备方法及应用，对酸菜发酵废液进行回收、利用，避免破坏环境和浪费资源，另外制备得到的抑菌剂属于天然材料，不会产生抗药性、且不会危害人体或环境。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种酸菜发酵废液抑菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
8.(1)取酸菜发酵废液先进行过滤处理，得到滤液；将所述滤液进行浓缩处理，即可得到一级浓缩液；
9.(2)向所述一级浓缩液中加入cahco3溶液搅拌均匀后静置，然后离心处理，去除下层沉淀，得到离心液；
10.(3)取所述离心液进行透析脱盐，即可得到透析液；将所述透析液进行浓缩处理得到二级浓缩液；
11.(4)向所述二级浓缩液中加入海藻酸钾、琼脂、果胶、明胶、改性淀粉和环糊精，搅拌均匀；然后加入壳聚糖混合均匀，即可得到所述酸菜发酵废液抑菌剂。
12.上述优选技术方案的有益效果是：本发明公开的一种酸菜发酵废液抑菌剂制备方法操作简单，先进行过滤可除去酸菜发酵废液中残留的固体杂质，经过浓缩可提高其有效成分浓度提高后续透析过程的工作效率；然后加入cahco3溶液可使酸菜发酵废液中溶解的
杂质沉淀，再经过离心处理，即可除去杂质，避免影响其抑菌效果；并且加入cahco3溶液可以降低酸度，因为酸菜发酵液的ph为3.4-3.6，不利于应用，所以采用cahco3降低酸度，提高酸菜发酵废液抑菌剂的使用效果；接着进行透析能够除去酸菜发酵废液中溶解的盐分，再进行浓缩即可提高其中有效成分的浓度；最后加入海藻酸钾和壳聚糖，形成缓释成分，既能使抑菌剂在应用过程中持续释放抑菌效果，又能使抑菌剂形成凝胶状以方便运输和储存，另外添加的壳聚糖与酸菜发酵废液中的多肽成分相互增效，提高抑菌效果。
13.优选的，步骤(1)中所述过滤采用的滤网孔径为30～60目。
14.上述优选技术方案的有益效果：通过本发明限定的过滤技术参数，可将酸菜发酵废液中残留的固体杂质除去，以便于后续操作。
15.优选的，步骤(1)中所述浓缩是在真空条件下，温度为36～38℃，所述浓缩液与所述滤液的体积比为1:(4～6)。
16.上述优选技术方案的有益效果是：在本发明限定的技术参数下，既能达到浓缩效果，又能避免破坏其中有效成分的活性。
17.优选的，步骤(2)中所述cahco3溶液的质量百分比浓度为10～25％，所述cahco3溶液与所述一级浓缩液的体积比为1:(15～25)；所述静置时间为8～12h。
18.上述优选技术方案的有益效果：在本发明限定的cahco3溶液浓度及用量下能够使一级浓缩液中溶解的杂质沉淀，以便于经离心去除；并且可以降低酸度，提高酸菜发酵废液抑菌剂的使用效果。
19.优选的，步骤(2)中所述离心的转速为4200～4500r/min，所述离心的时间为10～14min。
20.上述优选技术方案的有益效果是：在本发明限定的离心技术参数下能够使沉淀的杂质在下层沉积，以便于固液分离。
21.优选的，步骤(3)中所述透析是将所述离心液装入透析袋内，以蒸馏水为透析外液，在5～10℃下透析3～5h，然后将所述透析外液换成蒸馏水，继续在5～10℃下透析5～8h，去除透析袋内液体即为所述透析液。
22.上述优选技术方案的有益效果是：在本发明限定的透析操作下，离心液中溶解的盐分由于浓度差通过透析袋溶至透析外液，从而将离心液中溶解的盐分脱除得到透析液。
23.优选的，步骤(3)中所述透析袋的截留相对分子量为800。
24.上述优选技术方案的有益效果是：本发明设定的技术参数既确保盐分能够通过透析袋，同时保证其中有效成分不会通过透析袋而造成有效成分流失。
25.优选的，步骤(3)中所述浓缩是在真空条件下，温度为36～38℃，所述二级浓缩液与所述透析液的体积比为1:(5～10)。
26.上述优选技术方案的有益效果，在本发明公开的浓缩条件下能够使透析液中多余的水分去除，提高二级浓缩液中有效成分含量，从而方便运输和使用。
27.优选的，步骤(4)中所述海藻酸钾、琼脂、果胶、明胶、改性淀粉、环糊精、二级浓缩液和壳聚糖的质量体积比为(2～4)mg:(1～2)mg：(0.2～1)mg：(1～1.5)mg：(0.5～0.8)mg：(0.5～1.2)mg：(20～30)ml:(5～10)mg。
28.上述优选技术方案的有益效果是：在本发明限定的原料用量下，使海藻酸钾、壳聚糖与二级浓缩液相互配合，既能提高抑菌剂的粘度使其形成凝胶状，以方便运输和使用；而
且壳聚糖与二级浓缩液中的有效成分相互配合，能够提高抑菌效果。
29.本发明还提供了一种酸菜发酵废液抑菌剂在农作物叶面肥中的应用，所述酸菜发酵废液抑菌剂采用上述制备方法制得。
30.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种酸菜发酵废液抑菌剂的制备方法及应用，具有如下有益效果：
31.(1)本发明以酸菜发酵液为原料，对酸菜发酵废液进行回收、利用，避免酸菜发酵液排放后破坏环境和浪费资源；而且，采用酸菜发酵液作为主要原料，能够明显降低原料成本；
32.(2)另外，以酸菜发酵液为原料、辅以壳聚糖和海藻酸钠，所有原料均属于天然材料，应用过程中不会危害人体或环境；
33.(3)而且，本发明公开的制备方法操作简单，容易进行工业化生产，具有实际应用价值。
具体实施方式
34.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.本发明实施例公开了一种酸菜发酵废液抑菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
36.(1)取酸菜发酵废液先进行过滤处理，得到滤液；将滤液进行浓缩处理，即可得到一级浓缩液；
37.其中，过滤采用的滤网孔径为30～60目；浓缩是在真空条件下，温度为36～38℃，浓缩液与滤液的体积比为1:(4～6)；
38.(2)取一级浓缩液加入cahco3溶液搅拌均匀后静置，然后离心处理，去除下层沉淀，得到离心液；
39.其中，cahco3溶液的质量百分比浓度为10～25％，cahco3溶液与一级浓缩液的体积比为1:(15～25)；静置时间为8～12h；离心的转速为4200～4500r/min，离心的时间为10～14min。
40.(3)取离心液进行透析脱盐，即可得到透析液；将透析液进行浓缩处理得到二级浓缩液；
41.其中，透析是将离心液装入透析袋内，以蒸馏水为透析外液，在5～10℃下透析3～5h，然后将透析外液换成蒸馏水，继续在5～10℃下透析5～8h，去除透析袋内液体即为透析液；透析袋的截留相对分子量为800；浓缩是在真空条件下，温度为36～38℃，二级浓缩液与透析液的体积比为1:(5～10)；
42.(4)向所述二级浓缩液中加入海藻酸钾、琼脂、果胶、明胶、改性淀粉和环糊精，搅拌均匀；然后加入壳聚糖混合均匀，即可得到所述酸菜发酵废液抑菌剂；所述海藻酸钾、琼脂、果胶、明胶、改性淀粉、环糊精、二级浓缩液和壳聚糖的质量体积比为(2～4)mg:(1～2)mg：(0.2～1)mg：(1～1.5)mg：(0.5～0.8)mg：(0.5～1.2)mg：(20～30)ml:(5～10)mg。
43.实施例1
44.本发明实施例1公开了一种酸菜发酵废液抑菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
45.(1)取酸菜发酵废液先进行过滤处理，得到滤液；将滤液进行浓缩处理，即可得到一级浓缩液；
46.其中，过滤采用的滤网孔径为60目；浓缩是在真空条件下，温度为38℃，浓缩液与滤液的体积比为1:6；
47.(2)取一级浓缩液加入cahco3溶液搅拌均匀后静置，然后离心处理，去除下层沉淀，得到离心液；
48.其中，cahco3溶液的质量百分比浓度为25％，cahco3溶液与一级浓缩液的体积比为1:25；静置时间为12h；离心的转速为4500r/min，离心的时间为14min；
49.(3)取离心液进行透析脱盐，即可得到透析液；将透析液进行浓缩处理得到二级浓缩液；
50.其中，透析是将离心液装入透析袋内，以蒸馏水为透析外液，在10℃下透析5h，然后将透析外液换成蒸馏水，继续在10℃下透析8h，去除透析袋内液体即为透析液；透析袋的截留相对分子量为800；浓缩是在真空条件下，温度为38℃，浓缩液与滤液的体积比为1:10
51.(4)向所述二级浓缩液中加入海藻酸钾、琼脂、果胶、明胶、改性淀粉和环糊精，搅拌均匀；然后加入壳聚糖混合均匀，即可得到所述酸菜发酵废液抑菌剂；所述海藻酸钾、琼脂、果胶、明胶、改性淀粉和环糊精、二级浓缩液和壳聚糖的质量体积比为2mg:2mg：0.2mg：1.5mg：0.5mg：1.2mg：20ml:10mg。
52.实施例2
53.本发明实施例2公开了一种酸菜发酵废液抑菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
54.(1)取酸菜发酵废液先进行过滤处理，得到滤液；将滤液进行浓缩处理，即可得到一级浓缩液；
55.其中，过滤采用的滤网孔径为30目；浓缩是在真空条件下，温度为36～38℃，浓缩液与滤液的体积比为1:4；
56.(2)取一级浓缩液加入cahco3溶液搅拌均匀后静置，然后离心处理，去除下层沉淀，得到离心液；
57.其中，cahco3溶液的质量百分比浓度为10％，cahco3溶液与一级浓缩液的体积比为1:15；静置时间为8h；离心的转速为4200r/min，离心的时间为10min；
58.(3)取离心液进行透析脱盐，即可得到透析液；将透析液进行浓缩处理得到二级浓缩液；
59.其中，透析是将离心液装入透析袋内，以蒸馏水为透析外液，在5℃下透析3h，然后将透析外液换成蒸馏水，继续在5℃下透析5h，去除透析袋内液体即为透析液；透析袋的截留相对分子量为800；浓缩是在真空条件下，温度为36℃，浓缩液与滤液的体积比为1:5；
60.(4)向所述二级浓缩液中加入海藻酸钾、琼脂、果胶、明胶、改性淀粉和环糊精，搅拌均匀；然后加入壳聚糖混合均匀，即可得到所述酸菜发酵废液抑菌剂；所述海藻酸钾、琼脂、果胶、明胶、改性淀粉和环糊精、二级浓缩液和壳聚糖的质量体积比为4mg:1mg：1mg：1mg：0.8mg：0.5mg：30ml:10mg。
61.实施例3
62.本发明实施例3公开了一种酸菜发酵废液抑菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
63.(1)取酸菜发酵废液先进行过滤处理，得到滤液；将滤液进行浓缩处理，即可得到一级浓缩液；
64.其中，过滤采用的滤网孔径为40目；浓缩是在真空条件下，温度为37℃，浓缩液与滤液的体积比为1:5；
65.(2)取一级浓缩液加入cahco3溶液搅拌均匀后静置，然后离心处理，去除下层沉淀，得到离心液；
66.其中，cahco3溶液的质量百分比浓度为15％，cahco3溶液与一级浓缩液的体积比为1:20；静置时间为9h；离心的转速为4200～4500r/min，离心的时间为13min；
67.(3)取离心液进行透析脱盐，即可得到透析液；将透析液进行浓缩处理得到二级浓缩液；
68.其中，透析是将离心液装入透析袋内，以蒸馏水为透析外液，在6℃下透析5h，然后将透析外液换成蒸馏水，继续在10℃下透析7h，去除透析袋内液体即为透析液；透析袋的截留相对分子量为800；浓缩是在真空条件下，温度为37℃，浓缩液与滤液的体积比为1:8；
69.(4)向所述二级浓缩液中加入海藻酸钾、琼脂、果胶、明胶、改性淀粉和环糊精，搅拌均匀；然后加入壳聚糖混合均匀，即可得到所述酸菜发酵废液抑菌剂；所述海藻酸钾、琼脂、果胶、明胶、改性淀粉和环糊精、二级浓缩液和壳聚糖的质量体积比为3mg:2mg：0.8mg：1.4mg：0.6mg：1mg：25ml:7mg。
70.实施例4
71.本发明实施例4公开了一种酸菜发酵废液抑菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
72.(1)取酸菜发酵废液先进行过滤处理，得到滤液；将滤液进行浓缩处理，即可得到一级浓缩液；
73.其中，过滤采用的滤网孔径为50目；浓缩是在真空条件下，温度为38℃，浓缩液与滤液的体积比为1:5；
74.(2)取一级浓缩液加入cahco3溶液搅拌均匀后静置，然后离心处理，去除下层沉淀，得到离心液；
75.其中，cahco3溶液的质量百分比浓度为18％，cahco3溶液与一级浓缩液的体积比为1:22；静置时间为10h；离心的转速为4300r/min，离心的时间为13min；
76.(3)取离心液进行透析脱盐，即可得到透析液；将透析液进行浓缩处理得到二级浓缩液；
77.其中，透析是将离心液装入透析袋内，以蒸馏水为透析外液，在9℃下透析4h，然后将透析外液换成蒸馏水，继续在7℃下透析7h，去除透析袋内液体即为透析液；透析袋的截留相对分子量为800；浓缩是在真空条件下，温度为36℃，浓缩液与滤液的体积比为1:8；
78.(4)向所述二级浓缩液中加入海藻酸钾、琼脂、果胶、明胶、改性淀粉和环糊精，搅拌均匀；然后加入壳聚糖混合均匀，即可得到所述酸菜发酵废液抑菌剂；所述海藻酸钾、琼脂、果胶、明胶、改性淀粉和环糊精、二级浓缩液和壳聚糖的质量体积比为3.5mg:1.2mg：0.6mg：1.1mg：0.6mg：1mg：28ml:6mg。
79.实施例5
80.本发明实施例5公开了一种酸菜发酵废液抑菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
81.(1)取酸菜发酵废液先进行过滤处理，得到滤液；将滤液进行浓缩处理，即可得到
一级浓缩液；
82.其中，过滤采用的滤网孔径为40目；浓缩是在真空条件下，温度为36℃，浓缩液与滤液的体积比为1:4.5；
83.(2)取一级浓缩液加入cahco3溶液搅拌均匀后静置，然后离心处理，去除下层沉淀，得到离心液；
84.其中，cahco3溶液的质量百分比浓度为20％，cahco3溶液与一级浓缩液的体积比为1:18；静置时间为11h；离心的转速为4400r/min，离心的时间为13min；
85.(3)取离心液进行透析脱盐，即可得到透析液；将透析液进行浓缩处理得到二级浓缩液；
86.其中，透析是将离心液装入透析袋内，以蒸馏水为透析外液，在7℃下透析4h，然后将透析外液换成蒸馏水，继续在8℃下透析6h，去除透析袋内液体即为透析液；透析袋的截留相对分子量为800；浓缩是在真空条件下，温度为36℃，浓缩液与滤液的体积比为1:9；
87.(4)向所述二级浓缩液中加入海藻酸钾、琼脂、果胶、明胶、改性淀粉和环糊精，搅拌均匀；然后加入壳聚糖混合均匀，即可得到所述酸菜发酵废液抑菌剂；所述海藻酸钾、琼脂、果胶、明胶、改性淀粉和环糊精、二级浓缩液和壳聚糖的质量体积比为4mg:2mg：1mg：1.5mg：0.8mg：1.2mg：30ml:10mg。
88.效果验证
89.1、进行抑菌试验
90.取小麦蜜穗病菌和丁香假单胞杆菌，进行活化，得到试验菌种。然后取六组mh肉汤培养基，每组培养基为6个，第1～5组为试验组1～试验组5，每个试验组分为两个小组，每个小组3个培养基，第一小组接种小麦蜜穗病菌组，第二小组接种丁香假单胞杆菌；第六组为空白组，空白组分为两个小组，每个小组5个培养基，第一小组接种小麦蜜穗病菌组，第二小组接种丁香假单胞杆菌。每个培养基灭菌后接种相同数量的菌种，每点菌数约为104cfu。
91.试验组1～试验组5分别对应滴加实施例1～5得到的酸菜发酵废液抑菌剂，空白组不做处理。
92.将培养基放置在35-37℃的恒温环境进行培养24h，然后取每个培养基中的培养液10μl，然后接种至琼脂固体培养基，在35-37℃培养24h，观察统计培养基上菌落，结果见表1。
93.抑菌率＝(空白组的平均菌落数-每组的平均菌落数)/空白组的平均菌落数
×
100％
94.表1
[0095][0096]
小麦蜜穗病菌为革兰氏阳性菌，小麦蜜穗病菌由线虫传播，对小麦的生长有危害作用，丁香假单胞杆菌为革兰氏阴性菌，它能危害多种植物，包括粮食作物、蔬菜、果树、花卉和药材。由上述结果可以得知，本发明制备得到的酸菜发酵废液抑菌剂对小麦蜜穗病菌和丁香假单胞杆菌有明显的抑制作用。
[0097]
2、肥力效果提升验证
[0098]
试验方法：分别取实施例1～5制备得到的酸菜发酵废液抑菌剂作为试验组1～5、清水作为空白组；取六块水稻田，每块水稻田均为1亩；在水稻种植前分别采用试验组1～5稀释至20倍体积后制剂和空白组的制剂对叶面进行喷洒，平均每亩地均喷洒5kg；在水稻种植期间，三组均平均30天喷洒一次制剂，每次每亩地均喷洒1-2kg，等水稻成熟，统计三组水稻的产量。
[0099]
其中玉米、大豆的试验同水稻相同，统计三种作物的产量，结果见表2。
[0100]
表2
[0101]
实施例水稻产量(kg/亩)玉米产量(kg/亩)大豆产量(kg/亩)实施例1680891173实施例2683887169实施例3679890172实施例4685888174实施例5684892175空白对照652800160
[0102]
本发明提供的酸菜发酵废液抑菌剂对作物起到抑菌抗病害的作用，农作物得以茁壮成长，提高产量，抑菌剂喷洒后不仅对作物取到保护作用，其丰富的有益菌和营养元素能改善土壤，提高土壤肥力，有益作物的生长发育。
[0103]
3、对黄瓜霜霉病的抑菌效果验证
[0104]
试验方法：分别取实施例1～5制备得到的酸菜发酵废液抑菌剂作为试验组1～5、清水作为空白组；采用黄瓜苗盆栽法，每组10盆。当黄瓜长至二叶一心期时用喷雾机进行叶面喷雾处理，整株喷施相同体积的3个处理药剂的稀释液和清水，直至滴水为宜。在喷施处理后24小时接种病菌，采用喷雾接种法。空白组发病后，调查病级数，计算防效，得到结果如下表3所示。
[0105]
表3
[0106][0107][0108]
4、对草莓蛇眼病菌的抑制效果验证
[0109]
试验方法：取一批草莓幼株，接着通过草莓蛇眼病菌进行侵染使得草莓幼株患有草莓蛇眼病，然后将上述草莓幼株分为6组，每组50株，其中5组分别用实施例1～5制备得到的酸菜发酵废液抑菌剂稀释后进行喷洒，每12h喷洒一次，第6组至喷洒水，一周后通过观察统计草莓的治愈率，具体结果见表4所示，其中治愈率的计算公式为
[0110][0111]
表4
[0112]
实施例治愈率/％实施例191.0实施例289.4实施例387.6实施例492.5实施例593.1空白组0
[0113]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说
明即可。
[0114]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。