1.本发明涉及食品的生物利用及功能开发领域。更具体地，涉及一种具有抗氧化活性的血橙发酵物的制备方法及其应用。
背景技术：
2.活性氧(ros)是含氧的化学反应性化学物质，在生物学背景下，ros为氧的正常代谢的天然副产物，并且在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用。然而，在环境压力(例如，紫外线或热暴露)期间，ros水平会急剧增加，过量的ros会攻击细胞组分，可能会对细胞结构造成严重损害，这被称为氧化应激。正常情况下，细胞内产生的ros主要依靠机体抗氧化保护体系维持平衡，机体抗氧化保护体系分为酶系和非酶系。酶系主要包括超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)等，非酶系主要是还原型谷胱甘肽(gsh)、维生素c/e等。虽然，在机体内有一套有效的内源性抗氧化保护体系，但其抗氧化调节能力有限，特别是氧化应激比较严重时，必须依靠补充外源性的抗氧化剂，增强机体自身抗氧化能力。因此，抗氧化剂的开发已成为食品科学和生命科学等领域的研究热点。
3.血橙是芸香科柑橘属下甜橙的一个栽培品种植物，是柑橘中唯一含花青素类的品种。血橙富含花色苷、抗坏血酸及类黄酮等多酚，具有抗氧化、增强免疫力、抗衰老、防止心血管疾病等多种有益于身体健康的生理作用。但是，常规的血橙提取物主要以酸性溶剂为主，酸性溶剂会使位于表皮细胞附近的花色苷的细胞膜变性，在萃取浓缩过程中导致花色苷降解，进而导致血橙抗氧化活性下降。乳酸菌发酵是提高果蔬营养价值的一种处理方式，通过发酵，不仅可以保留原来食物中的一些活性成分，而且能够使食品中原有的部分营养成分发生改变。选择优良乳酸菌菌种是影响果蔬发酵的关键，目前尚没有适于血橙发酵的专用乳酸菌菌种。
技术实现要素：
4.本发明的第一个目的在于提供一种具有抗氧化活性的血橙发酵物的制备方法。
5.本发明的第二个目的在于提供一种具有抗氧化活性的血橙发酵物。
6.本发明的第三个目的在于提供一种具有抗氧化活性的血橙发酵物的应用。
7.为达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：
8.第一方面，本发明提供了一种具有抗氧化活性的血橙发酵物的制备方法，包括如下步骤：
9.分别将干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、戊糖片球菌进行活化培养，使其菌种数量分别达到107cfu/ml；
10.将活化培养后的干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和戊糖片球菌按照体积比为0.5-1.5:1:0.5-1.5进行混合，获得混合乳酸菌；
11.将混合乳酸菌按体积分数2％-4％的接种量接种于血橙原液中，进行发酵培养，即得。
12.其中，传统提取方法易造成血橙的活性成分流失，进而抗氧化活性下降，本发明发现，血橙通过乳酸菌发酵，不仅可以保留其原有活性成分，而且还可以有效提高血橙中超氧化物歧化酶(sod)的活性及其对dpph自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基、abts自由基等的清除能力。此外，本发明还意外发现，特定种类的乳酸菌在本发明的配比范围内进行混合发酵血橙原液，可以起到协同增效的作用，更加有效地提高血橙原液的抗氧化能力。
13.优选的，所述混合乳酸菌中，干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和戊糖片球菌的体积比为1-1.5:1:0.5-1。其中，该配比的混合乳酸菌可以更优的提高血橙原液的抗氧化能力。
14.更优选的，所述混合乳酸菌中，干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和戊糖片球菌的体积比为1:1:1。其中，该配比的混合乳酸菌可以最优的提高血橙原液的抗氧化能力。
15.进一步，在上述方法中，所述活化培养的条件为：活化培养的温度为30-37℃，活化培养的时间为24-48h。
16.所述发酵培养的条件为：发酵培养的温度为30-37℃，发酵培养的时间为4-8天。
17.所述血橙原液的制备方法，包括以下步骤：
18.将血橙去皮后打浆，获得血橙浆液，调节血橙浆液的ph值为4.0-6.0，然后加入血橙浆液质量的0.16-0.26％的混合酶，在50℃下进行酶解1.5-2h，即得；其中，所述混合酶由质量比为1:0.5-2的果胶酶和纤维素酶组成。
19.进一步，所述果胶酶的酶活力为30-50u/mg，所述纤维素酶的酶活力为10-50u/mg。
20.根据本发明的具体实施方式，所述酶解处理后还包括在115℃下灭菌20-30min。
21.第二方面，本发明提供了一种由上述制备方法制得的具有抗氧化活性的血橙发酵物。
22.其中，所述血橙发酵物可以是固态，也可以是液态，本发明对此不作限制。
23.第三方面，本发明提供了一种具有抗氧化活性的血橙发酵物在制备延缓衰老的食品或化妆品中的应用。
24.本发明的有益效果如下：
25.本发明提供了一种具有抗氧化活性的血橙发酵物的制备方法，该方法原料廉价易得，工艺简单、操作方便，适合大规模生产应用。
26.利用本发明提供的血橙发酵物的制备方法不仅可以充分发挥血橙的潜在功能活性，而且避免其活性物质的流失。通过该方法获得的血橙发酵物相对于血橙原料的抗氧化活性和抗氧化酶活力均有明显提高，能够广泛应用于食品或化妆品等相关领域中，具有适用性强、经济效益明显等优势。
具体实施方式
27.为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
28.如无特殊说明，本发明中制备方法如无特殊说明则均为常规方法，所用的原料如无特别说明均可从公开的商业途径获得或根据现有技术制得，所述百分比如无特殊说明均为质量百分比。其中，以下实施例所用干酪乳杆菌购自、保加利亚乳杆菌和戊糖片球菌均购自广东省微生物菌种保藏中心；果胶酶购自和纤维素酶均购自南宁庞博生物工程有限公
司。
29.实施例1
30.制备血橙原液：血橙果实去皮后进行匀浆，获得血橙浆液，调节血橙浆液的ph值到4.0-6.0，然后加入混合酶(混合酶的添加量为血橙浆液质量的0.2％)其中，混合酶由质量比1:1的果胶酶(50u/mg)和纤维素酶(10u/mg)组成，在50℃下进行酶解1.5h，之后在115℃条件下灭菌20min，即得血橙原液。
31.发酵处理：分别将干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和戊糖片球菌接种到mrs培养基中，在温度30-37℃下分别培养24-48h，分别使其菌种数量达到107cfu/ml，即得到将活化(扩培)后的各个菌种，将活化后的干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、戊糖片球菌按体积为1:1:1的比例混合，获得混合乳酸菌，混合乳酸菌以体积分数2％的接种量加入到上述血橙原液中，在30℃下静置，进行发酵培养4d，获得血橙发酵液，将其进行真空冷冻干燥，获得固态血橙发酵物。
32.实施例2
33.制备血橙原液：血橙果实去皮后进行匀浆，获得血橙浆液，调节血橙浆液的ph值到4.0-6.0，然后加入混合酶(混合酶的添加量为血橙浆液质量的0.2％)其中，混合酶由质量比1:1的果胶酶(50u/mg)和纤维素酶(10u/mg)组成，在50℃下进行酶解1.5h，之后在115℃条件下灭菌20min，即得血橙原液。
34.发酵处理：分别将干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和戊糖片球菌接种到mrs培养基中，在温度30-37℃下分别培养24-48h，分别使其菌种数量达到107cfu/ml，即得到将活化(扩培)后的各个菌种，将活化后的干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、戊糖片球菌按体积为0.5:1:1.5的比例混合，获得混合乳酸菌，混合乳酸菌以2％接种量加入到上述血橙原液中，在30℃下静置，进行发酵培养4d，获得血橙发酵液，将其进行真空冷冻干燥，获得固态血橙发酵物。
35.实施例3
36.制备血橙原液：血橙果实去皮后进行匀浆，获得血橙浆液，调节血橙浆液的ph值到4.0-6.0，然后加入混合酶(混合酶的添加量为血橙浆液质量的0.2％)其中，混合酶由质量比1:1的果胶酶(50u/mg)和纤维素酶(10u/mg)组成，在50℃下进行酶解1.5h，之后在115℃条件下灭菌20min，即得血橙原液。
37.发酵处理：分别将干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和戊糖片球菌接种到mrs培养基中，在温度30-37℃下分别培养24-48h，分别使其菌种数量达到107cfu/ml，即得到将活化(扩培)后的各个菌种，将活化后的干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、戊糖片球菌按体积为1.5:1:0.5的比例混合，获得混合乳酸菌，混合乳酸菌以2％接种量加入到上述血橙原液中，在30℃下静置，进行发酵培养4d，获得血橙发酵液，将其进行真空冷冻干燥，获得固态血橙发酵物。
38.对比例1
39.制备血橙果粉：血橙果实去皮后进行匀浆，获得血橙浆液，调节血橙浆液的ph值到4.0-6.0，然后加入混合酶(混合酶的添加量为血橙浆液质量的0.2％)其中，混合酶由质量比1:1的果胶酶(50u/mg)和纤维素酶(10u/mg)组成，在50℃下进行酶解1.5h，之后在115℃条件下灭菌20min，得血橙原液，将血橙原液进行真空冷冻干燥，即得血橙果粉。
40.对比例2
41.与实施例1区别仅在于：将混合乳酸菌替换为等菌种量的干酪乳杆菌。
42.对比例3
43.与实施例1区别仅在于：将混合乳酸菌替换为等菌种量的保加利亚乳杆菌。
44.对比例4
45.与实施例1区别仅在于：将混合乳酸菌替换为等菌种量的戊糖片球菌。
46.对比例5
47.与实施例1区别仅在于：所述混合乳酸菌由干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和戊糖片球菌按0.3:1:1.7的体积比配置而成。
48.对比例6
49.与实施例1区别仅在于：所述混合乳酸菌由干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和戊糖片球菌按1.7:1:0.3的体积比配置而成。
50.试验例
51.对实施例1-3和对比例1-6制得的血橙发酵物、血橙果粉进行抗氧化指标检测，具体检测方法如下：
52.1、dpph自由基清除能力测定
53.分别将实施例1-3和对比例1-6制得的血橙发酵物样品和血橙果粉样品用去离子水稀释至1mg/ml，获得稀释液，取1ml稀释液，分别向其中加入1ml0.1mmol/l dpph-无水乙醇溶液，混匀，室温避光条件下反应30min，得样品液，测量其在波长517nm处的吸光值(记为a1)，空白组用无水乙醇代替样品液测定其吸光值(记为a0)，对照组用无水乙醇代替dpph-无水乙醇溶液，测定反应后获得溶液的吸光值(记为a2)。dpph自由基清除率根据以下公式进行计算：
54.dpph自由基清除率(％)＝[1-(a1–
a2)/a0]
×
100
[0055]
2、超氧阴离子自由基清除能力测定
[0056]
分别将实施例1-3和对比例1-6制得的血橙发酵物样品和血橙果粉样品用去离子水稀释至1mg/ml，获得稀释液，取1ml稀释液，分别向其中加入5ml50mmol/l的tris-hcl缓冲液(ph 8.2)，混均，在25℃的恒温水浴锅中水浴20min后，加入同样预温至25℃的0.4ml 25mmol/l的邻苯三酚溶液，混均后反应5min，最后加入0.5ml浓盐酸终止反应，得样品液，测试其在波长325nm处测吸光值(记为a1)。空白组用蒸馏水代替样品液测定其吸光值(记为a0)，对照组用蒸馏水代替邻苯三酚溶液测定反应后获得溶液的吸光值(记为a2)。超氧阴离子清除率根据以下公式进行计算：
[0057]
超氧阴离子清除率(％)＝[1-(a1–
a2)/a0]
×
100
[0058]
3、羟基自由基清除能力测定
[0059]
分别将实施例1-3和对比例1-6制得的血橙发酵物样品和血橙果粉样品用去离子水稀释至1mg/ml，获得稀释液，取1ml稀释液，分别向其中加入1ml6mmol/l feso4溶液和1ml 2.4mmol/l h2o2溶液，混匀，反应10min后，再加入1ml 6mmol/l水杨酸溶液，在37℃条件下反应30min，得样品液，测定其在波长510nm下的吸光值(记为a1)。空白组用蒸馏水代替样品液测定其吸光值(记为a0)，对照组用蒸馏水代替h2o2溶液测定测定反应后获得溶液的吸光值(记为a2)。羟基自由基清除率根据以下公式进行计算：
[0060]
羟基自由基清除率(％)＝[1
–
(a1–
a2)/a0]
×
100
[0061]
4、abts自由基清除能力测定
[0062]
配制abts自由基(abts+)溶液：取等体积的2.45mmol/l的过硫酸钾与7mmol/l的abts+混合，在25℃避光条件下反应16h，用甲醇将abts+溶液稀释至其在波长734nm处吸光值为0.70
±
0.02，待用。
[0063]
分别将实施例1-3和对比例1-6制得的血橙发酵物样品和血橙果粉样品用去离子水稀释至1mg/ml，然后分别取50ul于试管中，加入2ml abts+溶液，混匀后避光条件下反应1 0min，得样品液。在波长734nm下测定吸光值(记为a1)，空白组用甲醇代替样品液测定其吸光值(记为a0)，对照组用甲醇代替abts+溶液测定反应后获得溶液的吸光值(记为a2)。abts自由基清除率根据以下公式进行计算：
[0064]
abts自由基清除率(％)＝[1
–
(a1–
a2)/a0]
×
100
[0065]
5、超氧化物歧化酶(sod)活力测定
[0066]
采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定sod活力：分别将实施例1-3和对比例1-6制得的血橙发酵物样品和血橙果粉样品用去离子水稀释至1mg/ml，得样液，按试剂盒要求进行sod含量测定。
[0067]
将以上测试结果总结于表1。
[0068]
表1：
[0069][0070]
结论：通过表1数据可知，1)实施例1-3和对比例2-6的血橙发酵物抗氧化活性均高于对比例1的未发酵的血橙果粉，表明血橙原液经过发酵可以提高其原有的抗氧化活性；2)实施例1-3、对比例5-6用混合乳酸菌发酵获取的血橙发酵物抗氧化活性高于对比例2-4的用单一乳酸菌发酵的血橙发酵物，表明酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、戊糖片球菌可以相互配合，协同提高血橙的抗氧化活性；3)实施例1-3用特定配比的混合乳酸菌发酵获取的血橙发酵物抗氧化活性高于对比例5-6的血橙发酵物，表明酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、戊糖片球菌在特定配比范围内可以更优的协同提高血橙的抗氧化活性。
[0071]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可
以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。