一种黄曲霉毒素b1降解剂的制备
技术领域
1.本发明属于黄曲霉毒素b1(afb1)降解技术领域，具体涉及一种高效降解afb1的方法。


背景技术：

2.陈康等人的研究表明吐温等多羟基化合物可以通过增加固定化漆酶分子间的氢键改变固定化漆酶的构象，防止固定化漆酶二级结构因温度升高而发生的不利变化。因此，低浓度的吐温可以作为提高固定化漆酶热稳定性的添加剂。如petr baldrian等人的研究结果表明，在平菇培养基中添加铜和镉会对平菇产生的固定化漆酶活力均有不同程度的提高。因此，无机盐中含有的铜和镉有利于增强固定化漆酶的活力。
3.酿酒酵母富含蛋白质、核酸、维生素、多糖等营养物质，酿酒酵母的非活性形式和细胞组分由于酵母细胞壁的特殊空间结构，可以通过氢键、离子键和疏水作用力等对霉菌毒素(如黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮)有效进行吸附，可以作为霉菌毒素吸附剂使用。解淀粉芽孢杆菌作为一种益生菌，在其生长过程中可产生多种抑菌物质，如抑菌蛋白类物质和脂肽类抗生素，为其在动植物生产中广泛应用提供了可能。因此本专利中，与酿酒酵母发酵后的成分混合后，若发酵成分含有少部分酿酒酵母，也会对afb1降解剂产生有益效果。芦荟中的粘液是以arboran a baloe mannanaloetin等多糖类为核心成分，具有抗氧化，抗衰老的作用，同时芦荟凝胶中的主要成分芦荟大黄素分子中含有多个羟基，可作用于afb1结构中的内酯环，从而达到降解afb1的效果。
4.文献证明，芦荟多糖具有良好的抗氧化活性。体内试验中，王莉等用50mg/kg的芦荟多糖对大鼠连续灌胃30天，发现芦荟多糖具有良好的抗氧化能力。这种抗氧化能力可以有效阻止afb1结构中内酯环的氧化性，从而达到降解afb1的效果。
5.孙琦的研究表明肉桂醛可以起到对afb1抗氧化作用，作用部位是内酯环，从而达到降解afb1的效果。
6.利用吸附剂将酶或含酶菌体吸附在吸附剂表面上而使酶固定的方法是吸附法固定化酶技术，良好的吸附剂有活性炭、硅藻土等。采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。
7.在本专利中，使用活性炭和壳聚糖等对漆酶进行固定化以增加漆酶的稳定性，使其保持较长活力。固定化漆酶包括如下种类：活性炭固定化漆酶或壳聚糖固定化漆酶，固定化漆酶中的漆酶是多铜氧化酶，可用于afb1的降解。张初署等人的研究表明，漆酶在较酸性的条件下有利于酶活力的提升，本专利中柠檬提供的酸性ph范围可有助于固定化漆酶更好发挥其降解afb1的作用。魏良鑫的研究表明固定化漆酶不仅可以单独降解afb1，而且固定化漆酶中的铜离子还可以催化芦荟多糖和肉桂醛对afb1的降解。
8.arijit das的研究结果表明，添加一定表面活性剂如吐温可以提高产固定化漆酶的平菇菌株对afb1的酶促降解作用。同样的，王剑桥等人的研究结果表明，吐温的加入可促进酶促反应下afb1的降解。
9.以下是主要相关已经公开的专利，但明显与本技术文件存在不同，如表1：表1部分公开专利与申请文件的区别


技术实现要素：

10.针对现有技术中存在的问题，本发明目的是制备一种安全、高效的黄曲霉毒素b1(afb1)降解剂。
11.为了达到上述目的，本发明的技术方案为：
12.制备一种afb1降解剂，是将鲜芦荟和鲜柠檬一起榨汁、过滤，汁渣粉碎后加入无机盐溶液，汁液加入葡萄糖，然后分别将解淀粉芽孢杆菌和酿酒酵母接种到灭菌冷却后的汁渣和汁液中，最后将发酵后的汁渣过滤弃渣，将解淀粉芽孢杆菌发酵汁渣后的滤液加入经酿酒酵母发酵后的汁液中，再加入肉桂醛、固定化漆酶、吐温后制得afb1降解剂，其中肉桂醛和吐温分别作为油相和表面活性剂，去离子水作为水相，三者在试管中混合，超声处理30～60min，然后在25～35℃水浴中静置24～36h。
13.进一步的，所述固定化漆酶包括如下种类：活性炭固定化漆酶或壳聚糖固定化漆酶，其中漆酶的固定化方法为：取0.2～0.8g活性炭或壳聚糖，加入ph值为3.0～6.0的漆酶磷酸盐缓冲溶液中(0.1～0.5mg/ml、2～5ml)，20～35℃下振荡6～12h，过滤，用磷酸盐缓冲
溶液(0.02～0.08mol/l，ph 5.0～7.0)洗涤至上清液中检测不到漆酶，即得固定化漆酶。
14.进一步的，所述的鲜芦荟包括如下种类：库拉索芦荟，木立芦荟，开普芦荟，皂质芦荟，不夜城芦荟，什锦芦荟，元江芦荟，珍珠芦荟，细茎芦荟，添加量为降解剂质量32～57％(质量分数)，其中芦荟多糖含量为降解剂质量0.60～1.15％(质量分数)。
15.进一步的，所述鲜柠檬包括如下种类：尤力克柠檬，香水柠檬，台湾青柠，北京青柠，添加量为降解剂质量42～67％(质量分数)，鲜芦荟和鲜柠檬一起榨汁、过滤得汁渣和汁液：汁渣粉碎至40～80目，加入0.1-0.3％无机盐溶液，搅拌均匀；加入占汁液质量分数为1～2％的葡萄糖，搅拌均匀；汁渣和汁液分别于80～100℃低温蒸汽灭菌15～20min，冷却至室温。
16.进一步的，所述无机盐溶液配方为(占降解剂质量分数)：(nh4)2so
4 0.03～0.09％、kh2po
4 0.03～0.09％、mgso
4 0.01～0.03％、nacl 0.01～0.03％、cuso
4 0.01～0.03％、cdcl
2 0.001～0.01％。
17.进一步的，向灭菌冷却后的汁渣中加入解淀粉芽孢杆菌(保藏编号为cgmcc no：1.8719)菌液，初始浓度为109～10
10
cfu/ml，置于30～37℃培养36～48h，使菌液浓度达到10
10
～10
11
cfu/ml。
18.向灭菌冷却后的汁液中加入酿酒酵母(保藏编号为cgmcc no：2.3889)菌液，初始浓度为107～108cfu/ml，28～33℃，150～180rpm，发酵48～60h后，使酿酒酵母菌液浓度达到108～109cfu/ml。
19.进一步的，将发酵后的汁渣过滤弃渣，将滤液加入发酵后的汁液中，再加入占降解剂质量为0.2～0.7％(质量分数)的肉桂醛、0.04～0.4％(质量分数)的固定化漆酶、0.04～0.1％(质量分数)的吐温，吐温包括如下种类：吐温-20，吐温-40，吐温-60，吐温-80，吐温-85。混合均匀后制得afb1降解剂，其中固定化漆酶酶活为48～56u/ml，吐温的纯度大于99％，三者均为商品化试剂，可从试剂公司获得。
20.除非特别说明，以上所用试剂和材料均为市购。
21.本发明的有益效果
22.本发明afb1降解剂对黄曲霉毒素b1的降解安全、高效、反应温和，对afb1的降解率可高达80～87％，使其在粮食中含量达到现行国家标准：afb1限量标准gb 2761-2011。
23.本发明的芦荟中含有多种有效活性成分，能有效的降解afb1；解淀粉芽孢杆和酿酒酵母发酵，不仅能够使芦荟中的有效成分充分的释放出来，它们的代谢产物及多种酶活性成分也对afb1具有降解作用；漆酶本身具有降解afb1的作用，固定化之后增强了漆酶的稳定性，肉桂醛具有还原性，无机盐中含有的铜和镉有利于增强固定化漆酶的活力，柠檬汁提供的酸性环境和吐温可促进固定化漆酶降解afb1，使本afb1降解剂相较于单一成分的降解剂获得更好的降解效果。
附图说明
24.图1为不同黄曲霉毒素b1(afb1)降解剂添加量对afb1的降解作用。
25.图2为黄曲霉毒素b1(afb1)降解剂对发霉花生中afb1的降解作用。
具体实施方式
26.下面结合实施例，对本发明的具体的实施方式进一步详细描述。以下实施例是用来进一步说明本发明的内容，而不限制本发明的保护范围。对于本发明所涉及的相关内容及所做的修改，均属于本发明保护范围。
27.实施例1
28.一种黄曲霉毒素b1(afb1)降解剂，是将鲜芦荟和鲜柠檬一起榨汁、过滤，汁渣粉碎后加入无机盐溶液，汁液加入葡萄糖，然后分别将解淀粉芽孢杆菌和酿酒酵母接种到灭菌冷却后的汁渣和汁液中，最后将发酵后的汁渣过滤弃渣，将解淀粉芽孢杆菌发酵汁渣后的滤液加入经酿酒酵母发酵后的汁液中，再加入肉桂醛、固定化漆酶、吐温后制得afb1降解剂，其中肉桂醛和吐温分别作为油相和表面活性剂，去离子水作为水相，三者在试管中混合，超声处理30～60min，然后在25～35℃水浴中静置24～36h。
29.所述固定化漆酶包括如下种类：活性炭固定化漆酶或壳聚糖固定化漆酶，其中漆酶的固定化方法为：取0.2～0.8g活性炭或壳聚糖，加入ph值为3.0～6.0的漆酶磷酸盐缓冲溶液中(0.1～0.5mg/ml、2～5ml)，20～35℃下振荡6～12h，过滤，用磷酸盐缓冲溶液(0.02～0.08mol/l，ph 5.0～7.0)洗涤，即得固定化漆酶。
30.鲜芦荟包括如下种类：库拉索芦荟，木立芦荟，开普芦荟，皂质芦荟，不夜城芦荟，什锦芦荟，元江芦荟，珍珠芦荟，细茎芦荟，添加量为降解剂质量32～57％(质量分数)，其中芦荟多糖含量为降解剂质量0.60～1.15％(质量分数)。
31.所述鲜柠檬包括如下种类：尤力克柠檬，香水柠檬，台湾青柠，北京青柠，添加量为降解剂质量42～67％(质量分数)，鲜芦荟和鲜柠檬一起榨汁、过滤得汁渣和汁液：汁渣粉碎至40～80目，加入0.1-0.3％无机盐溶液，搅拌均匀；加入占汁液质量分数为1～2％的葡萄糖，搅拌均匀；汁渣和汁液分别于80～100℃低温蒸汽灭菌15～20min，冷却至室温。
32.所述无机盐溶液配方为(占降解剂质量分数)：(nh4)2so
4 0.03～0.09％、kh2po
4 0.03～0.09％、mgso
4 0.01～0.03％、nacl 0.01～0.03％、cuso
4 0.01～0.03％、cdcl
2 0.001～0.01％。
33.向灭菌冷却后的汁渣中加入解淀粉芽孢杆菌(保藏编号为cgmcc no：1.8719)菌液，初始浓度为109～10
10
cfu/ml，置于30～37℃培养36～48h，使菌液浓度达到10
10
～10
11
cfu/ml。
34.向灭菌冷却后的汁液中加入酿酒酵母(保藏编号为cgmcc no：2.3889)菌液，初始浓度为107～108cfu/ml，28～33℃，150～180rpm，发酵48～60h后，使酿酒酵母菌菌液浓度达到108～109cfu/ml。
35.将发酵后的汁渣过滤弃渣，将解淀粉芽孢杆菌发酵汁渣后的滤液加入经酿酒酵母发酵后的汁液中，再加入占降解剂质量为0.2～0.7％(质量分数)的肉桂醛、0.04～0.4％(质量分数)的固定化漆酶、0.04～0.1％(质量分数)的吐温，吐温包括如下种类：吐温-20，吐温-40，吐温-60，吐温-80，吐温-85，混合均匀后制得afb1降解剂，其中固定化漆酶酶活为48～56u/ml，吐温的纯度大于99％。
36.取上述afb1降解剂0.1～0.5ml，添加到2ml初始浓度为2μg/ml的afb1标准液中，涡旋混匀后在30℃，180rpm条件下避光反应20h，用hplc测定反应体系中afb1剩余量。结果如图1所示。
37.实施例2
38.一种afb1降解剂，是将鲜芦荟和鲜柠檬一起榨汁、过滤，汁渣粉碎后加入无机盐溶液，汁液加入葡萄糖，然后分别将解淀粉芽孢杆菌和酿酒酵母接种到灭菌冷却后的汁渣和汁液中，最后将发酵后的汁渣过滤弃渣，将解淀粉芽孢杆菌发酵汁渣后的滤液加入经酿酒酵母发酵后的汁液中，再加入肉桂醛、固定化漆酶、吐温后制得afb1降解剂，其中肉桂醛和吐温分别作为油相和表面活性剂，去离子水作为水相，三者在试管中混合，超声处理30～60min，然后在25～35℃水浴中静置24～36h。
39.所述固定化漆酶包括如下种类：活性炭固定化漆酶或壳聚糖固定化漆酶，其中漆酶的固定化方法为：取0.2～0.8g活性炭或壳聚糖，加入ph值为3.0～6.0的漆酶磷酸盐缓冲溶液中(0.1～0.5mg/ml、2～5ml)，20～35℃下振荡6～12h，过滤，用磷酸盐缓冲溶液(0.02～0.08mol/l，ph 5.0～7.0)洗涤，即得固定化漆酶。
40.鲜芦荟包括如下种类：库拉索芦荟，木立芦荟，开普芦荟，皂质芦荟，不夜城芦荟，什锦芦荟，元江芦荟，珍珠芦荟，细茎芦荟，添加量为降解剂质量32～57％(质量分数)，其中芦荟多糖含量为降解剂质量0.60～1.15％(质量分数)。
41.所述鲜柠檬包括如下种类：尤力克柠檬，香水柠檬，台湾青柠，北京青柠，添加量为降解剂质量42～67％(质量分数)，鲜芦荟和鲜柠檬一起榨汁、过滤得汁渣和汁液：汁渣粉碎至40～80目，加入0.1-0.3％无机盐溶液，搅拌均匀；加入占汁液质量分数为1～2％的葡萄糖，搅拌均匀；汁渣和汁液分别于80～100℃低温蒸汽灭菌15～20min，冷却至室温。
42.所述无机盐溶液配方为(占降解剂质量分数)：(nh4)2so
4 0.03～0.09％、kh2po
4 0.03～0.09％、mgso
4 0.01～0.03％、nacl 0.01～0.03％、cuso
4 0.01～0.03％、cdcl
2 0.001～0.01％。
43.向灭菌冷却后的汁渣中加入解淀粉芽孢杆菌(保藏编号为cgmcc no：1.8719)菌液，初始浓度为109～10
10
cfu/ml，置于30～37℃培养36～48h，使菌液浓度达到10
10
～10
11
cfu/ml。
44.向灭菌冷却后的汁液中加入酿酒酵母(保藏编号为cgmcc no：2.3889)菌液，初始浓度为107～108cfu/ml，28～33℃，150～180rpm，发酵48～60h后，使酿酒酵母菌液浓度达到108～109cfu/ml。
45.将发酵后的汁渣过滤弃渣，将解淀粉芽孢杆菌发酵汁渣后的滤液加入经酿酒酵母发酵后的汁液中，再加入质量分数为0.2～0.7％的肉桂醛、0.04～0.4％的固定化漆酶、0.04～0.1％的吐温，吐温包括如下种类：吐温-20，吐温-40，吐温-60，吐温-80，吐温-85，混合均匀后制得afb1降解剂，其中固定化漆酶酶活为48～56u/ml，吐温的纯度大于99％。
46.将培养7d的发霉花生粉末10g于115℃灭菌10min，取上述afb1降解剂0.5g，再加入ph 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液20ml，40℃，180rpm避光反应18h。反应结束后，向花生粉末中加入10ml甲醇，超声20min提取花生中的afb1，超声后12000rpm离心10min取上清液过0.22μm滤膜，用hplc检测花生粉末中afb1的残余量。未添加afb1降解剂的发霉花生粉末作为空白对照。结果如图2所示。