1.本发明涉及一种肿瘤抗原肽疫苗，特别涉及免疫细胞靶向的肿瘤抗原肽疫苗。


背景技术：

2.肿瘤抗原疫苗是肿瘤免疫疗法中的一个研究热点，其中利用肿瘤抗原肽即只包含肿瘤细胞 中引起免疫应答所必需的抗原部分使得疫苗更有特异性。在体内，肿瘤抗原肽有两条途径可 以走，一条为抗原肽结合主要组织相容性复合物ii类(mhcii)，进而激活cd4+t细胞；另 一条为抗原肽呈递给主要组织相容性复合物i类(mhci)进而激活cd8+t细胞为ctl(细胞 毒性t淋巴细胞)，ctl则能够攻击肿瘤细胞，达到杀伤体内肿瘤，治疗癌症的效果，同时肿 瘤细胞的裂解也会释放肿瘤抗原，为患者提供肿瘤抗原的刺激，因此我们更关注于cd8+t细 胞激活途径，这条途径被称为交叉呈递。当肿瘤抗原肽疫苗注入体内后，抗原肽被抗原呈递 细胞(apc)，如巨噬细胞，b细胞，树突状细胞所呈递处理。其中树突状细胞(dc)是目前 认为功能最强大的apc。因此，当肿瘤抗原肽疫苗进入体内后能够靶向dc则能大大增强外源 性肿瘤抗原肽交叉呈递，激活ctl以杀伤肿瘤细胞。
3.虽然肿瘤抗原dc疫苗能够较有效解决交叉呈递能力差的问题，但其临床应用由于dc体外 培养费用高，操作复杂，难以推广。而且肿瘤抗原肽疫苗在体内免疫原性低，在还没激活免 疫系统时就易被降解，因此需要一种靶向dc的肿瘤抗原肽疫苗以促进更多的抗原肽递送给 dc，促进dc的成熟，增加交叉呈递。


技术实现要素：

4.针对背景技术提出的问题，本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种能 够靶向dc的肿瘤抗原肽疫苗，以增加肿瘤抗原肽被dc摄取和处理，并且能够促进dc成熟， 增加交叉呈递。
5.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
6.一种能够靶向树突状细胞的肿瘤抗原肽疫苗的制备及应用，包括以下步骤：
7.(1)为了构建表达载体pet22b-mgm-csf-cta2-ova257-264，将ova257-264基因克隆 到pet22b-mgm-csf-cta2(实验室保存质粒)载体中，使用sali和xhoi限制性位点。 mgm-csf-cta2-ova257-264的氨基酸序列如seq id no.1所示；
8.(2)为了构建表达载体pet28b-ctb-ova257-264，使用nhei和xhoi限制性位点将 ova257-264(siinfekl)基因克隆到pet28a-ctb(实验室保存质粒)中。ctb-ova257-264 的氨基酸序列如seq id no.2所示；
9.(3)将步骤(1)(2)所得的表达载体导入大肠杆菌宿主菌中；
10.(4)通过蛋白表达纯化获得目的蛋白mgm-csf-cta2-ova257-264，将蛋白 mgm-csf-cta2-ova257-264，ctb(实验室保存蛋白)，按照摩尔比1∶1混合在一起，通过酸 碱嵌合的方法获得重组霍乱毒素样嵌合蛋白m6m-csf-cta2-ova257-264/ctb；
11.(5)通过蛋白表达纯化获得目的蛋白ctb-ova257-264，按照步骤(4)获得重组霍乱
毒素样 嵌合蛋白mgm-csf-cta2/ctb-ova257-264；
12.(6)表达产物的鉴定和生物学活性分析，包括纯化蛋白的鉴定，gm1结合活性分析，骨髓来 源dc的增殖活性分析，gm1介导的内吞作用分析等。
13.优选的，所述步骤(3)中，pet22b-mgm-csf-cta2-ova257-264导入至rosetta(de3)，导入至bl21(de3)。
14.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
15.1、霍乱毒素(ct)是由霍乱弧菌分泌的一种细菌外毒素，由a亚基(cta)和无毒五聚 体b亚基(ctb)组成。单独的五聚体ctb在体内无明显毒性，能够与dc细胞膜上存在的神 经节苷脂gm1结合，因此当ctb荷载抗原时，经结合gm1，通过受体介导的内吞作用增加dc 对抗原肽的摄取，加工处理，并且在施加部位形成抗原肽库，增加交叉呈递。目前与外源性 抗原交叉呈递有关的受体主要有：c型凝集素受体、tlr受体、识别免疫复合物igg的fc γ受体、识别凋亡细胞的清道夫受体、热休克蛋白受体、趋化因子受体、cd40、cd11c等(natureimmunology，2006，7(10)：1029-1035；frontiers in immunology，2018，9：1231； nanomedicine，2017，12(16)：1945-1959)，鲜有关于gm1受体介导交叉呈递的研究。本发 明的重组霍乱毒素样嵌合蛋白能够通过结合gm1锚定dc，并经gm1受体介导的内吞作用进入 到细胞中，呈现蛋白剂量依赖性的内吞效率，蛋白剂量增加，内吞效率就越高。且在较高蛋 白浓度下，gm1结合活性没有趋于平台，呈现剂量依赖性的gm1结合活性增加。
16.2、cta包括cta1和cta2，cta1是毒素有毒部分，本发明的重组霍乱毒素样嵌合蛋白使 用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mgm-csf)取代cta1，能够在肿瘤抗原肽疫苗靶向dc， 被dc内吞之后，发挥刺激dc成熟的功能，增加dc对肿瘤抗原肽的处理，具有刺激骨髓来 源dc增殖的效果，增殖效果明显，且同一浓度下增殖效果优于商用的gm-csf。
17.3、本发明的重组霍乱毒素样嵌合蛋白能够在无非特异性刺激dc成熟物质(如lps，ifn-γ 等)的辅助下，在体外能够直接刺激dc的成熟，促进嵌合蛋白和mhci结合。
18.4、本发明的重组霍乱毒素样嵌合蛋白的cta2的c末端有kdel序列，能够帮助蛋白定 位在内质网，增加抗原肽在内质网的保留。而在交叉呈递的途径上，当抗原肽经gm1结合进 入dc后，抗原肽和mhci的结合主要在内质网(journal of dermatological science，volume55，issue 2，august 2009，pages 116-122)，因此该kdel序列有利于促进外源性抗原的 交叉呈递。同时，基于天然cta2的kdel序列有利于保持ct六聚体结构，并且以天然侵染 的方式增加dc对抗原肽的识别摄取。
附图说明
19.图1是靶向dc肿瘤抗原肽疫苗的结构示意图。
20.图2是质粒构建图及目的蛋白sds-pgae图，其中a图为质粒pet28b-ctb-ova257-264构 建图谱及变性电泳图谱；b图为质粒pet22b-mgm-csf-cta2-ova257-264构建图谱及变性电泳 图谱；泳道m，marker；泳道1，诱导前；泳道2，诱导后；泳道3，裂解上清；泳道4，裂 解沉淀；泳道5，纯化后的蛋白。
21.图3是目的蛋白的体外活性测试，其中a图为目的蛋白的gm1结合活性，其中pbs是空白 对照，ctb是阳性对照，mgm-csf-cta2是阴性对照；b图为骨髓来源细胞增殖活性测试，其 中pbs是空白对照，ctb是阴性对照，commercial gm-csf是阳性对照组。
page上样缓冲液混匀后在沸水下煮10min。之后，10000rpm下离 心3min后各取上清10μl跑sds-page。
42.(2)根据sds-pgae结果，从每个皿中挑1个能够诱导出较多目的蛋白的单菌落接种至1 根有10ml含相应抗性的lb中，在37℃，200rpm下振荡培养12小时。然后取700μl菌 液和300μl灭菌的甘油，充分混合均匀后，parafilm封好写上日期放-20
°
冰箱保存。
43.优选的，所述步骤(1)中，震荡培养速度为200rpm。
44.优选的，所述步骤(1)中，iptg的浓度为1mm。
45.实施例3
46.(1)超净台上接菌6根lb试管，取10μl菌液+对应抗生素10μl到10ml lb，37℃， 200rpm，摇12h，按2％的量(10ml)转接到500ml lb摇瓶，再加对应抗生素500μl(储 存液是50mg/ml，终浓度是50μg/ml)，37℃，200rpm，摇5h。在超净台上加1mm iptg 350 μl(储存液是1mol/l，终浓度是1mmol/l)诱导5h。提前洗涤煮沸6个250ml离心瓶， 均匀分装6个离心瓶，(保证完全配平，离心瓶溶液的量不超过总容量的2/3)在4000-10000 rpm，离心15min。其中取1ml诱导后的菌液在小型离心机中离心，留沉淀作诱导后样品跑 电泳。
47.(2)弃去离心后的上清，将离心瓶的湿菌体整合至1个离心瓶，并称重计算所得湿菌体 的重量，按比例1g湿菌体：10ml裂解缓冲液悬浮于裂解缓冲液(25mmol/l tris-hcl (ph＝8.00)，80μg/ml溶菌酶，1mmol/l edta和终浓度为1％的triton x-100)中，磁力 搅拌器搅拌均匀以达到悬浮目的。重新悬浮后，反复冻融6-8次，10000rpm离心15min离 心后弃上清。其中取1ml诱导后的裂解液在小型离心机中离心，留上清作裂解上清，留沉淀 作裂解沉淀跑电泳。
48.(3)离心后所得沉淀即包涵体进行洗涤，按1g包涵体湿重：10ml包涵体洗涤液a(25mmol/ltris-hcl(ph＝8.00)，终浓度为0.5％的triton x-100)的量加，加入磁力搅拌子，在4℃搅 拌1h，使沉淀重新悬浮均匀，之后4℃，10000rpm，15min离心，(每次洗涤上清留样)，弃 上清。包涵体洗涤液a洗涤3次。沉淀按1g包涵体湿重：10ml包涵体洗涤液b(25mmol/ltris-hcl(ph＝8.00)，终浓度为2mol/l的尿素)洗涤，包涵体洗涤液b洗涤2次(每次洗涤 上清留样)。最后用蒸馏水洗去残留的洗涤液，洗涤2次，取沉淀留样跑电泳。称重洗涤后 包涵体的重量。
49.(4)洗涤后的包涵体沉淀，按1g包涵体湿重：10ml 8mol/l的尿素溶液(溶解在25mmtris-hcl缓冲液)的量加，再加入β巯基乙醇至终浓度为1％或终浓度为10mm的dtt，用磁 力搅拌子在4℃搅拌过夜，使沉淀溶解。用大型冷冻离心机，4℃，10000rpm，20min离心收 集上清弃沉淀。
50.(5)溶解上清用8mol/l的尿素溶液稀释5-10倍，并将稀释液装进透析袋中。透析外液 依次为6m、4m、3m、2m、1m、0.5m和0m尿素溶液(溶解在25mm tris-hcl缓冲液)，每个 浓度在4℃下透析8h。
51.(6)装柱ni-nta purose 6 fast flow，并用25mm tris-hcl缓冲液(ph＝8.00)平衡。 将透析后的溶液用蠕动泵加入镍柱中，核酸蛋白检测仪280nm检测流出液的吸光值，收集流 出液，取样，备12％sds-page检测。上样后，用25mmol/l的tris-hcl缓冲液(ph8.00) 洗涤镍柱，直至检测器基线持平。之后依次用咪唑梯度洗脱蛋白，20mm，50mm，100mm， 200mm，300mm，500mm咪唑溶液(溶于25mm tris-hcl(ph8.00))，每个浓度洗脱50ml。 收集各
洗脱峰，12％sds-page检测蛋白峰。将含纯化的目的蛋白的洗脱液装入透析袋中，透 析外液为去离子水，在4℃下透析除盐。之后将透析液装入平皿里，置于-20℃冷冻成冰，经 冷冻干燥后收集蛋白冻干粉保存于-20℃。
52.优选的，所述步骤(1)中，离心速度为10000rpm。
53.优选的，所述步骤(2)中，冻融次数为8次。
54.优选的，所述步骤(4)中，此处优选加终浓度为10mm的dtt，
55.优选的，所述步骤(5)中，溶解上清稀释8倍。
56.参阅图1对目的蛋白进行鉴定，其中图1a为质粒 pet28b-ctb-ova257-264构建图谱及ctb-ova257-264蛋白变性电泳图谱； 图1b为质粒pet22b-mgm-csf-cta2-ova257-264构建图谱及 mgm-csf-cta2-ova257-264蛋白变性电泳图谱。泳道m，marker；泳道1， 诱导前；泳道2，诱导后；泳道3，裂解上清；泳道4，裂解沉淀；泳道5， 纯化后的蛋白。从图1的蛋白变性电泳图可以看出获得纯化的目的蛋白。
57.实施例4
58.(1)将上述留样的样品在12％sds-page凝胶上进行电泳验证。取少量蛋白冻干粉溶于 pbs混匀，在10000rpm离心3min取上清。蛋白质样品按摩尔比1∶1混合后，用0.5m柠 檬酸(溶于pbs)调ph至2.3，在23℃下变性20min。之后用2m tris(ph 8.5)中和至 ph8.5，在4℃下复性至少1小时。通过bac法测定蛋白浓度。
59.参阅图2为靶向dc肿瘤抗原肽疫苗的结构示意图。
60.实施例5
61.(1)将神经节苷脂gm1母液用pbs稀释为15μg/ml，每孔加入100μl，在4℃下孵 育过夜以包被gm1。每孔用含10％bsa(m/v)的pbs在37℃封闭2h。用pbst洗涤3次 后，将纯化的蛋白质稀释至不同的浓度(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/ml))并按 每孔100μl加入孔板中，在37℃下孵育1h后，洗涤3次，将抗ctb多克隆抗体按1∶200
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1∶2000稀释的稀释液，添加到孔板中，并在37℃下孵育1h。洗涤后，加入hrp标记的 羊抗兔二抗按1∶4000-1∶80000稀释的稀释液，37℃孵育1h。加入tmb显色液(250μl 2mg/mltmb(溶于无水乙醇)，2.25ml去离子水，2.5ml cbs(1.8g磷酸氢二钠，0.51g柠檬酸用 去离子水定容至50ml))在室温避光孵育15分钟后每孔加入50μl 2m h2so4并在450nm 下读取吸光度值。
62.(2)取出c57bl/6j小鼠的胫骨、股骨，将胫骨和股骨取出放入装10ml rpmi-1640完 全培养基(含10％fbs，1％青霉素/链霉素和1％l-谷氨酰胺)的培养皿中，将股骨和胫骨 剪成两半，用1ml的注射器吸取完全培养基轻轻插入骨髓腔，冲出骨髓细胞至骨头内无红 色内容物。将细胞液通过70μm滤网移至一个无菌的50ml离心管中，再用5ml基础培 养基冲洗培养皿，把液合并至离心管，最后把细胞悬液放置冰上。将细胞悬液分装至两个15 ml离心管中，在1000rpm离心5min，弃上清。获得骨髓来源细胞，用ack lysis buffer 裂解红细胞后，弃上清。用pbs洗涤，用完全培养基重悬，并按30000个细胞/孔，每孔50μl， 铺96孔板。将蛋白浓度调整0.4，4，40ng/ml，每孔50μl，共培养48h。每孔加入cck8溶 液10μl，在37℃继续培养2h，用酶标仪测定450nm处的吸光值。
63.优选的，所述步骤(1)中，抗ctb多克隆抗体按1∶1000稀释。
64.优选的，所述步骤(1)中，hrp标记的羊抗兔二抗的按1∶5000稀释。
65.参阅图3是目的蛋白的体外活性测试。图3a为蛋白的gm1结合活性， 与空白组pbs
相比，ctb，ctb-ova257-264，mgm-csf-cta2/ctb-ova257-264 及mgm-csf-cta2-ova257-264/ctb均存在良好的体外gm1结合活性；图3b 为蛋白的增殖活性测试结果，取代有毒cta1部分的mgm-csf能够刺激骨髓 来源的细胞增殖，说明mgm-csf有活性，待蛋白与gm1结合后，能够同时刺 激dc成熟。
66.实施例6
67.(1)将上述取得的骨髓来源细胞用培养基悬重新悬浮，按1
×
107个细胞接种到共聚焦培 养皿中，补充20-50ng/ml mgm-csf，10-40ng/ml mil-4，，并在37℃的5％co2中孵育。在 第2、4d按3/4体积更换新鲜培养基并补足细胞因子以诱导分化bmdc，在第6d，获得未成 熟的bmdc。
68.(2)用荧光染料cy5标记的蛋白mgm-csf-cta2，ctb-ova257-264， mgm-csf-cta2/ctb-ova257-264按5-30μg/ml剂量添加至培养皿孵育4h。孵育后，将细胞 用pbs洗涤3次，用4％多聚甲醛室温或4℃固定。洗涤后，用dio(溶于dmso，浓度为5-10μm，) 避光室温染色细胞膜45min，然后pbs洗涤3次，用dapi(溶于pbs，浓度为0.5-10μg/ml) 室温染色30min。通过激光共聚焦显微镜拍照来确定bmdc对它们的摄取。
69.优选的，所述步骤(1)中，mgm-csf的浓度为30ng/ml，mil-4的浓度为20ng/ml。
70.优选的，所述步骤(1)中，荧光染料cy5标记的蛋白的剂量为10μg/ml。
71.优选的，所述步骤(1)中，在4℃固定细胞30min。
72.优选的，所述步骤(1)中，dio的浓度为8μm。
73.优选的，所述步骤(1)中，dapi的浓度10μg/ml.
74.参阅图4是dc对不同蛋白的摄取。分别向骨髓来源的dc添加10μg/ml的不同蛋白，与 阴性对照蛋白mgm-csf-cta2对比，ctb-ova257-264具有能够靶向dc的作用，能够通过受体 介导的内吞作用进入dc内，因此其dc摄取量要高于mgm-csf-cta2。当mgm-csf-cta2和 ctb-ova257-264在体外自组装后，dc对于该肿瘤抗原肽疫苗的摄取是明显增多的，且呈剂 量依赖性的。
75.实施例7
76.(1)按1
×
106个骨髓来源细胞/培养皿的密度接种在confocal中，加入不同浓度的ctb (0.1，1，10μg/ml)在4℃孵育1h以封闭gm1受体，加入cy5染色的 mgm-csf-cta2/ctb-ova257-264在37℃孵育4h。固定洗涤后，dio，dapi染色，经clsm拍 摄以检测gm1受体对于bmdc摄取ct样嵌合蛋白的影响。蛋白剂量为10μg/ml。
77.参阅图5是在不同剂量ctb封闭dc的gm1受体情况下，dc对mgm-csf-cta2 /ctb-ova257-264的摄取情况。从图中可以看出，当dc的gm1受体被0μg/ml或1μg/mlctb封闭时，dc的gm1受体数量受影响不大，添加10μg/ml mgm-csf-cta2/ctb-ova257-264 的蛋白后，dc的摄取量变化不大。但当dc的gm1受体被10μg/ml的ctb封闭时，dc的gm1 受体数量明显减少，添加10μg/ml mgm-csf-cta2/ctb-ova257-264的蛋白时，在dc内部 没有观察到明显的蛋白，即肿瘤抗原肽疫苗能够靶向dc的gm1受体且依赖gm1受体被dc摄 取。
78.实施例8
79.(1)将bmdc细胞以1
×
106细胞/孔的密度接种在24孔板中，并与cy5标记的蛋白 mgm-csf-cta2/ctb-ova257-264孵育48h。细胞在冰上用抗0.1-0.5μg/ml cd11c-fitc， 0.01-0.1μg/ml抗cd86-apc避光染色1h，用流式细胞仪量化dc表面共刺激分子以评估 bmdc
的成熟情况。
80.优选的，所述步骤(1)中，cd11c-fitc染料浓度为0.25μg/ml。
81.优选的，所述步骤(1)中，抗cd86-apc染料浓度为0.06μg/ml。
82.参阅图6是dc摄取mgm-csf-cta2/ctb-ova257-264蛋白48h后，dc的成熟情况。与空白 组pbs对比，当dc被肿瘤抗原肽疫苗刺激48h后，dc的表面共刺激分子cd86明显增加，双 阳性细胞的表达量为14.3％，证明肿瘤抗原肽疫苗靶向dc被摄取后，能够激活dc的成熟， 进而促进交叉呈递。
83.实施例9
84.(1)将cy5标记的蛋白ctb-ova257-264添加至培养第6d的bmdc，在37℃下分别培养 2-48h。孵育后，经洗涤固定，在室温避光条件下分别用浓度50-75nm lyso-tracker green， 浓度0.3-1μm er-tracker green将细胞染色45min。然后pbs洗涤3次，用dapi室温染色 30min。通过clsm拍照来确定蛋白不同时间下在bmdc的位置。蛋白剂量为10μg/ml
85.优选的，所述步骤(1)中，lyso-tracker green浓度为75nm。
86.优选的，所述步骤(1)中，er-tracker green浓度为0.3μm。
87.参阅图7是ctb-ova257-264蛋白被dc摄取后和溶酶体，内质网共定位情况。在2h和12h， 蛋白均与dc的溶酶体共定位，说明部分蛋白在dc中被溶酶体降解，但可以观察到4h到12h， 部分蛋白逐渐移位至内质网，在内质网抗原肽和mhci分子结合。
88.实施例10
89.(1)将上述取得的骨髓来源细胞用培养基悬重新悬浮，按1
×
107个细胞接种到共聚焦培 养皿中，补充30ng/ml mgm-csf，20ng/ml mil-4，并在37℃的5％co2中孵育。在第2、4d 按3/4体积更换新鲜培养基并补足细胞因子以诱导分化bmdc，在第6d，获得未成熟的bmdc。 用荧光染料cy5标记的蛋白mgm-csf-cta2-ova257-264按5-30μg/ml剂量添加至培养皿孵 育4h。孵育后，将细胞用pbs洗涤3次，用4％多聚甲醛室温或4℃固定，优选4℃固定细 胞30min。洗涤后，用dio(溶于dmso，浓度为5-10μm)避光室温染色细胞膜45min，然后 pbs洗涤3次，用dapi(溶于pbs，浓度为0.5-10μg/ml)室温染色30min。通过激光共聚 焦显微镜拍照来确定bmdc对它们的摄取。
90.优选的，所述步骤(1)中，蛋白的剂量为10μg/ml。
91.优选的，所述步骤(1)中，在4℃固定细胞30min。
92.优选的，所述步骤(1)中，dio的浓度为8μm。
93.优选的，所述步骤(1)中，dapi的浓度10μg/ml。
94.参阅图8是dc对mgm-csf-cta2-ova257-264蛋白的摄取。dc可以摄取该蛋白，但与gm1 受体介导的内吞无关，可能通过胞吞/胞饮作用，相应摄取量要少于含有ctb蛋白的肿瘤抗 原肽疫苗。
95.实施例11
96.(1)将cy5标记的蛋白mgm-csf-cta2/ctb-ova257-264添加至培养第6d的bmdc，在37℃ 下分别培养2-48h。孵育后，经洗涤固定，在室温避光条件下分别用浓度为50-75nmlyso-tracker green，浓度为0.3-1μm er-tracker green，浓度为166.5-333μg/mlgolgi-tracker green，将细胞染色45min。然后pbs洗涤3次，用dapi室温染色30min。 通过clsm拍照来确定蛋白不同时间下在bmdc的位置。蛋白剂量为10μg/ml。
97.优选的，所述步骤(1)(2)中，lyso-tracker green浓度为75nm。
98.优选的，所述步骤(1)中，er-tracker green浓度为0.3μm。
99.优选的，所述步骤(2)中，golgi-tracker green浓度为333μg/ml。
100.参阅图9是mgm-csf-cta2/ctb-ova257-264蛋白被dc摄取后和溶酶体，内质网，高尔基 体共定位情况。在2h和12h，少量蛋白在dc中被溶酶体降解，但可以观察到4h到12h，大 部分蛋白逐渐移位至内质网，在内质网抗原肽和mhci分子结合成抗原肽-mhci复合物，并转 移至高尔基体，甚至少部分表达到dc细胞膜上。
101.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中 的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾， 都应当认为是本说明书记载的范围。
102.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不 脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因 此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。