1.本发明涉及无花果多糖的新用途，具体为无花果多糖在降血脂上的用途。
背景技术：
：：2.高脂血症是由遗传、不良饮食习惯及其他疾病等因素引起的脂质代谢紊乱性疾病，其主要特征为血液中总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白(ldl-c)水平升高及高密度脂蛋白(hdl-c)水平下降。而血液中脂质代谢异常则会引起动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗塞等疾病。目前高脂血症已成为严重威胁人类生命健康的主要公共卫生问题。3.无花果(ficuscarical.)为桑科(moraceae)榕属(ficusl.)多年生落叶灌木或小乔木。其果实营养价值高，富含人体所需多种维生素、氨基酸、微量元素以及类黄酮、多糖、挥发油等活性成分，在食品、医药等领域具有广阔应用前景。多糖作为无花果主要的活性成分之一，具有免疫调节、抗氧化等多种生理活性。但目前尚未有无花果多糖具有改善高血脂症功效的相关报道。技术实现要素：4.本发明对无花果中具有降血脂功效的活性部位进行了开拓性研究，同时拓展了无花果多糖的新用途。5.为了达到上述目的，本发明提供了无花果多糖在制备预防或治疗高脂症药物或在制备改善高脂症保健品上的应用。6.本发明首次对无花果具有降血脂功效的活性部位进行研究，获取了具有抑制脂肪堆积、改善脂质代谢紊乱功效的多糖部位，为进一步拓展高血脂的用药来源奠定了研究基础。7.进一步的，无花果多糖通过以下步骤制备：8.(1)脱脂：取无花果干燥粉末，进行脱脂处理；9.(2)多糖提取：脱脂处理完成后，采用超声协同酶法，提取获得无花果多糖。10.其中，步骤(1)脱脂处理后，进行过滤，并将滤渣干燥后再进行步骤(2)的多糖提取；步骤(2)中超声协同酶法采用复合酶，包括果胶酶、纤维素酶和蛋白酶；果胶酶的添加量占步骤(1)所得干燥滤渣质量的0.5％，纤维素酶的添加量占步骤(1)所得干燥滤渣质量的1％，蛋白酶的添加量占步骤(1)所得干燥滤渣质量的1.5％。11.更为具体的，无花果多糖通过以下步骤制备：12.(1)脱脂：取无花果干燥粉末，以90％乙醇为溶剂进行提取去除脂质及单糖，过滤，所得滤渣干燥；13.(2)多糖提取：将步骤(1)所得的干燥滤渣，按液固比27ml/g加入蒸馏水，并添加复合酶，采用超声协同酶法，超声-酶解温度为69℃，超声-酶解时间41min；结束后用冰水灭酶，常温离心后取上清液，浓缩后醇沉，取沉淀物干燥即得所述无花果多糖。14.其中，步骤(2)超声协同酶法中超声条件为：超声功率150w。15.上述无花果干燥粉末通过以下方法制备：于无花果成熟期采集新鲜无花果，去除腐烂、霉变果实，用清水洗去果实表面灰尘，晾干表面水分后切成0.5cm厚片，真空冷冻干燥48h，粉碎成粉末，过60目筛后备用。16.进一步的，步骤(1)脱脂的具体步骤为：取无花果干燥粉末，按液固比40ml/g加入90％乙醇，于80℃水浴锅中热回流4h，真空抽滤，收集滤渣，重复以上脱脂操作2次，滤渣于45℃烘箱中烘10min，-20℃充分冷冻后，于真空冷冻干燥机干燥48h，得干粉后，再进行步骤(2)的多糖提取。17.本发明相比现有技术具有以下优点：18.1、本发明首次对无花果中具有降脂功效的活性部位进行研究，拓展了无花果的药用用途，同时扩展了降血脂药物的用药来源。19.2、本发明通过对具有降血脂功效的无花果多糖进行提取工艺改进，获得具有多糖含量高、降脂活性强，且制备工艺简单易控的提取工艺。附图说明20.图1为不同处理后hepg2细胞油红o染色图；21.图中，a为con组，b为hfd模型组，c为fccp低剂量组，d为fccp高剂量组；22.图2为不同处理对oa-hepg2细胞中各项生化指标的影响；23.图3为不同处理对小鼠血液中脂质指标的影响；24.图4为不同处理对小鼠体重、肝脏肥大及脂肪堆积的影响；25.图5为液固比对无花果多糖得率的影响；26.图6为超声-酶解温度对无花果多糖得率的影响；27.图7为超声-酶解时间对无花果多糖得率的影响。具体实施方式28.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。29.实施例130.无花果多糖提取工艺筛选例31.1材料与试剂32.1.1实验材料33.供试无花果(ficuscarical.)果实采自句容市虎耳山无花果专业合作社基地，经江苏省中国科学院植物研究所梁呈元研究员鉴定为‘玛斯义陶芬’品种。34.1.2实验试剂35.1)纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、葡萄糖标准品(美国sigma-aldrich公司)36.2)5％苯酚(北京solarbio公司)37.3)浓硫酸、无水乙醇(分析纯，南京化学试剂股份有限公司)。38.1.3实验仪器与设备39.1)低温高速离心机(德国eppendorf公司)40.2)infinitem200多功能酶标仪(瑞氏tecan公司)41.3)真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)42.4)电热恒温水浴锅(上海新苗医疗器械制造有限公司)43.5)旋转蒸发仪(瑞士buchi公司)44.6)kq-300de数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)45.2实验方法及结论46.2.1无花果预处理47.于无花果成熟期采集新鲜无花果，去除腐烂、霉变果实，用清水洗去果实表面灰尘，晾干表面水分后切成0.5cm厚片，真空冷冻干燥48h，粉碎成粉末，过60目筛后备用。48.2.2无花果粗多糖提取49.2.2.1脱脂处理50.称取500g无花果粉末置于圆底烧瓶中，加入2l90％乙醇(v/v)，于80℃水浴锅中热回流4h，以除去无花果中脂质、色素及单糖等小分子物质，真空抽滤，收集滤渣，重复脱脂操作2次，滤渣于45℃烘箱中烘10min，以挥去部分乙醇。-20℃充分冷冻后，于真空冷冻干燥机干燥48h，得到无花果干粉。51.2.2.2提取流程52.精确称取1.0g无花果干粉，按一定料液比加入蒸馏水，添加适量一定比例复合酶，调节ph值为6。于50℃下超声提取一定时间，结束后用冰水灭酶10min，4500r/min常温离心10min，上清液减压浓缩(浓缩至原体积的1/10～1/15)，4倍体积95％乙醇醇沉后，取沉淀干燥后得无花果粗多糖(fccp)。53.2.3无花果多糖得率测定54.2.3.1标准曲线绘制55.将适量葡萄糖标准品置于105℃烘箱中干燥至恒重，精确称取25mg溶解于去离子水中，转移至250ml容量瓶中，定容，得到100μg/ml的葡萄糖标准母液。精密吸取标准液0、20、40、60、80、100μl于1ml带盖离心管中，去离子水补齐至100μl，然后加入50μl的5％苯酚溶液，涡旋混匀1s，迅速滴加浓硫酸250μl，涡旋混匀1s，室温静置10min后沸水浴15min，冷却至室温，于490nm处测定od值。以od值a为横坐标，葡萄糖浓度c为纵坐标，得到标准曲线：c(μg/ml)＝90.394a-14.559，r2＝0.9991。56.2.3.2多糖得率计算57.称取适量fccp完全溶解于去离子水中，稀释一定比例，取稀释液按2.3.1中苯酚硫酸法测定od值，计算多糖得率公式如下：58.无花果多糖得率＝ncv/1000m*100％59.其中，n为稀释倍数，c为稀释液多糖浓度(mg/ml)，v为多糖样品液体积(ml)，m为预处理无花果粉末质量(g)。60.2.4超声协同酶法提取无花果多糖条件优化61.2.4.1复合酶添加量确定62.针对无花果多糖分布部位，选择果胶酶、纤维素酶和蛋白酶用于破环果肉细胞壁，最大限度释放多糖。准确称取预处理的无花果粉末1g于100ml三角瓶中，按液固比40ml/g加入蒸馏水，调节溶液ph值至6。按不同比例加入不同质量分数的果胶酶、纤维素酶及蛋白酶，充分溶解后，50℃超声(超声功率150w)协同酶解60min，冰水灭酶10min，按2.2方法得无花果多糖，测定并计算多糖得率，选择提取效果最佳的复合酶比例进行后续实验。复合酶用量正交试验因素设计见表2-1。63.表2-1正交试验因素水平表64.table2-1factorsandlevelsoforthogonalexperiment[0065][0066]复合酶用量正交试验结果见表2-2，通过直接对比分析可知，多糖得率最高的是第7组a1b2c3组合，得率为44.47％。此时，各酶用量分别为：果胶酶0.5％，纤维素酶1.0％，蛋白酶1.5％。因此，确定该配比酶用量作为最佳复合酶添加量，进行下一步提取条件优化研究。[0067]表2-2正交试验结果[0068]figure2-2resultforthogonalexperiment[0069][0070][0071]2.4.2无花果多糖提取单因素试验[0072]精确称取预处理的无花果粉末1g，以上述得到的果胶酶、纤维素酶和蛋白酶添加量、液固比40ml/g、ph值6.0，超声-酶解时间为1.0h，温度50℃为提取流程中的常规量，分别考察液固比(10、20、30、40、50ml/g)、超声-酶解温度(40、50、60、70、80℃)、超声-酶解时间(20、30、40、50、60min)对无花果多糖得率的影响，每个处理重复3次，单因素设计水平表见表2-3。[0073]表2-3单因素设计水平表[0074]table2-3singlefactortestdesign[0075][0076]由图5所示，液固比在10ml/g到40ml/g之间时，无花果多糖得率逐渐升高，在40ml/g处得率达到最高值41.27％。继续增大液固比，多糖得率反而下降。分析原因可能是溶剂量较小时，无花果粉不能充分溶解，导致得率低，随着液固比增加，浓度差变大，更多溶质可以溶解出来，得率逐步提高，液固比超过40ml/g时，溶剂量过大，其他可溶性物质开始溶出，这些杂质中某些成分可能导致无花果多糖的分解。因此，选取40ml/g液固比作为后续实验中心水平值。[0077]由图6可知，在超声-酶解温度40～80℃范围内，无花果多糖得率有明显差异，40℃时，多糖得率最低，随着温度升高，多糖得率逐渐升高，70℃时达到最大值42.24％，随后继续升高温度，多糖得率却开始下降。这表明温度对无花果多糖提取有一定的影响，较低温度条件下酶活力较低，分子相对运动较弱，导致提取率偏低；温度过高，酶的空间结构会受到破环，活性受到抑制；在合适温度70℃下，酶活性最高。因此选取70℃作为下一步实验中心水平值。[0078]从图7可以看出，超声-酶解时间对无花果多糖的提取有一定影响，在超声-酶解时间20min延长至30min时，多糖得率由38.16％上升到最大值40.14％。继续延长提取时间，得率显著下降。这是由于超声-酶解时间不足，部分无花果多糖未被提取出来；而时间过长，超声波会对多糖结构造成破坏，且酶解产物达到一定浓度会对酶产生反馈抑制作用，酶活性降低。故选择30min超声-酶解时间作为实验中心水平值。[0079]2.4.3响应面法优化试验[0080]根据单因素实验结果，选择液固比、超声-酶解温度、超声-酶解时间为自变量，无花果多糖得率为响应值，利用designexpert8.0.7软件中box-behnken模块设计响应面试验，并进行方差和回归分析，预测超声协同酶法提取无花果多糖的最佳工艺，完成实验验证。[0081]基于前期单因素试验结果，选择对无花果多糖得率影响显著的因素：液固比、超声-酶解时间和超声-酶解温度，用于进一步的响应面试验优化。选择得率为响应面试验考察指标。利用designexpert7.0软件中box-behnken模块进行中心组合实验设计(表2-4)，试验结果见表2-5。[0082]表2-4响应面实验设计[0083]table2-4factorsandlevelscodingofresponsesurfacedesign[0091]对所得响应面回归模型进行方差分析，结果见表2-6。校正系数radj2＝0.9848，预测复相关系数r2＝0.9933，预测相关系数rpre2＝0.9591，r2与rpre2相差较小，表明实际值和预测值的偏差在可控范围内，模型拟合度较好。模型＝169.75(p＜0.0001)，表明该回归模型极显著；失拟项f＝0.6209(p》0.05)，不显著，表明该模型成立。回归模型中一次项a、b、c、二次项a2、b2、c2对y值的影响极显著，二次项ab、ac、bc对y值影响不显著。各因素影响无花果多糖得率程度从大到小依次为：液固比(c)》超声-酶解温度(b)》超声-酶解时间(a)。通过软件分析得到无花果多糖最佳提取条件为：液固比27.13ml/g、超声-酶解温度68.73℃，超声-酶解时间41.13min，多糖得率预测值为44.69％。[0092]2.4.4验证试验结果[0093]考虑到实际情况及可操作性，对软件分析得到的最优条件略作调整，即：液固比27ml/g、超声-酶解温度69℃，超声-酶解时间41min，在此条件下进行验证试验，实际得率为44.02％，预测值与实测值相差0.67％，相对误差较小，验证了本响应面模型的有效性。[0094]表2-6响应面回归模型方差分析[0095]table2-6varianceanalysisofregressionmodel[0096][0097]注：**表示差异极显著(p《0.01)[0098]实施例2[0099]产品制备实施例[0100]取干燥无花果1kg，粉碎，用90％乙醇溶液(v/v)8l于80℃水浴回流4小时，去除脂质及单糖等小分子物质，过滤，得滤渣干燥备用。称取干燥滤渣，按液固比27ml/g加入蒸馏水，复合酶添加量：果胶酶0.5％，纤维素酶1.0％，蛋白酶1.5％，提取温度69℃，提取时间41分钟。结束后用冰水灭酶10分钟，4500转/分钟常温离心10分钟，上清液减压浓缩至原体积1/10～1/15，加入4倍体积95％乙醇沉淀，取沉淀物干燥即得无花果多糖fccp。根据实施例1中的测定方法，所得无花果多糖fccp463.6g，实际得率42.28％。[0101]实施例3[0102]无花果多糖体外降脂活性研究[0103]1油酸诱导脂肪堆积细胞模型oa-hepg2建立及给药处理[0104]hepg2细胞用含10％胎牛血清的dmem培养液于37℃，5％co2的细胞培养箱中培养至对数期时，细胞计数板计数控制细胞密度4×105个/ml，接种于6孔细胞培养板中，培养12h至细胞贴壁。无水乙醇溶解oa配制成浓度为100mm的储备液，储备液与含10.5％牛血清白蛋白的无游离脂肪酸dmem培养液以1：399的比例混合，得到250μm造模液。用所得造模液处理hepg2细胞24h建立脂肪堆积细胞模型oa-hepg2，对照组以10％胎牛血清的dmem培养液培养。造模成功后，以无花果多糖0.1mg/ml(fccp低剂量组)和0.2mg/ml(fccp高剂量组)对oa-hepg2细胞进行给药干预。[0105]2hepg2细胞内脂质沉积状况评价[0106]经无花果多糖干预处理的oa-hepg2细胞经pbs清洗后，油红染色10min，75％酒精漂洗脱除多余染料后苏木素复染，光学显微镜观察细胞内脂质积累状况。[0107]如图1显示，与对照组(con组)相比，oa诱导(hfd模型组)可显著增加hepg2细胞内脂质沉积，无花果多糖(fccp低剂量组和fccp高剂量组)干预能显著降低细胞内脂肪含量，有效改善由油酸处理导致的脂肪沉积现象。[0108]3hepg2细胞内脂质相关指标评价[0109]取经无花果多糖干预处理的oa-hepg2细胞，pbs清洗后，加入细胞裂解液，离心收集上清，按照试剂盒说明书测定总甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)。[0110]如图2显示：与对照组(con组)相比，模型组细胞tg、tc、ldl-c显著升高，hdl-c显著下降，表明造模成功。相比于hfd模型组，无花果多糖低剂量组(hfd+fccp0.1组)、高剂量组(hfd+fccp0.2组)tc、tg、ldl-c显著降低，hdl-c显著升高。[0111]实施例4[0112]无花果多糖体内降脂活性研究[0113]1肥胖型小鼠模型的建立[0114]普通级昆明种小鼠，雄性，体重(20±2)g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，随机取5只作为空白组饲喂正常饲料，其余小鼠适应环境3日后喂食高脂饲料(配方：55.9％颗粒标准饲料、18％猪油硬脂(w/w)，5％蛋粉，1％胆固醇，20％蔗糖，0.1％胆盐)。持续喂养9周，分别于第1、5、9测定小鼠体重，根据小鼠体重及血脂水平判断造模是否成功。[0115]2给药处理及脂质代谢指标测定[0116]造模成功后将小鼠随机分为模型组(hfd)和无花果多糖处理组，其中无花果多糖处理组给予按照实施例1制备获得的无花果多糖50mg/kg(低剂量组，hfd+fccp50)、150mg/kg(高剂量组，hfd+fccp150)，并灌胃给药，每日一次，连续4周，模型组(hfd)和空白组(con)给予等体积的纯水。4周后小鼠摘眼球取血，测定血清中tg、tc、ldl-c和hdl-c，并记录各组小鼠体重及脂肪重量。[0117]3实验结果[0118]如图3、4所示，与模型组相比，给予无花果多糖提取物后，一定浓度下(50mg/kg，150mg/kg)可显著降低高血脂症小鼠体重、脂肪以及血浆中tg、tc、hdl-c、ldl-c的含量，并呈现剂量相关性((p《0.001)。该结果提示无花果多糖提取物具有抑制高脂症小鼠体重增长及脂肪堆积，改善脂质代谢紊乱的作用。当前第1页12当前第1页12