1.本发明涉及药物领域，具体涉及一种咖啡酸或其衍生物的金属螯合物纳米颗粒的制备及其应用。


背景技术：

2.目前普遍认为，衰老是由引起细胞损伤和死亡的各种内在和外界因素共同作用的结果。随着自由基生物医学研究的发展，人们逐渐把自由基引起衰老的研究逐渐扩展到更多领域，例如各种伴随衰老的疾病，如老年性痴呆、动脉硬化和糖尿病都和自由基损伤存在密切关系。后来的研究逐渐深入到细胞水平，证明和许多疾病相关的细胞凋亡和坏死都是自由基损伤的结果。
3.根据衰老的自由基理论，组织和器官功能的衰退与活性氧自由基(reactiveoxide species，ros)引发的氧化应激密切相关。例如：椎间盘退变的发生和进展，在髓核细胞的信号通路网中，ros作为重要的介质，调节细胞外基质代谢、促炎因子表型、凋亡、自噬和衰老等。另一方面，退变椎间盘组织中抗氧化蛋白显著降低，明显降低了椎间盘组织的抗氧化能力。这些变化导致椎间盘细胞氧化还原的失衡，容易受到氧化损伤。
4.咖啡酸，化学名为3-(3,4-二羟基苯基)-丙烯酸，分子式为c9h8o4，cas 号:331-39-5，存在于多种植物中，具有收缩、增固微血管，促进凝血因子功能。咖啡酸片是一种常见的临床用药，用于白细胞、血小板减少症的治疗。另外，咖啡酸的结构中具有二羟基酚的结构，可以有效清除多种氧自由基，具有很有强的抗氧化、抗炎症和免疫调节的作用。将咖啡酸用于心脑血管疾病的治疗、抗菌、抗炎、抗肿瘤的研究已有文献报道。本发明中发现咖啡酸及其化合物对于椎间盘损伤具有保护作用。但是咖啡酸属于活性小分子药物，在体内半衰期短，容易被代谢，很难集中在椎间盘病变部位发挥作用，因此，本发明拟通过纳米技术提高咖啡酸的药效，减少系统毒性。
5.纳米药物是用纳米生物技术将抗肿瘤药物等生物活性分子与载体材料相复合，进而利用纳米效应改变药物的药代动力学、药效及药理等方面的性质而获得显著临床优势的纳米复合体。对于针对椎间盘早期退变，目前人为干预是促使椎间盘细胞分泌胞外基质、减缓细胞凋亡，常用的方式是经纤维环注射，但是咖啡酸或者其它小分子体内注射后将被快速代谢，无法达到长期治疗的作用。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题本发明制备了一种咖啡酸或其衍生物的金属螯合物纳米颗粒，其可滞留在脊椎病变部位，长期发挥抗氧化作用。本发明纳米颗粒对于 dpph
·
自由基有明显的清除作用。对于双氧水引起的髓核细胞氧化损伤具有明显的ros清除作用和凋亡逆转作用。
7.本发明采用以下技术方案实现本发明的目的：
8.一种咖啡酸或其衍生物的金属螯合物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
9.s1将咖啡酸或其衍生物与金属氯化物溶于水相溶液中，搅拌至完全溶解后，调节溶液的ph值至中性或碱性；
10.s2将步骤s1所得溶液反应一段时间后，洗涤，将所得反应产物冻干，所得黑褐色粉末，即为咖啡酸金属螯合物纳米颗粒。
11.本发明将咖啡酸或其衍生物与金属离子进行鳌合获得咖啡酸或其衍生物的金属螯合物纳米颗粒，所述纳米颗粒具有清除自由与细胞内活性氧的作用，可以逆转氧化应激诱导的细胞凋亡，且可滞留在脊椎病变部位，长期发挥抗氧化作用。
12.优选地，所述咖啡酸或其衍生物与金属氯化物的摩尔比为：0.01～100。
13.优选地，所述金属氯化物包括：氯化镁、氯化钙、氯化铁、氯化铜、氯化锌或氯化钴中的一种。
14.优选地，所述水相溶液为乙醇与水的混合溶液，二者的体积比为：1:1。
15.优选地，所述调节溶液的ph值至5～12。
16.优选地，所述洗涤的具体步骤为：先用去离子水洗涤，再用酒精洗涤。
17.本发明还提供一种如上述制备方法制备获得的咖啡酸或其衍生物的金属螯合物纳米颗粒。
18.本发明还提供所述纳米颗粒在作为抗氧化剂中的应用。
19.优选地，所述抗氧化剂用于降低细胞内活性氧水平。本发明的纳米颗粒能显著清除髓核细胞氧化损伤的ros。
20.本发明还提供所述纳米颗粒在作为抵抗细胞凋亡的制剂中的应用。本发明的纳米颗粒对髓核细胞凋亡有显著的逆转作用。
21.本发明的有益效果为：本发明将咖啡酸或其衍生物与金属离子进行鳌合获得咖啡酸或其衍生物的金属螯合物纳米颗粒，不同金属离子的与咖啡酸结合获得具有不同功能的金属螯合物纳米颗粒，如含有mg
2+
的纳米颗粒不仅可以促成骨，减少细胞钙化具有清除自由与细胞内活性氧的作用，还可以逆转氧化应激诱导的细胞凋亡，延长其在体内半衰期；含有cu
2+
的纳米颗粒可以促进内皮细胞修复，促进伤口愈合，抗菌；含有mn
2+
的纳米颗粒可以激活免疫系统。可见，本发明的纳米颗粒不但能维持咖啡酸的抗氧化活性，还能通过金属离子加入产生其它生物学活性。另外，本发明的制备方法工艺简单，易于操作。
附图说明
22.图1为咖啡酸镁透射电子显微镜图；
23.图2为咖啡酸镁对dpph自由基清除率示意图；
24.图3为咖啡酸镁抗氧化性的稳定性试验结果图；
25.图4为咖啡酸镁抑制髓核细胞氧化应激诱导的凋亡。
具体实施方式
26.为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
27.实施例1
28.本实施例提供一种咖啡酸镁制备的制备方案，具体步骤如下：
29.a将90mg咖啡酸溶于50ml乙醇和水的混合溶液中(体积比1：1)，搅拌至完全溶解，标记为溶液a。
30.b将105mg六水合氯化镁溶于上述a溶液中，搅拌至完全溶解，标记为溶液b。
31.c将b溶液ph值调节为10.1，标记为溶液c。
32.d溶液c在4℃水浴下反应20分钟，之后去离子水洗涤2次，酒精洗涤2 次，冷冻干燥机冻干后得到的黑褐色产物，命名为咖啡酸镁纳米颗粒。
33.实施例2
34.本实施例提供一种咖啡酸钙制备的制备方案，具体步骤如下：
35.a将90mg咖啡酸溶于50ml乙醇和水的混合溶液中(体积比1:1)，搅拌至完全溶解，标记为溶液a。
36.b将165mg无水氯化钙溶于上述a溶液中，搅拌至完全溶解，标记为溶液 b。
37.c将b溶液ph值调节为10.1，标记为溶液c。
38.d溶液c在4℃水浴下反应20分钟，之后去离子水洗涤2次，酒精洗涤2 次，冷冻干燥机冻干后得到黑褐色产物，命名为咖啡酸钙纳米颗粒。
39.实施例3
40.本实施例提供一种咖啡酸铁制备的制备方案，具体步骤如下：
41.a将90mg咖啡酸溶于50ml乙醇和水的混合溶液中(体积比1：1)，搅拌至完全溶解，标记为溶液a。
42.b将165mg无水氯化铁溶于上述a溶液中，搅拌至完全溶解，标记为溶液 b。
43.c将b溶液ph值调节为10.1，标记为溶液c。
44.d溶液c在4℃水浴下反应20分钟，之后去离子水洗涤2次，酒精洗涤2 次，冷冻干燥机冻干后得到黑褐色产物，命名为咖啡酸铁纳米颗粒。
45.实施例4
46.本实施例提供一种咖啡酸铜制备的制备方案，具体步骤如下：
47.a将90mg咖啡酸溶于50ml乙醇和水的混合溶液中(体积比1：1)，搅拌至完全溶解，标记为溶液a。
48.b将165mg无水氯化铜溶于上述a溶液中，搅拌至完全溶解，标记为溶液 b。
49.c将b溶液ph值调节为10.1，标记为溶液c。
50.d溶液c在4℃水浴下反应20分钟，之后去离子水洗涤2次，酒精洗涤2 次，冷冻干燥机冻干后得到黑褐色产物，命名为咖啡酸铜纳米颗粒。
51.实施例5
52.本实施例提供一种咖啡酸锌制备的制备方案，具体步骤如下：
53.a将90mg咖啡酸溶于50ml乙醇和水的混合溶液中(体积比1：1)，搅拌至完全溶解，标记为溶液a。
54.b将165mg无水氯化锌溶于上述a溶液中，搅拌至完全溶解，标记为溶液 b。
55.c将b溶液ph值调节为10.1，标记为溶液c。
56.d溶液c在4℃水浴下反应20分钟，之后去离子水洗涤2次，酒精洗涤2 次，冷冻干燥
机冻干后得到黑褐色产物，命名为咖啡酸锌纳米颗粒。
57.实施例6
58.本实施例提供一种咖啡酸钴制备的制备方案，具体步骤如下：
59.a将90mg咖啡酸溶于50ml乙醇和水的混合溶液中(体积比1：1)，搅拌至完全溶解，标记为溶液a。
60.b将165mg无水氯化钴溶于上述a溶液中，搅拌至完全溶解，标记为溶液 b。
61.c将b溶液ph值调节为10.1，标记为溶液c。
62.d溶液c在4℃水浴下反应20分钟，之后去离子水洗涤2次，酒精洗涤2 次，冷冻干燥机冻干后得到黑褐色产物，命名为咖啡酸钴纳米颗粒。
63.实施例7
64.本实施例提供一种咖啡酸衍生物镁制备的制备方案，具体步骤如下：
65.a将90mg咖啡酸乙酯溶于ph11的水溶液中，搅拌至完全溶解，标记为溶液a。
66.b将105mg六水合氯化镁溶于上述a溶液中，搅拌至完全溶解，标记为溶液b。
67.c将b溶液ph值调节为10.1，标记为溶液c。
68.d溶液c在4℃水浴下反应20分钟，之后去离子水洗涤2次，酒精洗涤2 次，冷冻干燥机冻干后得到黑褐色产物，命名为咖啡酸衍生物镁纳米颗粒。
69.效果验证
70.试验一：咖啡酸镁清除dpph自由基实验
71.将2,2-联苯基-1-苦基肼基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，简称为dpph
·
) 溶于无水乙醇中，完全溶解配成0.1mg/ldpph
·
乙醇溶液。将不同浓度的咖啡酸镁溶液加入0.1mg/ldpph
·
乙醇溶液中，反应10分钟后，用uv-vis吸收光谱仪检测混合溶液在517nm处的吸收值。计算不同浓度咖啡酸镁对dpph
·
的清除率。
72.结果如图2所示，本发明的咖啡酸镁降低了溶液中的dpph
·
具有较强的抗氧化性。
73.试验二：咖啡酸镁抗氧化性的稳定性试验
74.将咖啡酸与咖啡酸镁分散在pbs溶液中。将2,2-联苯基-1-苦基肼基 (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，简称为dpph
·
)溶于无水乙醇中，完全溶解配成0.1mg/ldpph
·
乙醇溶液。将咖啡酸与咖啡酸镁分别加入0.1mg/ldpph
·
溶液中，以0h的自由基清除率标记为100％。将咖啡酸与咖啡酸镁的pbs在37
°
下放置不同时间，再测其dpph
·
自由基清除率。
75.结果如图3所示，本发明的咖啡酸镁纳米颗粒的抗氧化性能更加稳定，具有更持久的抗氧化性能。
76.试验三：咖啡酸镁纳米颗粒抑制髓核细胞氧化应激诱导的凋亡实验
77.①
构建髓核细胞体外氧化应激模型
78.a原代细胞分离和培养
79.原代髓核细胞从大鼠椎间盘中获取，具体方法如下：在无菌条件下，将椎间盘纤维环以手术刀片刺破，将半透明胶冻状髓核组织挑出置于pbs中， 1200rpm离心3min，清除多余组织，同时加入2％ii型胶原酶消化液3ml放置于37℃恒温摇床上消化30min。消化后的组织加入6ml含有10％fbs的 dmem/f12培养液中终止消化。40μm滤网过滤消化悬液，1200rpm离心3min。弃上清，重新加入5ml含有10％fbs的dmem/f12培养液重悬后加入到t25细胞培养
瓶中，在37℃5％co2的培养箱中培养。在细胞密度达到80％时进行1:3 传代培养，p4细胞用于后续实验。
80.b对处于对数增长期的细胞加入1ml 0.25％胰蛋白酶于37℃5％co2的培养箱中消化1min，并用含有10％fbs的dmem/f12培养液终止消化，细胞悬液 1200rpm离心3min后用10％fbs的dmem/f12培养液重悬并计数。以每孔10k 细胞种于96孔培养板中，于37℃5％co2的培养箱中静置过夜。待细胞贴壁后，分别加入100μl的含0μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm h2o2的 dmem/f12培养液。培养4h后吸取并丢弃培养基后用pbs清洗3次，按照说明书，加入混有10％cck8的dmem/f12培养液于37℃5％co2的培养箱中孵育 2h后在酶标仪上用450nm吸光度测得每组吸光度值。
81.②
咖啡酸镁纳米颗粒抑制髓核细胞氧化应激诱导
82.对处于对数增长期的细胞加入1ml 0.25％胰蛋白酶于37℃5％co2的培养箱中消化1min，并用含有10％fbs的dmem/f12培养液终止消化，细胞悬液 1200rpm离心3min后用10％fbs的dmem/f12培养液重悬并计数。以每孔10k 细胞种于96孔培养板中，于37℃5％co2的培养箱中静置过夜。待细胞贴壁后，按照表1分别加入100μl相应的培养液。培养4h后吸取并丢弃培养基后用pbs 清洗3次，按照说明书，加入混有10％cck8的dmem/f12培养液于37℃5％co2的培养箱中孵育2h后在酶标仪上用450nm吸光度测得每组吸光度值。试验分组如表1所示：
83.表1：试验分组
84.组别1234567150μm h2o
2-++++++咖啡酸镁纳米颗粒(mg/l)-52.51.250.6250.3125-85.③
咖啡酸镁纳米颗粒抑制髓核细胞氧化应激诱导的凋亡检测
86.对处于对数增长期的细胞加入1ml 0.25％胰蛋白酶于37℃5％co2的培养箱中消化1min，并用含有10％fbs的dmem/f12培养液终止消化，细胞悬液1200rpm离心3min后用10％fbs的dmem/f12培养液重悬并计数。以每孔100k 细胞种于24孔培养板中，于37℃5％co2的培养箱中静置过夜。待细胞贴壁后，按照表1分别加入1000μl相应的培养液。培养4h后吸取并丢弃培养基后用pbs 清洗3次，用0.25％胰蛋白酶消化细胞后获取细胞悬液，加入10％fbs的 dmem/f12培养液终止消化后，1200rpm离心3min后加入annexin v-fitc/pi 反应液，室温孵育15min后，使用图像流式检测系统进行检测。
87.④
咖啡酸镁纳米颗粒抑制髓核细胞氧化应激诱导
88.对处于对数增长期的细胞加入1ml 0.25％胰蛋白酶于37℃5％co2的培养箱中消化1min，并用含有10％fbs的dmem/f12培养液终止消化，细胞悬液 1200rpm离心3min后用10％fbs的dmem/f12培养液重悬并计数。以每孔100k 细胞种于24孔培养板中，于37℃5％co2的培养箱中静置过夜。待细胞贴壁后，按照表1分别加入1000μl相应的培养液。培养4h后吸取并丢弃培养基后用pbs 清洗3次，用0.25％胰蛋白酶消化细胞后获取细胞悬液，加入10％fbs的 dmem/f12培养液终止消化后，1200rpm离心3min后加入500μl按1：1000稀释好的dcfh-da工作液重悬，37℃细胞培养箱中孵育30min，每隔10min取出轻轻吹打重悬。孵育结束后用无血清培养基洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的活性氧荧光探针(dcfh-da)，再用适当体积无血清培养基重悬后使用图像流式检测系统进行检测。
89.结果如图4所示，本发明的咖啡酸镁能够降低h2o2对细胞的损伤，能够防止由h2o2诱导的细胞凋亡。
90.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。