1.本发明涉及一种中药组合物及其制备方法、套装药盒、应用。


背景技术：

2.高尿酸血症是指在正常嘌呤饮食情况下并且非同日内2次对空腹血清尿酸水平进行测定，男性血清尿酸水平高于420μmol/l(7mg/dl)、女性高于357μmol/l(6mg/dl)。目前高尿酸血症治疗主要以化学药为主，根据作用机制以及作用靶点可以为三类：抑制尿酸合成药物代表性药物别嘌醇，但别嘌醇容易引起较为严重的不良反应；促进尿酸排泄药物代表性药物苯溴马隆、丙磺舒常伴有肝损伤、皮疹等不良反应；促进尿酸分解药物(如拉布立酶)易引起过敏反应产生抗体从而失效(马金魁,张宏斌.高尿酸血症及治疗药物的研究进展[j].广东医学,2018,7(39):262-267)。
[0003]
苯溴马隆作为促进尿酸排泄药物，其肝毒性越来越受到人们关注。据报道，苯溴马隆诱导的肝毒性与其分别被细胞色素p450 3a4(cyp3a4)或2c9(cyp2c9)转化的1'或6-羟基苯溴马隆代谢产物有关(kobayashi k,kajiwara e,ishikawa m,et al.identification of cyp isozymes involved in benzbromarone metabolism in human liver microsomes[j].biopharmaceutics&drug disposition,2012,33(8):466-473.kobayashi k,kajiwara e,ishikawa m,et al.cytotoxic effects of benzbromarone and its 1'-hydroxy metabolite in human hepatocarcinoma flc4cells cultured on micro-space cell culture plates[j].drug metabolism and pharmacokinetics,2012,28(3):265-268.)。这两种代谢产物可能在肝微粒体中进一步被氧化成二羟基产物，进而与谷胱甘肽形成加合物，影响肝细胞线粒体功能和结构，从而产生肝毒性(mcdonald m g,rettie a e.sequential metabolism and bioactivation of the hepatotoxin benzbromarone:formation of glutathione adducts from a catechol intermediate[j].chemical research in toxicology,2007,20(12):1833-1842.)。
[0004]
鼠麴草，(gnaphalium affine，又称鼠曲草、佛耳草、白艾)，为菊科鼠麴草属植物，味微甘、性平，有祛风化痰泻浊之效。现有文献公开了95％乙醇提取物能够有效治疗高尿酸血症和急性痛风性关节炎(zhang h j,li l n,zhou j,et al.effects of gnaphalium affine d.don on hyperuricemia and acute gouty arthritis[j].journal of ethnopharmacology,2017,203:304-311.)；另外，60％乙醇提取物也能够有效治疗高尿酸血症(cn101925361a，wo2009093584ja)。然而，现有公开和报道的降尿酸鼠麴草提取物并非理想药物的提取物，其存在活性成分含量低的问题，无法满足现有法规对药物的要求(活性成分质量分数占比需高于50％)。
[0005]
现有技术中，有苯溴马隆与中药复方联用的方法，除了增加作用机制提高降尿酸药效之外，它们的联用在肾保护方面具有更好的效果。然而，现有技术中仍未有一种中药组合物，其能够在降低苯溴马隆用量的情况下，保证药效并降低苯溴马隆的肝毒性。


技术实现要素：

[0006]
本发明为了解决现有技术中鼠麴草提取物活性成分含量低，且现有技术中仍未有一种中药组合物，其能够在降低苯溴马隆用量的情况下，保证药效并降低苯溴马隆的肝毒性，而提供了一种中药组合物及其制备方法、套装药盒、应用。本发明由鼠鞠草提取得到的中药组合物的活性成分高(》50wt％)，对于慢性高尿酸血症和高尿酸血症肾病治疗效果优异。
[0007]
本发明提供了一种中药组合物的制备方法，其包含如下步骤：
[0008]
s1.将鼠麴草与乙醇水溶液混合，提取得提取液；
[0009]
其中，所述乙醇水溶液为体积百分含量为50％～80％的乙醇水溶液；
[0010]
s2.浓缩所述提取液得浓缩液；
[0011]
s3.用石油醚萃取所述浓缩液，得到水相一；用乙酸乙酯萃取所述水相一，得到水相二和乙酸乙酯相；用水饱和正丁醇萃取所述水相二，得到水饱和正丁醇相；收集所述乙酸乙酯相和所述水饱和正丁醇相，即可。
[0012]
s1中，所述乙醇水溶液可为本领域常规的体积百分含量为50％～80％的乙醇水溶液，较佳地为体积百分含量为60％的乙醇水溶液。
[0013]
s1中，所述鼠麴草与所述乙醇水溶液的质量体积比可为常规植化提取中的原料与溶剂的用量比，较佳地为1:10～1:20kg/l，更佳地为1:10～1:15kg/l。
[0014]
s1中，所述鼠麴草可为本领域常规的鼠麴草，较佳地为阴干后的鼠麴草。本领域中，所述阴干一般指将药材放置于室内、室外或大棚的阴凉处，利用流动的空气，吹去水分而达到干燥的目的。本发明中所述的“阴干后的鼠麴草”一般指水分的质量含量为3～5％的鼠麴草，例如约为4％。
[0015]
s1中，所述提取的操作和条件可为本领域常规。
[0016]
其中，所述提取的温度较佳地为50～100℃，更佳地为70～100℃，进一步更佳地为70～80℃。
[0017]
其中，所述提取的次数可以参照本领域的常规选择，较佳地为2～4次，更佳地为3～4次。
[0018]
其中，所述提取中，单次提取的时间较佳地为1～2h。
[0019]
s2中，所述浓缩的操作和条件可为本领域常规，一般为减压浓缩。
[0020]
其中，所述减压浓缩的温度较佳地为50～70℃，例如为60℃。
[0021]
s2中，s1中所述鼠麴草与s2中所述浓缩液的质量体积比较佳地为1:0.5～1:2kg/l，更佳地为1:0.5～1:1kg/l。
[0022]
s3中，所述石油醚的用量可为本领域常规，较佳地，所述浓缩液与所述石油醚的体积比为1:1～1:2。
[0023]
s3中，所述石油醚萃取的次数可为本领域常规，较佳地为2～4次，更佳地为3次。
[0024]
s3中，所述石油醚较佳地为沸程为60～90℃的石油醚。
[0025]
s3中，所述乙酸乙酯的用量可为本领域常规，较佳地，所述水相一与所述乙酸乙酯的体积比为1:1～1:2。
[0026]
s3中，所述乙酸乙酯萃取的次数可为本领域常规，较佳地为2～4次，更佳地为3次。
[0027]
s3中，所述水饱和正丁醇可为本领域常规使用的水饱和正丁醇，配置方法一般为
室温下(0～40℃)将正丁醇和蒸馏水混合(混合体积比为1:1)，振摇，混匀，放置过夜，得到的混合液分层，上层为水饱和正丁醇。
[0028]
s3中，所述水饱和正丁醇的用量可为本领域常规，较佳地，所述水相二与所述水饱和正丁醇的体积比为1:1～1:2。
[0029]
s3中，所述水饱和正丁醇萃取的次数可为本领域常规，较佳地为2～4次，更佳地为3次。
[0030]
本发明中，所述制备方法还包括：s4.浓缩、干燥所述乙酸乙酯相和所述水饱和正丁醇相的混合物；或者分别将所述乙酸乙酯相和所述水饱和正丁醇相进行浓缩、干燥后混合。
[0031]
s4中，所述浓缩较佳地为减压浓缩，一般为减压浓缩至干即可。
[0032]
其中，所述减压浓缩的温度为40～80℃。
[0033]
本发明还提供了一种中药组合物，其由如前所述的中药组合物的制备方法制得。
[0034]
较佳地，所述中药组合物的活性成分的含量为50％以上，更佳地为54.12％～57.81％；其中所述百分比均为质量百分比。
[0035]
较佳地，所述中药组合物的活性成分包括：芹菜素、木犀草素、木犀草素-4'-o-葡萄糖苷、高姜良素、槲皮素、咖啡酸、咖啡酸甲酯、gnaphaffine a、3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸甲酯、3,4,5-三-o-咖啡酰奎宁酸、1,4-二-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯、1,3,5-三-o-咖啡酰奎宁酸、1,3,4-三-o-咖啡酰奎宁酸、3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸、3,4-二-o-咖啡酰奎宁酸、1,4-二-o-咖啡酰基奎宁酸、1-o-咖啡酰基葡萄糖、4,6,4'-三羟基-2-甲氧基查尔酮、4,6,4'-三羟基-2-甲氧基查尔酮-4-o-葡萄糖苷(gnaphalin，鼠麴草苷)、绿原酸、5-o-咖啡酰奎宁酸和咖啡酸乙酯的一种或多种。
[0036]
更佳地，所述中药组合物的活性成分包括：0.1％～5.5％的芹菜素、0.5％～9.8％的木犀草素、0.2％～10.0％的木犀草素-4'-o-葡萄糖苷、0.01％～2.2％的高姜良素、0.02％～1.4％的槲皮素、0.8％～3.9％的咖啡酸、0.1％～13.0％的咖啡酸甲酯、0.1％～3.3％的gnaphaffine a、0.01％～0.8％的3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸甲酯、0.2％～10.4％的3,4,5-三-o-咖啡酰奎宁酸、0.01％～0.5％的1,4-二-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯、0.03％～9.5％的1,3,5-三-o-咖啡酰奎宁酸、0.2％～12.8％的1,3,4-三-o-咖啡酰奎宁酸、0.3％～6.5％的3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸、0.1％～5.2％的3,4-二-o-咖啡酰奎宁酸、0.1％～7.6％的1,4-二-o-咖啡酰基奎宁酸、1.5％～3.7％的1-o-咖啡酰基葡萄糖、0.06％～5.2％的4,6,4'-三羟基-2-甲氧基查尔酮、0.1％～3.8％的4,6,4'-三羟基-2-甲氧基查尔酮-4-o-葡萄糖苷(gnaphalin，鼠麴草苷)、0.2％～2.9％的绿原酸、0.4％～4.1％的5-o-咖啡酰奎宁酸和0.1％～1.5％的咖啡酸乙酯；其中所述百分比均为质量百分比。
[0037]
本发明还提供了一种套装药盒，其包含药盒a和药盒b，所述药盒a为如前所述的中药组合物，所述药盒b为苯溴马隆。
[0038]
所述药盒a和所述药盒b可以先使用所述药盒a再使用所述药盒b，还可以先使用所述药盒b再使用所述药盒a，可以根据具体应用时的实际需求而定。
[0039]
较佳地，所述药盒a与药盒b的质量比大于等于9:1，更佳地大于48:1，进一步更佳地为100:1～200:1。
[0040]
本发明还提供了一种如前所述的中药组合物或如前所述的套装药盒在制备治疗
慢性高尿酸血症或者高尿酸血症肾病的药物中的应用。
[0041]
较佳地，当所述中药组合物在单独使用时，其日服用剂量为71～143mg/kg(即于70kg成人而言，为5～10g)。
[0042]
其中，较佳地，当所述套装药盒在使用时，所述药盒b的日服用剂量为0.35～0.72mg/kg(即于70kg成人而言，为25～50mg)。
[0043]
其中，较佳地，当所述套装药盒在使用时，所述药盒a的日服用剂量为35～143mg/kg(即于70kg成人而言，为2.5～5g)。
[0044]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0045]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0046]
本发明的积极进步效果在于：
[0047]
本发明由鼠鞠草提取得到的中药组合物的活性成分高，各成分之间产生相互作用，对于慢性高尿酸血症和高尿酸血症肾病治疗效果优异，提高了活性化合物的生物利用度，药物的作用时间长。且鼠麴草野生资源丰富、药材成本低廉，开发潜力巨大。
[0048]
本发明的中药组合物可与苯溴马隆联用，药效(显著的降尿酸和肾保护作用)稳定。与单独使用苯溴马隆相比，药物的联用不仅对于慢性高尿酸血症和高尿酸血症肾病治疗效果增强，更显著地降低尿酸水平；并且显著抑制苯溴马隆对肝脏造成的损伤，具有减毒作用。药物联用的情况下，可降低苯溴马隆剂量，在维持甚至提高药效的情况下提高安全性。
附图说明
[0049]
图1为实施例1～3中药组合物灌胃给药对于慢性高尿酸血症肾病模型大鼠血清中血尿酸水平的影响。与正常组动物比较：***p《0.001，有极其显著的统计学差异；与高尿酸血症模型组动物比较：###p《0.001，##p《0.01，有极其显著的统计学差异。
[0050]
图2为实施例1～3中药组合物灌胃给药对于慢性高尿酸血症肾病模型大鼠血清中肌酐水平的影响。与正常组动物比较：***p《0.001，**p《0.01，有极其显著的统计学差异；与高尿酸血症模型组动物比较：##p《0.01，有极其显著的统计学差异，#p《0.05，有显著的统计学差异。
[0051]
图3为实施例1～3中药组合物灌胃给药对于慢性高尿酸血症肾病模型大鼠血清中尿素氮水平的影响。与正常组动物比较：***p《0.001，**p《0.01，有极其显著的统计学差异；与高尿酸血症模型组动物比较：##p《0.01，有极其显著的统计学差异。
[0052]
图4为实施例1～3中药组合物联合苯溴马隆对于血清ast水平的影响。与正常组动物比较：***p《0.001，**p《0.01，有极其显著的统计学差异，*p《0.05，有显著的统计学差异；与肝损伤组(苯溴马隆给药组)动物比较：###p《0.01，##p《0.01，有极其显著的统计学差异，#p《0.05，有显著的统计学差异。
[0053]
图5为实施例1～3中药组合物联合苯溴马隆对于血清alt水平的影响。与正常组动物比较：***p《0.001，**p《0.01，有极其显著的统计学差异；与肝损伤组(苯溴马隆给药组)动物比较：###p《0.01，##p《0.01，有极其显著的统计学差异，#p《0.05，有显著的统计学差异。
[0054]
图6为实施例1～3中药组合物联合苯溴马隆对于血清尿酸水平的影响。与正常组动物比较：***p《0.001；与高尿酸血症模型组动物比较：###p《0.01，##p《0.01，有极其显著的统计学差异，#p《0.05，有显著的统计学差异。
[0055]
图7为实施例1的hplc色谱图。
具体实施方式
[0056]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0057]
以下实施例中，在制备得到中药组合物后，按照如下方法进行测试得到活性成分及其含量：
[0058]
(1)精密称取芹菜素、木犀草素、木犀草素-4'-o-葡萄糖苷、高姜良素、槲皮素、咖啡酸、咖啡酸甲酯、gnaphaffine a、3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸甲酯、3,4,5-三-o-咖啡酰奎宁酸、1,4-二-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯、1,3,5-三-o-咖啡酰奎宁酸、1,3,4-三-o-咖啡酰奎宁酸、3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、1,4-二-o-咖啡酰基奎宁酸、1-o-咖啡酰基葡萄糖、4,6,4'-三羟基-2-甲氧基查尔酮、4,6,4'-三羟基-2-甲氧基查尔酮-4-o-葡萄糖苷(gnaphalin，鼠麴草苷)、绿原酸、5-o-咖啡酰基奎宁酸、咖啡酸乙酯对照品适量，经甲醇配制成标准品溶液。
[0059]
(2)精密称取约30.0mg中药组合物，用甲醇超声溶解，放凉至室温后定容至10ml，得供试品溶液。采用高效液相色谱法对供试品溶液进行检测，色谱条件如下：
[0060]
uflc-dad检测；泵：岛津lc-20ad xr；自动进样器：sil-20a xr；检测器：spd-m20a；柱温箱：cto-20a；
[0061]
色谱柱：安捷伦zorbax rrhd eclipse xdb-c18,2.1
×
150mm,1.8μm；
[0062]
流动相a：h2o+0.2％甲酸(体积百分比)流动相b；b相：乙腈；
[0063]
流速：0.3ml/min；柱温：40℃；pda：200-400nm；波长280nm检测；进样体积：2μl；
[0064]
梯度洗脱，梯度洗脱程序如下(％表示体积百分比)：
[0065]
时间流动相a流动相b0-5min88％12％5-10min88％-85％12-15％10-15min85％15％15-20min85％-80％15-20％20-30min80％-70％20-30％30-40min70％-0％30-100％40-45min0％100％45-53min88％12％
[0066]
(3)将测试得到的色谱图与标准品溶液测得的色谱图对照。
[0067]
以实施例1为例，如图7所示。其中，图7中序号1-22对应的成分如下：
[0068]
芹菜素(1)、木犀草素(2)、木犀草素-4'-o-葡萄糖苷(3)、高姜良素(4)、槲皮素(5)、咖啡酸(6)、咖啡酸甲酯(7)、gnaphaffine a(8)、3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸甲酯(9)、3,
4,5-三-o-咖啡酰奎宁酸(10)、1,4-二-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯(11)、1,3,5-三-o-咖啡酰奎宁酸(12)、1,3,4-三-o-咖啡酰奎宁酸(13)、3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸(14)、3,4-二咖啡酰奎宁酸(15)、1,4-二-o-咖啡酰基奎宁酸(16)、1-o-咖啡酰基葡萄糖(17)、4,6,4'-三羟基-2-甲氧基查尔酮(18)、4,6,4'-三羟基-2-甲氧基查尔酮-4-o-葡萄糖苷(gnaphalin，鼠麴草苷)(19)、绿原酸(20)、5-o-咖啡酰基奎宁酸(21)、咖啡酸乙酯(22)。
[0069]
实施例1
[0070]
(1)将阴干后鼠麴草(产地一：浙江义乌上溪镇)切段，称取5kg，与体积百分含量为60％的乙醇水溶液75l(1:15，kg/l)比例混合，加热至100℃，回流提取4次，每次2h，合并提取液。
[0071]
(2)提取液减压浓缩(60℃)至5l(药材：浓缩液的质量体积比为1:1kg/l)，得浓缩液。
[0072]
(3)在浓缩液中加入沸程为60～90℃石油醚萃取3次，每次浓缩液与石油醚的体积比为1:1，弃掉石油醚相，得水相一(5l)。在水相一中加入乙酸乙酯，萃取3次，每次水相一与乙酸乙酯的体积比为1:1，萃取之后得水相二(5l)。在水相二中加入水饱和正丁醇，萃取3次，每次水相二与水饱和正丁醇的体积比为1:1。
[0073]
(4)合并上述乙酸乙酯相和水饱和正丁醇相，减压浓缩(60℃)至干，得实施例1的中药组合物228.7g。
[0074]
实施例1的中药组合物的活性成分如下(下述百分比均为质量百分比)：
[0075]
芹菜素0.2％、木犀草素0.8％、木犀草素-4'-o-葡萄糖苷5.8％、高姜良素0.01％、槲皮素0.02％、咖啡酸2.0％、咖啡酸甲酯13.0％、gnaphaffine a3.3％、3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸甲酯0.8％、3,4,5-三-o-咖啡酰奎宁酸10.4％、1,4-二-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯0.3％、1,3,5-三-o-咖啡酰奎宁酸0.03％、1,3,4-三-o-咖啡酰奎宁酸0.2％、3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸0.3％、3,4-二-o-咖啡酰奎宁酸3.6％、1,4-二-o-咖啡酰基奎宁酸2.8％、1-o-咖啡酰基葡萄糖1.5％、4,6,4'-三羟基-2-甲氧基查尔酮0.06％、4,6,4'-三羟基-2-甲氧基查尔酮-4-o-葡萄糖苷(gnaphalin，鼠麴草苷)3.8％、绿原酸2.9％、5-o-咖啡酰基奎宁酸2.2％、咖啡酸乙酯0.1％。活性成分总含量为54.12％。
[0076]
实施例2
[0077]
(1)阴干后鼠麴草(产地二：浙江衢州后溪镇)切段，称取0.6kg，与体积百分含量为50％乙醇水溶液6l(1:10，kg/l)比例混合，加热至100℃，回流提取3次，每次2h，合并提取液。
[0078]
(2)提取液减压浓缩(70℃)至1.2l(药材：浓缩液的质量体积比为1:2kg/l)，得浓缩液。
[0079]
(3)在浓缩液中加入沸程为60～90℃石油醚萃取2次，每次浓缩液与石油醚体积比1:2，弃掉石油醚相，得水相一(1.2l)。在水相一中加入乙酸乙酯，萃取2次，每次水相一与乙酸乙酯的体积比为1：2，萃取之后得水相二(1.2l)。在水相二中加入水饱和正丁醇，萃取2次，每次水相二与水饱和正丁醇的体积比1:2.
[0080]
(4)合并上述乙酸乙酯相和水饱和正丁醇相，减压浓缩(60℃)至干，得鼠麴草有效物质富集物23.9g。
[0081]
实施例2的中药组合物的活性成分如下(下述百分比均为质量百分比)：
[0082]
芹菜素0.1％、木犀草素9.8％、木犀草素-4'-o-葡萄糖苷0.2％、高姜良素0.6％、槲皮素1.4％、咖啡酸0.8％、咖啡酸甲酯0.8％、gnaphaffine a1.8％、3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸甲酯0.1％、3,4,5-三-o-咖啡酰奎宁酸1.2％、1,4-二-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯0.01％、1,3,5-三-o-咖啡酰奎宁酸0.9％、1,3,4-三-o-咖啡酰奎宁酸12.8％、3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸0.8％、3,4-二-o-咖啡酰奎宁酸5.2％、1,4-二-o-咖啡酰基奎宁酸7.6％、1-o-咖啡酰基葡萄糖3.7％、4,6,4'-三羟基-2-甲氧基查尔酮5.2％、4,6,4'-三羟基-2-甲氧基查尔酮-4-o-葡萄糖苷(gnaphalin，鼠麴草苷)0.1％、绿原酸0.2％、5-o-咖啡酰奎宁酸4.1％、咖啡酸乙酯0.4％。活性成分总含量为57.81％。
[0083]
实施例3
[0084]
(1)阴干后鼠麴草(产地二：浙江衢州后溪镇)切段，称取2kg，与体积百分含量为80％乙醇水溶液40l(1:20，kg/l)比例混合，加热至100℃，回流提取2次，每次2h，合并提取液。
[0085]
(2)提取液减压浓缩(50℃)至1l(药材：浓缩液的质量体积比为1:0.5kg/l)，得浓缩液。
[0086]
(3)在浓缩液中加入沸程为60～90℃石油醚萃取4次，每次浓缩液与石油醚的体积比为1:1，弃掉石油醚相，得水相一(1l)。在水相一中加入乙酸乙酯，萃取4次，每次水相一与乙酸乙酯的体积比为1:1，萃取之后得水相二(1l)。在水相二中加入水饱和正丁醇，萃取4次，每次水相二与水饱和正丁醇的体积比为1:1。
[0087]
(4)合并上述乙酸乙酯相和水饱和正丁醇相，减压浓缩(60℃)至干，得鼠麴草有效物质富集物74.6g。
[0088]
实施例3的中药组合物的活性成分如下(下述百分比均为质量百分比)：
[0089]
芹菜素5.5％、木犀草素0.5％、木犀草素-4'-o-葡萄糖苷10.0％、高姜良素2.2％、槲皮素0.1％、咖啡酸3.9％、咖啡酸甲酯0.1％、gnaphaffine a0.1％、3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸甲酯0.01％、3,4,5-三-o-咖啡酰奎宁酸0.2％、1,4-二-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯0.5％、1,3,5-三-o-咖啡酰奎宁酸9.5％、1,3,4-三-o-咖啡酰奎宁酸8.4％、3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸6.5％、3,4-二-o-咖啡酰奎宁酸0.1％、1,4-二-o-咖啡酰基奎宁酸0.1％、1-o-咖啡酰基葡萄糖3.5％、4,6,4'-三羟基-2-甲氧基查尔酮1.1％、4,6,4'-三羟基-2-甲氧基查尔酮-4-o-葡萄糖苷(gnaphalin，鼠麴草苷)0.1％、绿原酸2.6％、5-o-咖啡酰奎宁酸0.4％、咖啡酸乙酯1.5％。活性成分总含量为56.91％。
[0090]
效果实施例1
[0091]
本发明效果实施例1中，采用的sd大鼠(200
±
20g，购自上海西普尔-必凯试验动物中心)48只，饲养于中国医药工业研究总院实验动物中心，饲养标准如下：室温22
±
2℃，相对湿度为50
±
10％，12h昼夜交替，给予标准实验饲料和水。受试前12h禁食，不禁水。所有动物实验符合实验室动物照料和使用指导原则，并经由中国医药工业研究总院动物伦理委员会批准同意(实验动物生产许可证号：scxk(沪)2019-0006，动物质量合格证号20190006006257)。
[0092]
一、实验方法
[0093]
(1)高尿酸血症肾病大鼠模型及给药方式
[0094]
本领域技术人员知晓，70kg成人剂量5g对应大鼠剂量450mg/kg。
[0095]
sd大鼠48只，随机分组，每组8只，分别为空白(nc)组，高尿酸血症肾病模型(hn)组，苯溴马隆10mg/kg(bbr)组，实施例1(450mg/kg)组，实施例2(450mg/kg)组，实施例3(450mg/kg)组。各组给药体积为0.1ml/10g。灌胃氧嗪酸钾(1.5g/kg)和腺嘌呤(0.1g/kg)制造高尿酸血症肾病模型，造模3天后，各组连续给药，正常组灌胃同等体积0.5％cmc-na，造模后每隔7天(实验第7、14、21、28天)，最后一次灌胃给药后1小时眼眶采血。分离血清，-20℃保存。
[0096]
(2)中药组合物对于血清尿酸水平的影响
[0097]
实验前，先将血清样品置于4℃下解冻30min，精密吸取血清50ul，加入100ul甲醇溶液沉淀蛋白，涡旋1min，在4℃下，14000rpm离心10min，取上清液100ul以待分析。
[0098]
血清尿酸水平测定采用hplc方法进行测定；流动相a为0.5％乙酸水；流动相b为甲醇。梯度洗脱，梯度洗脱程序如下(％表示体积百分比)：
[0099]
时间流动相a流动相b0-10min90％10％10-20min0％100％20-30min90％10％45-53min88％12％
[0100]
流速为1ml/min；柱温30℃；检测波长为288nm；进样量为10ul；色谱柱为dikma platisil 5μm ods 250*4.6mm。
[0101]
(3)中药组合物对于血清肌酐和尿酸氮的影响
[0102]
采用日立7080自动生化分析仪(hitachi，日本)测定血清中肌酐含量，采用uv-2600紫外分光光度计(shimadzu，日本)测定血清中尿素氮的含量，根据制造商提供的说明书和仪器操作方法进行具体的操作。
[0103]
二、实验结果
[0104]
(1)中药组合物的降尿酸的结果如图1和下表1所示所示，
[0105]
表1不同组在第1～4周的血尿酸水平(mg/l)变化
[0106]
周正常组nc模型组hn实施例1实施例2实施例3苯溴马隆组bbr180.72
±
6.68164.53
±
25.72***157.38
±
15.05158.15
±
15.70154.50
±
13.99155.55
±
22.71289.20
±
4.03255.92
±
18.00***268.21
±
42.94269.25
±
34.38264.72
±
25.84260.18
±
27.81392.72
±
5.66213.04
±
7.38***175.79
±
27.50##175.36
±
27.61##179.06
±
19.21###192.66
±
21.78489.20
±
6.80258.31
±
21.72***191.13
±
43.71###196.57
±
48.83##197.02
±
39.07##204.73
±
13.02###
[0107]
注：与正常组动物比较：***p《0.001，有极其显著的统计学差异；与高尿酸血症模型组动物比较：###p《0.001，##p《0.01，有极其显著的统计学差异。
[0108]
结果表明，造模后一周，模型组与正常组相比血清尿酸水平显著升高(p《0.001)，说明高尿酸血症模型制造成功，连续给药第三周后给药组与模型组比较血清中尿酸水平开始下降(p《0.01，p《0.01，p《0.001)，连续给药四周后给药组与模型组相比血清中尿酸水平显著下降(p《0.001，p《0.01，p《0.01)，说明实施例1～3的中药组合物(450mg/kg)具有降尿
酸作用并且活性与苯溴马隆(10mg/kg)相当。
[0109]
(2)中药组合物的肾保护作用的结果如图2、图3、表2和表3所示，结果表明，造模后一周，模型组与正常组相比血清肌酐、尿素氮水平开始升高(p《0.01，p《0.001)，造模后第二周，模型组与正常组相比血清肌酐、尿素氮水平均显著升高(p《0.001，p《0.001)说明慢性高尿酸血症会引起肾脏损伤。连续给药，从第二周开始发现中药组合物组与模型组相比血清中肌酐、尿素氮水平显著下降，苯溴马隆组与模型组相比较无显著性差异，说明实施例1～3的中药组合物具有肾脏保护特点。但苯溴马隆不具备肾脏保护作用。
[0110]
表2不同组在第1～4周的血清肌酐水平(μmol/l)变化
[0111][0112][0113]
注：与正常组动物比较：***p《0.001，**p《0.01，有极其显著的统计学差异；与高尿酸血症模型组动物比较：##p《0.01，有极其显著的统计学差异，#p《0.05，有显著的统计学差异。
[0114]
表3不同组在第1～4周的血清尿素氮水平(mmol/l)变化
[0115]
周正常组nc模型组hn实施例1实施例2实施例3苯溴马隆组bbr17.38
±
0.989.44
±
1.16**10.46
±
1.3210.36
±
1.2610.42
±
1.089.61
±
1.5728.52
±
0.5513.12
±
1.59***10.36
±
1.36##10.51
±
1.31##10.53
±
1.06##11.90
±
0.6839.17
±
1.2813.57
±
1.01***11.59
±
2.1511.62
±
2.2311.19
±
1.50##13.45
±
1.37410.03
±
0.4214.82
±
0.75***13.70
±
0.30##13.92
±
0.5214.04
±
0.5314.31
±
0.88
[0116]
注：与正常组动物比较：***p《0.001，**p《0.01，有极其显著的统计学差异；与高尿酸血症模型组动物比较：##p《0.01，有极其显著的统计学差异。
[0117]
效果实施例2
[0118]
中药组合物与苯溴马隆联用减毒作用结果如下：
[0119]
通过体内动物实验证明，中药组合物和苯溴马隆联合应用，对于氧嗪酸钾和腺嘌呤所致的高尿酸血症肾病模型大鼠可以显著减少苯溴马隆所致的肝毒性。
[0120]
(1)肝损伤模型的建立及给药方式
[0121]
sd大鼠(采用的sd大鼠的厂家和饲养标准同效果实施例1)56只，随机分组，每组8只，分别为空白(nc)组，高尿酸血症肾病模型(hn)组，实施例1组(450mg/kg)，肝毒性模型(苯溴马隆50mg/kg)组，先给苯溴马隆(50mg/kg)后(间隔1小时)给实施例1(450mg/kg)组，
先给苯溴马隆(50mg/kg)后(间隔1小时)给实施例2(450mg/kg)组，以及先给苯溴马隆(50mg/kg)后(间隔1小时)给实施例3(450mg/kg)组。各组给药体积(两种药物体积之和)为0.1ml/10g。造模和给药方式中：正常组灌胃同等剂量0.5％cmc-na，其他组首先灌胃氧嗪酸钾和腺嘌呤制造高尿酸血症肾病模型，1小时后分别灌胃0.5％cmc-na(正常组)、0.5％cmc-na(hn模型组)、0.5％cmc-na(实施例1组)、苯溴马隆(肝毒性模型组)、苯溴马隆(苯溴马隆+实施例1组)、苯溴马隆(苯溴马隆+实施例2组)、苯溴马隆(苯溴马隆+实施例3组)，1小时后分别再次灌胃0.5％cmc-na(正常组)、0.5％cmc-na(hn模型组)、实施例1组合物(实施例1组)、0.5％cmc-na(肝毒性模型组)、实施例1组合物(苯溴马隆+实施例1组)、实施例2组合物(苯溴马隆+实施例2组)、实施例3组合物(苯溴马隆+实施例3组)。每天重复上述造模及给药操作。每隔7天(实验第7、14、21、28天)，最后一次灌胃给药后2小时眼眶采血。
[0122]
(2)联合用药对于血清丙氨酸氨基转移酶(alt)和门冬酸氨基转移酶(ast)水平的影响
[0123]
指标的测定采用：谷丙转氨酶(alt)测定试剂盒(货号：c009-1-1；赖氏法)，南京建成生物工程有限公司；谷草转氨酶(ast)测定试剂盒(货号：c010-2-1；微板法)，南京建成生物工程有限公司。
[0124]
表4实施例1～3中药组合物联合苯溴马隆对于血清ast水平(u/l)的影响
[0125][0126]
注：与正常组动物比较：***p《0.001，**p《0.01，有极其显著的统计学差异，*p《0.05，有显著的统计学差异；与肝损伤组(苯溴马隆给药组)动物比较：###p《0.01，##p《0.01，有极其显著的统计学差异，#p《0.05，有显著的统计学差异。
[0127]
表5实施例1～3中药组合物联合苯溴马隆对于血清alt水平(u/l)的影响
[0128][0129]
注：与正常组动物比较：***p《0.001，**p《0.01，有极其显著的统计学差异；与肝损伤组(苯溴马隆给药组)动物比较：###p《0.01，##p《0.01，有极其显著的统计学差异，#p《0.05，有显著的统计学差异。
[0130]
如图4、图5、表4和表5所示，苯溴马隆组血清ast和alt水平从第一周和第二周开始便显著高于正常组(p《0.05，p《0.01，p《0.001)。单独使用实施例1组合物大鼠ast、alt水平趋于正常(与正常组相比)。联合用药组均能够显著性抑制苯溴马隆引起的ast水平的升高，与苯溴马隆组差异比较有统计学意义(p《0.05，p《0.01或p《0.001)。从第一周联合用药组的实施例组合物便开始显示保肝作用，到第四周ast水平趋于正常。并且，联合用药组均能够显著性抑制苯溴马隆引起的alt水平的升高，与苯溴马隆组差异比较有统计学意义(p《0.05，p《0.01或p《0.001)。从第一周开始，联合用药组的实施例组合物便开始显示保肝作用。
[0131]
结果表明，中药组合物和苯溴马隆的联合用药可以降低苯溴马隆所导致的肝损伤。与肝损伤组(苯溴马隆给药组)动物比较：###p《0.01，##p《0.01，有极其显著的统计学差异，#p《0.05，有显著的统计学差异，反映出联合用药与苯溴马隆单独使用相比，能增强保肝效果。
[0132]
效果实施例3
[0133]
中药组合物与苯溴马隆联用增效作用结果如下：
[0134]
通过体内动物实验证明，中药组合物和苯溴马隆联合应用，与单独应用苯溴马隆相比，对于氧嗪酸钾和腺嘌呤所致的高尿酸血症肾病模型大鼠可以更显著增加降尿酸的药效。
[0135]
(1)增效作用实验设计
[0136]
中药组合物在慢性高尿酸血症肾病大鼠模型上的有效剂量为450mg/kg或900mg/kg。苯溴马隆的临床剂量为成人(按70kg体重计)每日50mg，折算成大鼠给药剂量为4.5mg/kg。
[0137]
sd大鼠64只，随机分组，每组8只，分别为空白(nc)组，高尿酸血症肾病模型(hn)
组，苯溴马隆组(4.5mg/kg，分两次给药)，实施例1(450mg/kg，分两次给药)组，先给苯溴马隆(2.25mg/kg)后(间隔1小时)给实施例1(225mg/kg)组，先给苯溴马隆(2.25mg/kg)后(间隔1小时)给实施例1(450mg/kg)组，先给苯溴马隆(2.25mg/kg)后(间隔1小时)给实施例2(225mg/kg)组，以及先给苯溴马隆(2.25mg/kg)后(间隔1小时)给实施例3(225mg/kg)组。各组给药体积(两种药物体积之和)为0.1ml/10g。造模和给药方式：正常组灌胃同等剂量0.5％cmc-na，其他组首先灌胃氧嗪酸钾和腺嘌呤制造高尿酸血症肾病模型，1小时后分别灌胃0.5％cmc-na(正常组)、0.5％cmc-na(hn模型组)、苯溴马隆2.25mg/kg(苯溴马隆4.5mg/kg组)、实施例1组合物225mg/kg(实施例1 450mg/kg组)、苯溴马隆2.25mg/kg(苯溴马隆2.25mg/kg+实施例1组合物225mg/kg组)、苯溴马隆2.25mg/kg(苯溴马隆2.25mg/kg+实施例1组合物450mg/kg组)、苯溴马隆2.25mg/kg(苯溴马隆2.25mg/kg+实施例2组合物225mg/kg组)、苯溴马隆2.25mg/kg(苯溴马隆2.25mg/kg+实施例3组合物225mg/kg组)，1小时后分别再次灌胃0.5％cmc-na(正常组)、0.5％cmc-na(hn模型组)、苯溴马隆2.25mg/kg(苯溴马隆4.5mg/kg组)、实施例1组合物225mg/kg(实施例1 450mg/kg组)、实施例1组合物225mg/kg(苯溴马隆2.25mg/kg+实施例1组合物225mg/kg组)、实施例1组合物450mg/kg(苯溴马隆2.25mg/kg+实施例1组合物450mg/kg组)、实施例2组合物225mg/kg(苯溴马隆2.25mg/kg+实施例2组合物225mg/kg组)、实施例3组合物225mg/kg(苯溴马隆2.25mg/kg+实施例3组合物225mg/kg组)。每天重复上述造模及给药操作。实验第7天和第14天最后一次灌胃给药后2小时眼眶采血。分离血清，测定尿酸水平。
[0138]
(2)联合用药对于血清尿酸水平的影响
[0139]
表6实施例1～3中药组合物联合苯溴马隆对于血清尿酸水平(mg/l)的影响
[0140]
[0141]
注：与正常组动物比较：***p《0.001；与高尿酸血症模型组动物比较：###p《0.01，##p《0.01，有极其显著的统计学差异，#p《0.05，有显著的统计学差异。
[0142]
如图6和表6所示，第一周开始模型组与空白组相比血清尿酸水平显著升高(p《0.001)，证明高尿酸血症模型造模成功；第一周，苯溴马隆(4.5mg/kg)未显示出药效。但联合给药组(苯溴马隆2.25mg/kg+中药组合物225mg/kg或450mg/kg)均显示出不同程度降尿酸趋势(但与模型组相比无统计学差异，p》0.05)。第二周，苯溴马隆(4.5mg/kg)显示出一定药效(与模型组相比，p＝0.069)。联合给药组(苯溴马隆2.25mg/kg+中药组合物225mg/kg或450mg/kg)均显示出显著的降尿酸效果(与模型组相比，p《0.01)，并且，联合给药组大鼠尿酸平均水平低于苯溴马隆单独给药组大鼠尿酸平均水平。第三周，苯溴马隆(4.5mg/kg)显示出显著药效(与模型组相比，p《0.05)。联合给药组(苯溴马隆2.25mg/kg+中药组合物225mg/kg或450mg/kg)均显示出显著的降尿酸效果(与模型组相比，p《0.05或p《0.001)，并且，联合给药组大鼠尿酸平均水平低于苯溴马隆单独给药组大鼠尿酸平均水平。因此，中药组合物具有增强苯溴马隆降尿酸活性的作用。联合用药可以在苯溴马隆剂量减半的情况仍然可以维持甚至更优的药效。
[0143]
此外根据b
ü
rgi公式(戴体俊,合并用药的定量分析,中国药理学通报,1998,14(5)；479-480.)：q＝e(
a/2
+
b/2
)/ea(或eb)，式中ea、eb分别为a、b单用之效应，且ea＝eb，e(
a/2
+
b/2
)为a、b各取半量合用之效应。q》1为增强，q＝1为相加，q《1为拮抗。本发明中，如图6所示，在第三周，苯溴马隆(4.5mg/kg)与中药组合物(450mg/kg)显示出相似药效(尿酸抑制率分别为41.3％和42.7％)，分别剂量减半的联合用药(苯溴马隆2.25mg/kg+中药组合物225mg/kg)药效显著(尿酸抑制率分别为52.2％、49.3％和50.3％)，所得q值(与苯溴马隆相比)分别为：1.3、1.2、1.2，所得q值(与中药组合物相比)分别为：1.2、1.2、1.2。q值均大于1，显示为增强(协同)作用。
[0144]
由上述结果可知，本发明中药组合物能够有效降低苯溴马隆所导致的肝损伤，并且增强苯溴马隆降尿酸活性。
[0145]
综上所述：本发明中药组合物能够有效治疗高尿酸血症，并且与苯溴马隆联用，可以增强降尿酸活性，同时可以降低使用苯溴马隆所致的肝损伤，为临床提供了一种新的选择。